一種測定土壤微生物生物量氮的方法

2023-06-12 18:17:26

專利名稱：：一種測定土壤微生物生物量氮的方法
技術領域：
：本發明涉及土壤中微生物生物量氮的測定，具體的說是一種改進土壤微生物生物量氮的測定方法。
背景技術：
：土壤微生物生物量是指土壤中體積小於5jamM0jamS活的微生物總量，其養分佔土壤中相應元素的比例很小，但在評價其對作物營養的作用時意義很大。因為它非常活躍並可迅速參與養分循環，既是養分循環過程的動力和進入土壤的有機物質的"轉化者"，又是土壤能量和養分特別是C、N、P、S等元素內部供應機制的"源"和"庫"(文獻l:JenkinsonDS，LaddJN，Microbialbiomassinsoil:Measurementandturnover,SoilBiochemistry,1981，(5):415-471)。微生物量氮是指活的微生物體內所含有的氮，不同土壤類型及生態環境條件下其變異很大，耕層土壤微生物量氮一般為30-60kg，ha—1(文獻2:WidmerP，BrookesPC，ParryLC.Microbialbiomassnitrogenmeasurementsinsoilscontaininglargeamountsofinorganicnitrogen.SoilBiologyandBiochemistry,1989，21(6):865—867)，在數量上低於或接近作物的吸氮量；並且周轉較快，每年通過微生物周轉的氮是土壤微生物量氮的l.5倍以上。^見，大部分礦化的氮主要來自土壤微生物量氮，因此，微生物量氮對土壤氮素供應和循環具有重要的意義(文獻3:MacartyGW，MeisingerJJ，JenniskensFMM.Relationshipsbetweentotal—N，biomass—Nandactive-NinsoilunderdifferenttillageandNfertilizertreatments.SoilBiologyandBiochemistry,1995，27(10):1245—1250)。現階國內外測定土壤微生物量氮的方法多採用氯仿燻蒸浸提法，主要步驟包括①燻蒸-浸提取新鮮土壤30g(相當於幹土25g左右)於小燒杯中，放入裝有30ml氯仿(帶沸石)、30mlNaOH和溼潤濾紙的真空乾燥器中，密閉抽氣至氯仿沸騰3min，關閉閥門。在25"C黑暗條件下培養24h，打開乾燥器檢驗是否漏氣，若不漏氣，取出氯仿和NaOH，用真空泵反覆抽氣，直到土壤聞不到氯仿氣味為止。另作不燻蒸作為對照。將燻蒸和不燻蒸土樣用100ml硫酸鉀溶液振蕩浸提30min，過濾。②測定吸取浸提液30.0ml於消煮管中，加10ml硫酸鉻鉀溶液和0.3g鋅粉，充分混勻，室溫下放置至少2h，再加入0.6ml硫酸銅溶液和8ml濃硫酸。緩慢加熱(150°C)約2h至消煮管中水分全部蒸發掉，然後高溫(硫酸發煙)消煮3h。待溶液完全冷卻後，將消煮管接到定氮蒸餾器上，向蒸餾管中加入NaOH溶液，蒸餾，用標準稀HC1溶液滴定硼酸吸收液。(文獻4:魯如坤，土壤農業化學分析方法，北京中國農業科技出版社，2000:228-233)。使用該方法對土壤微生物量氮進行測定有以下缺點①該方法使用硫酸鉻鉀作還原劑不可取。硫酸鉻鉀中的Cr"誘發是癌症的因素之一，該類藥品在歐洲國家明令禁止施用；土壤中的微生物量氮絕大部分為有機氮，有機氮不需要還原劑就可以被消解成NH4+-N。