新構建的l－天門冬醯胺酶工程菌及其發酵培養的製作方法
2023-06-12 17:40:41 2
專利名稱：新構建的l－天門冬醯胺酶工程菌及其發酵培養的製作方法
技術領域：
本發明是關於新構建的L-天門冬醯胺酶工程菌及其發酵培養方法。
本發明是利用現代生物技術、基因工程方法來構建工程菌，並選擇合適的培養基及培養方法使得到的酶活力達到最高水平。
L-天門冬醯胺酶[E.C3.5.1.1]，也稱L-天門冬醯胺基水解酶，能專一地催化L-天冬醯胺水解成L-天冬氨酸和氨。
1953年，Kidd發現豚鼠血清有抗腫瘤作用，到了六十年代，Broome證實了豚鼠血清的抗腫瘤因子是血清中的L-天門冬醯胺酶。L-天冬醯胺酶能使敏感腫瘤細胞胺基酸、蛋白質和核酸代謝的紊亂，從而抑制腫瘤生長。1964年，Mashburn從大腸桿菌分離得到該酶，從此開始了從微生物中提取L-天門冬醯胺酶，進行生產及臨床的研究。許多臨床資料表明L-大門冬醯胺酶對急性淋巴細胞白血病、急性粒細胞白血病、急性變慢性白血病以及若干實質性腫瘤有肯定的治療作用，特別對兒童急性淋巴細胞白血病有很好的療效。
我們實驗室於1970年開始L-天門冬醯胺酶研究，篩選出一株高產L-天門冬醯胺酶的大腸桿菌菌株，經過發酵培養條件試驗，酶活力達到4.6iu/ml，以後進行純化、工廠中試、純化酶製劑的動物試驗、臨床試驗，在1973年通過了鑑定，並開始在天津生化製藥廠進行生產，在醫院裡得到了應用。
此後，我們用甲基戊二醇方法獲得了該酶的結晶，並對該酶作了一系列的性質試驗，酶的分子量是144000，由四個相同的亞基組成，單獨的亞基不具備酶活性，酶的等電點是pI4.6，酪氨酸殘基是該酶活性的必需基團，處於該酶分子的活性部位，對酶分子的N-端胺基酸組成進行了分析。雖然，L-天門冬醯胺酶已使用多年，但在治療白血病方面，該酶仍被認為是一個有效的藥物，只是在應用中產生了一些問題，如作為異體蛋白的酶的長期使用會刺激免疫系統，對人體產生有害的免疫排斥反應，酶在人體中不穩定性，半衰期短；更為重要的是，菌種產酶活性低而引起酶製劑成本太高，一般病人根本承受不起，這些問題不解決，就會大大限制了酶的廣泛使用。
提高菌種產酶能力，可以用多種方法，包括重新篩選優良菌種、通過傳統的物理化學的方法進行菌種誘變以及用現代遺傳育種技術、基因工程方法來提高菌種的產酶能力等。但是通過國內外專利及文獻檢索，發現的基因工程方面的報導很少，還沒有用工程菌來生產該酶。英國的PublicHealth Laboratory Service Board的Atkinson博士從歐文氏菌(Erwinia chrsyanthemi)的DNA基因庫中篩選出L-天門冬醯胺酶基因，構建的重組質粒pASN30，在大腸桿菌和歐文氏菌中進行表達。酶的表達量僅為可溶性蛋白的5-6％，酶活力最高只有20iu/ml.該酶的亞基分子量為32000，等電點pI8.5(EP211639)。美國Purdue大學的Harms博士也構建了產L-天門冬醯胺酶的大腸桿菌工程菌(Protein ExpressionPurification,1991 2(2-3),44-50).所分泌出的酶佔細胞可溶性蛋白的10-15％。每立升發酵液能得到10-15mg酶。在國內，中國藥科大學的劉景晶等人先後構建了二個產L-天門冬醯胺酶的工程菌。在第一個工程菌中，產酶量僅為6.2-31.8iu/ml，酶蛋白佔28.3-35.7％(藥物生物技術1995,2(4)8-15)。而在第二個工程菌中，使用了同一個酶的基因來源，但構建在不同的表達載體裡，使表達水平有了很大提高，在LB培養基裡，能達到106iu/ml。只是在1.5L的生物反應器，酶活力高達400iu/ml。酶蛋白佔菌體可溶性蛋白48.3％。酶的分子量為140000。(中國藥科大學學報，1996,27(11)696-700)。但這些工作離酶的生產應用仍有很大一段距離，因為所採用的表達質粒含Tac啟動子，需要有價格昂貴的IPTG誘導及氨苄青黴素作為選擇標記，而在大規模生產時，加上IPTG和氨苄青黴素顯然是不合適的。
