一種基於核酸的生物邏輯門與邏輯電路的構建方法與流程
2023-06-13 00:21:06
本發明涉及計算生物學的研究領域，具體為一種基於核酸的生物邏輯門與邏輯電路的構建方法。
背景技術：
計算生物學(computationalbiology)是生物學的一個分支。根據美國國家衛生研究所(nih)的定義，它是指開發和應用數據分析及理論的方法、數學建模和計算機仿真技術，用於生物學、行為學和社會群體系統的研究的一門學科。英國著名的數學家和邏輯學家，計算機邏輯的奠基者阿蘭·麥席森·圖靈(alanmathisonturing，1912-1957)，曾指出，向日葵螺旋數目是一個fibonacci數字，而且動物皮膚的形成模式也可以被描述為一種反應擴散模型(reactiondiffusionmodel)，當時圖靈缺乏數據以及計算能力建立這一模型。隨著科技的發展，今天我們可以獲取大量的數據，計算能力也大幅度提高，因此可以從新的觀點來分析生命的機制。
如果將生命體看成一架極其精密的機器，那麼每個生命活動，諸如蛋白質表達、細胞間的信號傳送，都可以通過計算機的模擬計算來重現。計算生物學使得傳統生命研究走向定量化、精確化，而且可以在系統層面上進行觀察研究，更能夠深入的剖析在機器和生物機體之間是否存在根本的差異的問題。
目前英國倫敦帝國理工學院的研究人員曾利用腸道細菌和dna片段成功地構建出了可用於處理信息的「生物邏輯門」，但是由於需要細菌媒介以及外界酶參與需求等因素的影響導致其實際應用性不強。
邏輯門是計算機的基礎，它是一種對輸入的信息進行邏輯運算，然後輸出信息的裝置。通過對不同的邏輯門進行各種組合，就可以搭建出複雜的計算機電路。本專利中通過我們所特殊設計的核酸序列結構可以在不需要外界催化劑、酶與細菌等因素的參與下，高效快捷的複製出當前計算機所用電路邏輯門相似的生物邏輯門，並成功的將其串聯形成邏輯電路，這一成果能夠推動研發出新一代的生物計算機，並將其推廣到生物信息處理應用中去。
技術實現要素：
本發明所解決的技術問題在於提供一種基於核酸的生物邏輯門與邏輯電路的構建方法，以解決上述背景技術中的缺點。
本發明所解決的技術問題採用以下技術方案來實現：一種基於核酸的生物邏輯門與邏輯電路的構建方法，包括以下步驟：
(a)利用提取試劑盒從腫瘤細胞中提取出具有標誌性作用的micro-rna；micro-rna為mir-21、mir-182、mir-195。
(b)將構成邏輯門的底鏈核酸與表面羧基修飾的磁珠混合，使用濃度為0.2mol/l的nhs將底鏈核酸上修飾的氨基進行活化，使濃度為用0.8mol/l的edc使磁珠表面上修飾的羧基進行活化，edc與nhs兩者共同作用，促進羧基與氨基間縮合反應的進行,通過縮合反應，利用肽鍵將兩者連結在一起；所述的nhs(n-羥基琥珀醯亞胺)使用濃度為0.2mol/l，edc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽)使用濃度為0.8mol/l，其所述的nhs(n-羥基琥珀醯亞胺)使用濃度為0.2mol/l，edc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽)使用濃度為0.8mol/l，其所述的反應條件為edc常溫活化羧基修飾磁珠30分鐘後，加入底鏈核酸37℃搖床振蕩反應12小時。
(c)利用磁力架將溶液中未連結的底鏈核酸與磁珠進行分離，反覆清洗三次後加入信號鏈，利用鹼基的互補作用使信號鏈與底鏈結合，形成運算模塊，同時利用磁性分離技術將未結合的信號鏈進行分離，使用緩衝液反覆清洗三次待用；所採用的底鏈和信號鏈的比例為1:2，反應條件為37℃下振蕩反應1小時。
(d)加入輸入鏈micro-rna，在反應溫度為37℃下反應2小時，反應使用的緩衝液為ph＝7.5、濃度為0.8mol/l的tris緩衝液；反應過程中，由於輸入鏈與底鏈的鹼基互補配對數要大於信號鏈與底鏈的鹼基互補配對數，便可以利用鏈取代技術實現輸入鏈micro-rna對信號鏈的取代，之後利用磁性分離技術將取代下來的信號鏈與運算模塊分離，並使用緩衝液反覆清洗三次待用；micro-rna量與與運算模塊的體積比為2:1。
(e)在一定的反應條件下，將清洗好的信號鏈與hemin混合，在hepes緩衝體系下於95℃下恆溫振蕩5min後緩慢冷卻至室溫，隨後置於37℃的搖床中振蕩反應1小時，使其形成具有催化作用的g-四聯體結構；之後儲存於25℃環境下待用；所採用的hemin濃度為7x10-7mol/l且與hepes緩衝液體積比為1:12。
(f)將形成的g-四聯體結構加入abts-h2o2體系中去，其反應環境為ph＝7.5濃度為0.8mol/l的tris緩衝體系，加入比色皿中，檢測樣品在特定時間內，在414nm波長下的吸收情況，並對應邏輯運算中的真與假；g-四聯體、h2o2、abts的用量體積為1:2:2，其中h2o2和abts的用量均為2mmol/l。
(g)將所構建的的每一個獨立的邏輯門串聯組合形成邏輯電路，電路組合方式為yes門與or門串聯後並聯and門。