因此說，該方法使用硫酸鉻鉀是多此一舉。②方法本身耗時K。就拿蒸水歩驟說，將溫度調至15(TC，由於消煮管內壁光滑，一定產牛爆沸現象。若阻止爆沸現象的發生，則有兩種途徑降低溫度或放沸石。降低溫度至11(TC，則需至少2天2夜才能將水蒸乾；若放沸石，則會在轉移步驟中引起麻煩。③消煮後的產物為固態，不容易全部轉移。消煮結束冷卻後，消煮管中的固態產物需要一點一點刮出，因此在向蒸餾瓶中轉移的過程中會存在損失。另外，為了加快試驗的進程，加入的沸石會凝固在試管底部的中間，這又加劇了轉移產物的難度。
發明內容本發明的目的是提供一種重複性好，重現性高，並且簡單易行的測定土壤中微生物生物量氮的方法。為實現上述目的，本發明釆用的技術方案如卜一種測定土壤微生物生物量氮的方法，1)採用燻蒸-浸提的方法對土樣進行處理以不燻蒸土樣為對照，將燻蒸和不燻蒸土樣分別用4倍重量體積的0.5M硫酸鉀溶液振蕩浸提，過濾，得浸提液，分別進行以下步驟2)-4)中的操作；2)向消煮管中一次加入浸提液5.0ml，混合加速劑l-3g，以及濃硫酸8-10ml，搖勻；3)採用梯度升溫的方式對上述溶液進行加熱溶液預先加熱至lOO-ll(TC，開始梯度升溫，依次使溶液於9-10min內升溫至120-130°C、10-12min內升溫至140-]55°C、11-13min內升溫至160-170°C、12-14min內升溫至180-195°C、13-15min內升溫至200-220°C、14-17min內升溫至205-240°C、16-19min內升溫至240-260°C、45-65min內升溫至340-380°C，恆溫3-4h至溶液澄清，冷卻；4)將消煮管中的溶液倒入蒸餾瓶中，用蒸餾水洗滌消煮管2-3次，每次蒸餾水用量為10-20ml，同時加入70-100ml10MNaOH溶液進行蒸餾，採用硼酸接收，採用已知濃度的標準鹽酸溶液進行滴定，確定所消耗的鹽酸溶液的用量；5)配製乙醯苯胺標準溶液取乙醯苯胺試劑1.9296克，加二次蒸餾水溶解，定容至1000ml容量瓶中，此溶液含有有機氮200mg/1，以此溶液為母液進行逐級稀釋至0-40倍；選取稀釋後任意濃度的乙醯苯胺溶液5.0ml進行以下歩驟2)-4)中的操作；以蒸餾水5.0ml、混合加速劑l-3g、濃硫酸8-10ml配製的溶液為對照組，將對照組同樣進行以下步驟2)-4)中的操作；按如下過程對試驗結果的計算a.計算標準物質的回收率回收率％=~^^^^——^-^-x100n標準物質x5其中V^—滴定對照組時所消耗的HC1溶液體積，V—滴定乙醯苯胺溶液時消耗的HC1溶液體積，n標準物質一乙醯苯胺的質量濃度，5—吸取乙醯苯胺溶液的體積。b.有機氮含量的計算(H)xCHclxl4xtSxl000W(JN)=-,,一-回收率。/。xm其中Vws—滴定燻蒸樣品時所消耗的HC1溶液體積，V—滴定未燻蒸樣品時所消耗的HC1溶液體積，tS—樣品的稀釋倍數(即總浸提液與步驟2)-4)中所採用的浸提液5.0ml倍數比)，m—烘乾土質量(通常土樣中的重量含水量為83-85%);C.微生物生物量氮的計算其中Ew—薰蒸土樣有機氮量與未薰蒸土樣有機氮之差，K^一氯仿薰蒸殺死微生物體中的氮被浸提出來的比例，通常取0.45。