本發明的目的是構建一株高產L-天門冬醯胺酶的工程菌，其發酵培養基易得，培養方法簡單可行，不需化學誘導劑誘導及氨苄青黴素作為選擇標記，易於工業化生產，產酶能力強，從而大大降低生產成本，提高經濟效益。
本發明的L-天門冬醯胺酶工程菌的構建及發酵培養方法，包括如下一些工藝步驟從產L-天門冬醯胺酶的菌株中分離染色體DNA、引物設計和用PCR方法釣取酶的基因、基因序列測定及重組質粒的構建、重組質粒在幾種宿主菌中表達、工程菌的發酵培養。本發明重組質粒的構建及工程菌的培養方法的上述各步詳細內容如下1．從產L-天門冬醯胺酶的菌株中分離染色體DNA產L-天門冬醯胺酶的原始菌株，是由本發明人在實驗室篩選而得。是幾年前篩選出的一株高產L-天門冬醯胺酶的大腸桿菌菌株，後由天津生化製藥廠試生產。該菌種名叫IM-602，在7.5％玉米漿，37℃培養8小時，其產L-天門冬醯胺酶的酶活力每毫升培養液最高能達到4.6單位。
從上述菌種中分離提取染色體DNA的方法，是採用已知技術，詳見「DNA探針技術」(美國G.H.凱勒和M.M.馬納克著，孫士勇等人譯，科學出版社，1992年出版)。該方法主要是將37℃培養過夜的IM-602培養液離心收集菌體，加溶菌酶至終濃度1mg/ml,0℃作用15min，加RNase至終濃度100μg/ml,37℃ 30min，加蛋白酶K至終濃度100μg/ml，37℃ 2小時後用苯酚∶氯仿(1∶1)將蛋白抽提5-6次，移出水相，加入3mol/L乙酸鈉至終濃度為0.2mol/L，加入-20℃預冷的無水乙醇，界面形成雲霧狀沉澱，即沉澱的DNA，用玻棒順時針纏繞，放至4℃ TE緩衝液中逆時針解旋下DNA，即得到提取的染色體DNA。2．引物設計和用PCR方法釣取酶的基因製備重組質粒重組質粒的L-天門冬醯胺酶的基因是通過已知PCR方法從上述染色體DNA中擴增而得到。兩個引物是根據已報導的大腸桿菌L-天門冬醯胺酶的基因序列及表達質粒的多酶切點而設計的，EcoRⅠ在酶基因的5』端，並在其後設置起始密碼子ATG,SalⅠ在酶基因的3』端。其中primer-1:5』-TAGAATTCATGGAGTTTTTCAAGAAGACG-3』primer-2:5』-AAGTCGACATTAGTACTGATTGAAGATC-3』兩個引物所設置的酶切位點與表達質粒PBV220的EcoRⅠ和SalⅠ相匹配，適合於在大腸桿菌中高表達。表達質粒pBV220經過用EcoRⅠ和SalⅠ酶切，酶切產物經低熔點膠電泳，切下所需的帶，進行純化。
純化的經EcoRⅠ和SalⅠ酶切的酶基因片段在DNA連接酶作用下，連接在pBV220/EcoRⅠ+SalⅠ，轉化在JM105中，從菌落中提取質粒，用EcoRⅠ,SalⅠ進行酶切鑑定。挑出二個含L-天門冬醯胺酶基因的重組質粒，並命名為pASN(見附
圖1)。附圖1是本發明工程菌重組質粒pASN的構建圖。重組質粒經EcoRⅠ和SalⅠ酶切為大小二個片段，其大小分別與酶基因和pBV220/EcoRⅠ+SalⅠ的片段大小相一致。
PCR反應染色體DNA模板1.5μg,2.5單位Taq聚合酶，100pmol DNA引物，2.5mM dATPdCTPdGTP和dTTP各1μl，終體積25μl，每循環中94℃變性45s,45℃退火1min,72℃延伸1min45s，最後一次循環延至10min,共36個循環。
所得PCR產物在1％agarose中電泳，產物大小約為1kb。
所採用的表達質粒pBV220是由中國預防醫學科學院病毒所構建的，具有以下特點1)整個質粒為3.66kb2)含有PRPL啟動子和cI調控基因3)SD序列後面緊跟多酶切點，便於插入外源基因。