以經過特殊設計的核酸序列為基礎，通過鏈取代與磁性分離技術，實現信號的輸入/運算和輸出信號鏈的分離，之後利用游離信號鏈在一定實驗條件下，形成具有催化作用的g-四鏈體結構，催化h2o2對abts的氧化反應，使之生成在414nm波長下具有特徵吸收的abts+，通過對其前後紫外吸收情況的檢測分析即可得出輸出信號的真或假(tureorfalse)對應計算機二進位中的0或1。在此基礎之上，我們進一步明確了最佳反應條件，此方法運算效率高，抗幹擾性強，就有廣泛的應用前景。
附圖說明
附圖1為發明設計過程原理圖。從細胞中提取的micro-rna作為輸入信號源，經過運算模塊的運算，最後以特定時間內吸光度變化的形式進行輸出；
附圖2為yes門的過程原理，實驗數據、布爾邏輯表以及可視化的輸出結果；
附圖3為and門的過程原理，實驗數據、布爾邏輯表以及可視化的輸出結果；
附圖4為or門的過程原理，實驗數據、布爾邏輯表以及可視化的輸出結果；
附圖5為組合電路的過程原理，實驗數據、布爾邏輯表以及可視化的輸出結果；
附圖6為鹼基錯配圖，所構建的邏輯門對特定輸入micro-rna有良好的選擇性。
具體實施方式
為了使本發明實現的技術手段、創作特徵、達成目的與功效易於明白了解，下面結合具體圖示，進一步闡述本發明。
一種基於核酸的生物邏輯門與邏輯電路的構建方法，其主要的技術手段為兩個部分：
(一)通過設計核酸鏈結構，利用輸入鏈與底鏈的鹼基互補配對數要大於信號鏈與底鏈的鹼基互補配對數的方法，來實現鏈取代技術；
(二)使用edc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽)與nhs(n-羥基琥珀醯亞胺)來活化氨基修飾的核酸與表面羧基修飾的磁珠，促進羧基與氨基的縮合反應，使磁珠與底鏈連接在一起，利用磁珠與強磁鐵間的磁力作用，實現磁性分離的目的；
邏輯門的構建整體分為提取、運算、輸出三個部分，首先我們使用分離試劑盒對hela細胞中的microrna進行了提取，之後將其作為輸入信號進入邏輯運算模塊，輸出結果利用hemin與g-四聯體形成的具有催化作用的dna模擬酶結構，來催化h2o2對顯色劑abts的氧化，隨著氧化產物abts+的增多，溶液414nm波長下吸光度亦增強，進而實現信號的輸出與microrna含量的檢測。
本發明中的底鏈是指與表面羧基修飾的磁珠(具有磁性的微小粒子)，通過羧基與氨基發生縮合反應來連結的核酸序列，輸入鏈是指mir-21、mir-182、mir-195四種腫瘤細胞中可以作為標誌物的microrna，信號鏈是指被輸入鏈所競爭下來的，富含g鹼基，可以形成g-四鏈體結構的核酸序列。
本發明所提供的方法包括以下步驟：
1)利用提取試劑盒從腫瘤細胞中提取出具有標誌性作用的micro-rna。
首先使用試劑盒提供的裂解液將腫瘤細胞裂解，之後使用試劑盒提供的分離柱進行對micro-rna的富集與分離，其原理是基於micro-rna的poly(a)粘性末端與分離柱的內濾網纖維的粘附作用，之後使用洗脫液進行洗脫。
2)將構成邏輯門的底鏈核酸與表面羧基修飾的磁珠混合，使用濃度為0.2mol/l的nhs將底鏈核酸上修飾的氨基進行活化，使濃度為用0.8mol/l的edc使磁珠上修飾的羧基進行活化，edc與nhs兩者共同作用，促進所以與氨基間縮合反應的進行,通過縮合反應，利用肽鍵將兩者連結在一起；所述的方法，其所述的nhs(n-羥基琥珀醯亞胺)最佳使用濃度為0.2mol/l，edc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽)最佳使用濃度為0.8mol/l。
3)利用磁力架將溶液中未連結的底鏈核酸與磁珠進行分離，反覆清洗三次後加入信號鏈，利用鹼基的互補作用使信號鏈與底鏈結合，形成運算模塊，同時利用磁性分離技術將未結合的信號鏈進行分離，保留由於磁力作用聚集在離心管底部的運算模塊，並使用緩衝液反覆清洗三次待用；
4)加入輸入鏈micro-rna，在反應溫度為37℃下反應2小時，反應使用的緩衝液為ph＝7.5、濃度為0.8mol/l的tris緩衝液；反應過程中，由於輸入鏈與底鏈的鹼基互補配對數要大於信號鏈與底鏈的鹼基互補配對數，便可以利用鏈取代技術實現輸入鏈micro-rna對信號鏈的取代，之後利用磁性分離技術將取代下來的信號鏈與運算模塊分離，運算模塊由於底鏈與磁珠相連，將會和磁力架上的磁鐵由於磁力作用吸附在一起，信號鏈則游離於溶液中，取上清液到新的離心管中，並使用緩衝液反覆磁分離清洗三次待用；
5)將清洗好的信號鏈與hemin混合，在hepes緩衝體系下於95℃下恆溫振蕩5min後緩慢冷卻至室溫，隨後置於37℃的搖床中振蕩反應1小時，使其形成具有催化作用的g-四聯體結構，之後儲存於25℃環境下待用；
6)將形成的g-四聯體結構加入abts-h2o2體系中去，其反應環境為ph＝7.5濃度為0.8mol/l的tris緩衝體系，加入比色皿中，檢測樣品在特定時間內，在414nm波長下的吸收情況，並對應邏輯運算中的真與假；
7)將所構建的的每一個獨立的邏輯門串聯組合形成邏輯電路。