採用燻蒸-浸提的方法(參見文獻4)對土樣進行處理，具體過程為取土壤25-30g，放入帶沸石的裝有25-40ml氯仿、20-40mlNaOH和溼潤濾紙的真空乾燥器中，密閉抽氣至氯仿沸騰3-5min，關閉閥門；在室溫黑暗條件下培養24-48h，打開乾燥器檢驗是否漏氣，若不漏氣，取出氯仿和NaOH，用真空泵反覆抽氣，直到土壤聞不到氯仿氣味為止；另作不燻蒸作為對照；將燻蒸和不燻蒸土樣分別用100ml0.5M硫酸鉀溶液振蕩浸提30-60min，過濾，得浸提液。所述加速劑由K2S04、CuSO^nSe組成，它們的重量比為90-100:9-10:1，歩驟4)中所採用的硼酸重量濃度為1%，用量為10-20ml。使用本發明改進方法對土壤微生物生物量氮進行測定，有如下優點1.該方法安全、環保，有利於生態環境的可持續發展。原方法在消煮過程中使用KCr(S04)2作還原劑，KCr(S04)2中的Cr"誘發是癌症的因素之一，該類藥品在歐洲國家明令禁止施用，可想而知，大劑量的傾倒會影響環境威脅人類。而且，若C一+在消煮過程中被氧化成C一+，其對環境的影響會更大。況且，土壤中的微生物量氮絕大部分為有機氮，有機氮不需要還原劑就可以被消解成皿4+^。本發明使用K2S04、CuS04和Se粉作混合加速劑，這三種藥品毒性較小或沒有，對環境的脅迫較KCr(S04)2小很多。2.該方法省時。原有方法的蒸水步驟需要耗費很長時間，若加入沸石，又會對轉移步驟產生影響，二者很難權衡。本發明直接採用吸取浸體液5ml進行消煮，省去蒸水步驟，直接向浸提液中加入催化劑和濃硫酸後消煮，省時省事。3.該方法精密度高，準確性好。原有方法消煮產物為紅色沉澱，很難全部轉移至蒸餾瓶中，若有沸石則更難轉移。本發明方法的蒸餾產物為透明澄清的液體，可以全部轉移，消煮管也易清洗。對標準樣品的測定結果顯示，本發明的方法測定結果平行性更好，準確性也令人滿意。具體實施方式實施例1對比原有的方法和改進的方法測定乙醯苯胺標準溶液中的氮含量。參照文獻4，使用本發明改進的方法對進口乙醯苯胺標準溶液中的氮含量進行測定。向消煮管中一次加入浸提液5.0ml，混合加速劑3gJ加速劑質量組成為K2SO4:CuSO4:Se二90:9:l)，以及濃硫酸8ml，搖勻；採用梯度升溫的方式對溶液進行加熱至34(TC，恆溫，3h後，冷卻；將消煮管中的溶液倒入蒸餾瓶中，用蒸餾水洗滌消煮管2-3次，同時加入NaOH溶液進行蒸鎦，硼酸接收，標準鹽酸溶液進行滴定。具體過程如下1)配製乙醯苯胺標準溶液取德國進口乙醯苯胺試劑1.9296克，加二次蒸餾水溶解，定容至1000ml容量瓶中，此溶液含有有機氮200mg/1。將該儲備液按40及8倍數稀釋，得到5及25mg/1濃度的溶液。以蒸餾水5.0ml、混合加速劑3g、濃硫酸8ml配製的溶液為對照組；2)取3根消煮管，消煮管中分別加入上述溶液5.0ml，混合加速劑(質量比為K2SO4:CuSO4:Se二90:9:l)3g，以及濃硫酸8ml，搖勻；3)採用梯度升溫的方式對上述溶液進行加熱溶液預先加熱至100-ll(TC，開始梯度升溫，依次使溶液於9-10min內升溫至120-130°C、10-12min內升溫至140-155°C、ll-13min內升溫至160-170°C、12-14min內升溫至180-195°C、13-15min內升溫至200-220。C、14-17min內升溫至205-240°C、16隱19min內升溫至240-260。