4)含有抗氨苄青黴素基因(Ampr)對重組質粒的L-天門冬醯胺酶基因進行DNA序列分析(見圖2)。圖2是本發明L-天門冬醯胺酶基因系列，其中一指信號肽序列，口是與E.coliK-12不同的鹼基和胺基酸。L-天門冬醯胺酶的結構基因全長為1044bp，與已發表的大腸桿菌K-12的L-天門冬醯胺酶基因序列相比較(David T.Bonthron,Gene91(1990)101-105)。全部核苷酸序列中，有33個鹼基不同。在編碼的胺基酸序列中，有2個胺基酸改變即27位胺基酸，大腸桿菌K-12為Val27，而大腸桿菌IM-602為Ala27,263位胺基酸，大腸桿菌K-12為Thr263，而大腸桿菌IM-602為Asn263。3．重組質粒在宿主菌中表達重組質粒可轉化在大腸桿菌TGl、JM105、IM602等宿主菌中，得到可高效表達L-天門冬醯胺酶的工程菌。其轉化的方法和條件如下用CaCl2法分別製備各宿主菌感受態細胞(「分子克隆」)。將1μl重組質粒與200μl感受態細胞混合，於冰上放置30min,42℃90s，後放冰上2min，加入800μlLB培養基，於37℃ 100rpm振蕩培養1hr，後取100μl鋪於LB平板上(100μg/ml Amp)37℃放置過夜，即得到含重組質粒的工程菌pASN-T,pASN-J,pASN-I。
上述三種不同工程菌均可高效表達L-天門冬醯胺酶。其酶活力可達到120-228iu/ml發酵液。4．工程菌的發酵培養工程菌的培養基是5％-10％玉米漿，尤以7.5％玉米漿最好，0.1-0.5％酵母膏，0.1-0.5％蛋白腖，PH7.0-7.5,15磅壓力30分鐘滅菌。
用過夜培養的工程菌作為種子液，接種量為0.5-3.0％，尤以1.5％較好，在28-30℃培養4-10小時，使培養物的生長濁度在A600達到2.0-4.0，以3.0為最好，然後在42℃開始誘導，誘導時間為2-6小時，以3-4小時為最好。
上述所得的發酵液的L-天門冬醯胺酶酶活力為每毫升120-228單位。
酶活力測定方法取1ml發酵液，6000rpm離心10min，棄上清，用1ml PH8.4、0.1mol/L的硼酸-硼酸鈉緩衝液懸浮菌體。測定步驟1ml0.04mol/L L-天門冬醯胺，0.5ml 0.1mol/L硼酸-硼酸鈉緩衝液，0.5ml合適的細胞稀釋懸浮液，在37℃保溫15min，加入0.5ml 15％三氯乙酸終止反應。離心取上清液1ml，加入在2ml奈斯勒試劑和7ml蒸餾水溶液中，15min後，用1cm比色皿在500nm處比色。
酶活力定義在上述條件下，每分鐘催化L-天門冬醯胺釋放1微克分子氨所需要的酶量定義為一個酶活力單位。
通過以上的技術實施，本發明得到了一個含L-天門冬醯胺酶基因的重組質粒pASN，該重組質粒在不同宿主菌，包括TG1、JM105、IM602進行轉化，特別是在原生產菌株IM602轉化所得工程菌，在發酵培養誘導以後，酶活力高達159-228單位/毫升，是原生產菌株的35-50倍。該工程菌產生的酶特徵是分子量為144000，它有四個相同的亞基組成，酶的亞基的胺基酸組成及基因序列與已公開發表的有差別。在全長1044bp中，有33個鹼基不同，在編碼的胺基酸序列中，有兩個胺基酸有差異(27位Ala,263位Asn)。
實施例1按照上述四步工藝方法構建L-天門冬醯胺酶工程菌和培養產生該工程菌，一具體實施例如下首先取已知菌種IM-602利用「DNA探針技術」分離提取染色體DNA。主要是將37℃培養過夜的IM-602培養液離心收集菌體，加溶菌酶至終濃度1mg/ml，0℃作用15min，加RNase至終濃度100ug/ml,37℃ 30min,加蛋白酶K至終濃度100ug/ml,37℃ 2小時後用苯酚∶氯仿(1∶1)將蛋白抽提5-6次，移出水相，加入3mol/L乙酸鈉至終濃度為0.2mol/L，加入-20℃預冷的無水乙醇，界面形成雲霧狀沉澱，即沉澱的DNA，用玻棒順時針纏繞，放全4℃ TE緩衝液中逆時針解旋下DNA，即得到提取的染色體DNA。
然後用PCR方法釣取酶基因並製備重組質粒。方法如下染色體DNA模板1.5ug,2.5單位Taq聚合酶，100pmol/L DNA引物，2.5mmol/LdATP,dCTP,dGTP和dTTP各1ul，終體積25ul，每循環中94℃變性45s，45℃退火1min,72℃延伸1min45s，最後一次循環延至10min，共36個循環。
所得PCR產物經低熔點膠純化。經EcoRⅠ和SalⅠ酶切的酶基因片段在DNA連接酶作用下，連接在pBV220/EcoRⅠ+SalⅠ大片段上，得到重組質粒。