實施例：yes門的構建
一、使用試劑盒對腫瘤細胞中的micro-rna進行提取，並將其作為信號輸入鏈。
二、運算模塊的構建與運算。
(1)運算模塊底鏈的建立
運算模塊底鏈(s-mbs)由底鏈核酸序列(s)與磁珠(mbs)連接而成，其製備方法為將20μl(10-6m)的dna加入已用200μledc(0.8m)活化30分鐘的羧基修飾磁珠中，再加入200μlnhs(0.2m)，在37℃下反應12小時，之後利用磁力架進行磁性分離，去除上層未連結磁珠的含有底鏈核酸序列的清液，保留吸附的磁性成分，使用ph＝7.5的tris緩衝液反覆洗滌3次以備後續使用。
(2)運算模塊信號鏈的加入。
取10μl洗滌後的運算模塊底鏈，向其中加入20μl的信號鏈(signal)，然後在37℃蕩床條件下反應1小時，利用鹼基的配對效應使之結合在一起，之後利用磁力架進行磁性分離，去除上層未與運算模塊底鏈結合的信號鏈的清液，所保留的磁性吸附成分即是運算模塊(signal-s-mbs)，使用ph＝7.5的tris緩衝液反覆洗滌3次以備後續使用。
三、邏輯運算。
(1)加入輸入鏈進行運算。
取10μl洗滌淨的運算模塊，向其中加入20μl提取的micro-rna，在37℃蕩床條件下反應2小時，利用鏈取代技術使輸入鏈將信號鏈從底鏈上取代下來，之後利用磁力架進行磁性分離，去除下層磁性成分，保留含有游離信號鏈的上清液，使用ph＝7.5的tris緩衝液反覆洗滌3次以備後續使用。
四、信號輸出。
(1)g-四聯體結構的形成。
取10μl清洗後的信號鏈，加入250μl的tris緩衝液，在水浴箱95℃下恆溫5min後,取出冷卻至室溫，加入20μl7x10-7m的hemin與230μl的hepes緩衝液，在37℃蕩床條件下反應1小時後儲存於25℃備用。
(2)414nm吸收情況的檢測
向比色皿中依次加入100μlg-四聯體和200μlh2o2(2mm)與200μlabts(2mm),最後加入tris緩衝液定容至2ml,後檢測30分鐘內的波長吸收情況，並對比與未輸入信號鏈空白組終值，高於其10％，即可認定為結果為真(1)，反之為假(0)。
以下為本技術中所涉及的核酸序列
dnasequence(5′-3′)
yes門底鏈
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or門底鏈
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and門底鏈
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yes門信號鏈
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or門信號鏈1
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or門信號鏈2
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and門信號鏈
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組合電路yes門底鏈
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組合電路and門底鏈
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組合電路or門底鏈
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組合電路yes門信號鏈
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組合電路and門信號鏈
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組合電路or門信號鏈1
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組合電路or門信號鏈2
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以上顯示和描述了本發明的基本原理和主要特徵及本發明的優點，本行業的技術人員應該了解，本發明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發明的原理，在不脫離本發明精神和範圍的前提下，本發明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發明範圍內，本發明要求保護範圍由所附的權利要求書及其等效物界定。
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青島科技大學
一種基於核酸的生物邏輯門與邏輯電路的構建方法
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