C、45-65min內升溫至340-380°C，恆溫3-4h至溶液澄清，冷卻至室溫；4)將消煮管中的溶液倒入蒸餾瓶中，用蒸餾水洗滌消一煮管2次，每次蒸餾水用量為20ml，同時加入100ml10MNaOH溶液進行蒸餾，用10ml重量濃度為1%硼酸接收，採用0.05M的標準鹽酸溶液進行滴定，確定所消耗的鹽酸溶液的用量；本方法的原理如下1)乙醯苯胺在消煮的過程中轉變成銨態氮C8//9iW^^M/4+2)銨態氮在鹼性條件下轉變成氨氣A^4+^~>AW3t試驗結果的計算回收率％=(、灘誠—v加)xc肥X14X1000x!00n標準物質x5乙醯苯胺標準溶液中氮的含量為回收率。/。xn物質；對比例以文獻4(魯如坤，土壤農業化學分析方法，北京中國農業科技出版社，2000:228-233)的原方法對同樣的乙醯苯胺標準溶液進行測定。對比原方法和改進方法對乙醯苯胺標準溶液中的氮進行測定，測定的乙醯苯胺標準溶液中氮的含量，結果參見表1所示。由結果可以看出，使用原方法的測定結果既不穩定也不準確，而改進方法靈敏度高準確性也好。表1原方法與改進方法測定乙醯苯胺標準溶液中的氮結果對比氮濃度(5mg/1)氮濃度(25mg/l)原方法編號改進方法原方法編號改進方法4.4714.9523.27524.564.3224.9123.13625.124.3435.0323.47724.834.2645.0224.15824.94編號l-8分別為實驗的組數;注使用原方法和改進的方法測定乙醯苯胺中氮含量的差異源於每次加熱的方式不盡相同編號l:從IO(TC時開始梯度升溫，加熱10min升溫至120°C，加熱1lmin升溫至140。C，加熱12min升溫至160°C，加熱13min升溫至180°C，加熱15min升溫至200°C，加熱14min升溫至225°C，加熱16min升溫至250°C，加熱60min升溫至34(TC，恆溫，3h後，冷卻；編號2:從105。C時開始梯度升溫，加熱9min升溫至120°C，加熱llmin升溫至14(TC，加熱12min升溫至160°C，加熱13min升溫至180°C，加熱15min升溫至215'C，加熱14min升溫至225°C，加熱16min升溫至250°C，加熱60min升溫至340。C，恆溫，3h後，冷卻；編號3:從110°C時開始梯度升溫，加熱10min升溫至130°C，加熱1lmin升溫至14(TC，加熱12min升溫至160°C，加熱13min升溫至180°C，加熱14min升溫至21(TC，加熱14min升溫至225°C，加熱17min升溫至255°C，加熱57min升溫至34(TC，恆溫，3h後，冷卻；編號4:從IO(TC時開始梯度升溫，加熱10min升溫至12(TC，加熱12min升溫至15(TC，加熱13min升溫至170°C，加熱13min升溫至180°C，加熱14min升溫至210°C，加熱14min升溫至225°C，加熱16min升溫至250°C，加熱60min升溫至34(TC，恆溫，3h後，冷卻；編號5:從105。C時開始梯度升溫，加熱9min升溫至120°C，加熱llmin升溫至140。C，加熱12min升溫至160°C，加熱13min升溫至180°C，加熱14min升溫至210°C，加熱17min升溫至240°C，加熱16min升溫至260°C，加熱50min升溫至340。C，恆溫，3h後，冷卻；編號6:從IO(TC時開始梯度升溫，加熱10min升溫至12(TC，加熱llmin升溫至14(TC;加熱12min升溫至160°C，加熱13min升溫至180°C，加熱13min升溫至200。C，加熱15min升溫至220°C，加熱16min升溫至250。C，加熱60min升溫至34(TC，恆溫，3h後，冷卻；編號7:從IO(TC時開始梯度升溫，加熱llmin升溫至125。C，加熱10min升溫至140。C，加熱12min升溫至160°C，加熱13min升溫至180°C，加熱14min升溫至21(TC，加熱14min升溫至225°C，加熱17min升溫至255°C，加熱57min升溫至34(TC，恆溫，3h後，冷卻；編號8:從105。C時開始梯度升溫，加熱llmin升溫至130。C，加熱llmin升溫至140。C，加熱12min升溫至160°C，加熱13min升溫至180°C，加熱14min升溫至220°C，加熱14min升溫至225°C，加熱16min升溫至250°C，加熱60min升溫至340。C，恆溫，3h後，冷卻。實施例2使用改進的方法測定土壤中微生物生物量氮的含量。具體實施過程試驗步驟為1)燻蒸-浸提取新鮮土壤30g(相當於幹土25g左右)於小燒杯中，放入裝有30ml氯仿(帶沸石)、30mlNaOH和溼潤濾紙的真空乾燥器中，密閉抽氣至氯仿沸騰3min，關閉閥門。在25'C黑暗條件下培養24h，打開乾燥器檢驗是否漏氣，若不漏氣，取出氯仿和NaOH，用真空泵反覆抽氣，直到土壤聞不到氯仿氣味為止。另作不燻蒸作為對照。將燻蒸和不燻蒸土樣用100ml硫酸鉀溶液振蕩浸提30min，過濾；2)領澱向消煮管中依次加入浸提液5.0ml，混合加速劑(質量比為K2SO4:CuSO4:Se=90:9:l)3g，以及濃硫酸8ml，搖勻；3)採用梯度升溫的方式對溶液進行加熱，即從iocrc時開始梯度升溫，加熱10min升溫至120°C，加熱1lmin升溫至140°C，加熱12min升溫至160°C，加熱14min升溫至180°C，加熱15min升溫至200°C，加熱16min升溫至220。C，加熱17min升溫至26(TC，加熱50min升溫至340°C，恆溫，3h後，冷卻至室溫；4)將消煮管中的溶液倒入蒸餾瓶中，用蒸餾水洗滌消一煮管2次，每次蒸餾水用量為20ml，同時加入100ml10MNaOH溶液進行蒸餾，用10ml重量濃度為1%硼酸接收，採用0.05M的標準鹽酸溶液進行滴定，確定所消耗的鹽酸溶液的用量；試驗結果的計算1)計算標準物質的回收率回收車。—(V標準物質—V空fl)xC肥"4x1000^00n標準物質x52)有機氮含量的計算=(Vn-V絲蒸)xCHdXl4xtsx1000回收率y。xm3)微生物生物量氮的計算co(N)=￡N/&使用改進的化學分析方法與儀器分析方法測定土壤中微生物生物量氮含量結果如表2所示，儀器分析過程採用總有機碳自動分析儀進行測定，經t-檢驗比較，兩組結果平均值之間不存在顯著性差異，說明以所改進的方法測定土壤中微生物生物量氮結果準確可靠。表2化學分析方法和儀器分析方法測定土壤中微生物量氮結果比較(n=3)tableseeoriginaldocumentpage10權利要求1.一種測定土壤微生物生物量氮的方法，其特徵在於1)採用燻蒸-浸提的方法對土樣進行處理以不燻蒸土樣為對照，將燻蒸和不燻蒸土樣分別用4倍重量體積的0.5M硫酸鉀溶液振蕩浸提，過濾，得浸提液，分別進行以下步驟2)-4)中的操作；2)向消煮管中一次加入浸提液5.0ml，混合加速劑1-3g，以及濃硫酸8-10ml，搖勻；3)採用梯度升溫的方式對上述溶液進行加熱溶液預先加熱至100-110℃，開始梯度升溫，依次使溶液於9-10min內升溫至120-130℃、10-12min內升溫至140-155℃、11-13min內升溫至160-170℃、12-14min內升溫至180-195℃、13-15min內升溫至200-220℃、14-17min內升溫至205-240℃、16-19min內升溫至240-260℃、45-65min內升溫至340-380℃，恆溫3-4h後，冷卻；4)將消煮管中的溶液倒入蒸餾瓶中，用蒸餾水洗滌消煮管2-3次，每次蒸餾水用量為10-20ml，同時加入70-100ml10MNaOH溶液進行蒸餾，採用硼酸接收，採用已知濃度的標準鹽酸溶液進行滴定，確定所消耗的鹽酸溶液的用量；5)配製乙醯苯胺標準溶液取乙醯苯胺試劑1.9296克，加二次蒸餾水溶解，定容至1000ml容量瓶中，此溶液含有有機氮200mg/l，以此溶液為母液進行逐級稀釋至0-40倍；選取稀釋後任意濃度的乙醯苯胺溶液5.0ml進行以下步驟2)-4)中的操作；以蒸餾水5.0ml、混合加速劑1-3g、濃硫酸8-10ml配製的溶液為對照組，將對照組同樣進行以下步驟2)-4)中的操作；按如下過程對試驗結果的計算a.計算標準物質的回收率其中V空白—滴定對照組時所消耗的HCl溶液體積，V標準物質—滴定乙醯苯胺溶液時消耗的HCl溶液體積，n標準物質—乙醯苯胺的質量濃度，5—吸取乙醯苯胺溶液的體積。b.有機氮含量的計算其中V燻蒸—滴定燻蒸樣品時所消耗的HCl溶液體積，V未燻蒸—滴定未燻蒸樣品時所消耗的HCl溶液體積，ts—樣品的稀釋倍數，m—烘乾土質量；c.微生物生物量氮的計算ω(N)＝EN/KEN其中EN—薰蒸土樣有機氮量與未薰蒸土樣有機氮之差，KEN—薰蒸殺死微生物體中的氮被浸提出來的比例，通常取0.45。2.按照權利要求1所述的方法，其特徵在於所述採用燻蒸-浸提的方法對土樣進行處理過程為取土壤25-30g，放入帶沸石的裝有25-40ml氯仿、20-40mlNaOH和溼潤濾紙的真空乾燥器中，密閉抽氣至氯仿沸騰3-5min，關閉閥門；在室溫黑暗條件下培養24-48h，打開乾燥器檢驗是否漏氣，若不漏氣，取出氯仿和NaOH，用真空泵反覆抽氣，直到土壤聞不到氯仿氣味為止；另作不燻蒸作為對照；將燻蒸和不燻蒸土樣分別用100ml0.5M硫酸鉀溶液振蕩浸提30-60min，過濾，得浸提液。3.按照權利要求1所述的方法，其特徵在於所述加速劑由K2S04、CuS04和Se組成，它們的重量比為90-100:9-10:1。4.按照權利要求1所述的方法，其特徵在於所述步驟4)中所採用的硼酸重量濃度為1%，用量為10-20ml。5.按照權利要求1所述的方法，其特徵在於所述步驟3)中溶液最終冷卻至室溫。全文摘要本發明涉及一種測定土壤微生物生物量氮的方法，採用燻蒸-浸提的方法對土樣進行處理以不燻蒸土樣為對照，將燻蒸和不燻蒸土樣分別用4倍重量體積的0.5M硫酸鉀溶液振蕩浸提，過濾，得浸提液；向消煮管中依次加入5ml浸提液、3g混合加速劑、以及8ml濃硫酸，搖勻。緩慢加熱至硫酸發煙，高溫消煮3h至溶液澄清，冷卻。將消煮產物無損失的轉移至蒸餾瓶中，同時加入NaOH溶液進行蒸餾，硼酸接收，標準鹽酸溶液進行滴定。本發明方法重複性好，重現性高，簡單易行。文檔編號G01N33/50GK101419226SQ20071015766公開日2009年4月29日申請日期2007年10月24日優先權日2007年10月24日發明者樺周,宇萬太,璐張,強馬申請人:中國科學院瀋陽應用生態研究所