將此重組質粒轉化在大腸桿菌JM105中，方法如下用CaCl2法分別製備大腸桿菌JM105感受態細胞(「分子克隆」)。將1μl重組質粒與200μl感受態細胞混合，於冰上放置30min,42℃ 90s，後放冰上2min，加入800ul LB培養基，於37℃ 100rpm振蕩培養1hr，後取100μl鋪於LB平板上(100μg/ml Amp)37℃放置過夜，即得到含重組質粒的工程菌。
最後發酵培養工程菌1個裝有2ml玉米漿培養基(7.5％玉米漿，0.2％酵母膏，0.2％蛋白腖，PH7.5)的10ml小試管，經15磅30分滅菌後，接上工程菌斜面，37℃振蕩培養過夜。
在250ml三角瓶中，裝入50ml同種培養基，15磅30分滅菌，接入0.5ml上述過夜培養液，28℃振蕩培養5.5hr，使A600達到3左右，42℃誘導3hr，最後發酵液的L-天門冬醯胺酶活力達到153IU/ml。實施例2本實施例中，方法和條件與實施例1相同，不同之處僅在於工程菌的發酵培養在50立升發酵罐中。
將工程菌斜面接入已滅好菌的8個分別裝入50ml培養基250ml三角瓶中，(7.5％玉米漿，0.2％酵母膏，0.2％蛋白腖，PH7.5)37℃，培養過夜。
在50L小罐中，裝上25L同種培養基，15磅30分滅菌，接上375ml上述過夜培養液。28℃，培養6.5h，使A600達到3.2,42℃，誘導3.5h，最後所得發酵液的L-天門冬醯胺酶活力達到123iu/ml。實施例3在本實施例中，染色體提取，PCR方法和轉化方法與實施例1相同，不同之處僅在於將重組質粒轉化在大腸桿菌IM-602中，發酵培養工程菌的方法是1個裝有2ml玉米漿培養基(7.5％玉米漿，0.2％酵母膏，0.2％蛋白腖，PH7.4)的10ml小試管，經15磅30分滅菌後，用滅菌牙籤從工程菌平板上挑入一單菌落，30℃ 230rpm振蕩培養過夜。
在250ml三角瓶中，裝入50ml同種培養基，15磅30分滅菌，接入0.75ml上述過夜培養液，30℃ 230rpm振蕩培養4hr，使A600達到3左右，42℃誘導4hr，最後發酵液的L-天門冬醯胺酶活力達到228IU/ml。實施例4本實施例中，基本方法和條件與實施例3相同，不同之處僅在於工程菌的發酵培養在50立升發酵罐中。
1個裝有20ml玉米漿培養基(7.5％玉米漿，0.2％酵母膏，0.2％蛋白腖，PH7.4)的250ml三角瓶，15磅30分滅菌後，用滅菌牙籤從工程菌平板上挑入一單菌落，30℃ 250rpm振蕩培養過夜。
8個分別裝入50ml培養基(7.5％玉米漿，0.2％酵母膏，0.2％蛋白腖PH7.4)250ml三角瓶，15磅30分滅菌後，接入2ml上述培養液，30℃ 250rpm振蕩培養過夜。
在50L小罐中，裝上25L 同種培養基，15磅30分滅菌，接上300ml上述過夜培養液。30℃，培養5h，使A600達到3.1,42℃，誘導4.5h,最後所得發酵液的L-天門冬醯胺酶活力達到159iu/ml。實施例5本實施例中，基本方法和條件與實施例1相同，不同之處僅在於將重組質粒轉化在大腸桿菌TG1中。發酵培養工程菌的方法是1個裝有2ml玉米漿培養基(7.5％玉米漿，0.2％酵母膏，0.2％蛋白腖，PH7.4)的10ml小試管，經15磅30分滅菌後，用滅菌牙籤從工程菌平板上挑入一單菌落，30℃ 230rpm振蕩培養過夜。
在250ml三角瓶中，裝入50ml同種培養基，15磅30分滅菌，接入0.75ml上述過夜培養液，30℃ 230rpm振蕩培養5hr，使A600達到3左右，42℃誘導3hr，最後發酵液的L-天門冬醯胺酶活力達到203IU/ml。
權利要求
1．一種產L-天門冬醯胺酶的工程菌，其特徵在於1)該工程菌是由重組質粒pASN在三種宿主菌TG1、JM105、IM602分別轉化而得，2)該工程菌在合適的培養基、合適的培養條件下，具有強的產L-天門冬醯胺酶的能力，其酶活力為120-228國際單位/毫升發酵液，3)該工程菌產生的酶不同於已有的大腸桿菌K-12，酶的分子量為144000，由四個相同亞基組成，亞基基因全長為1044bp，其中有33個鹼基不同於大腸桿菌K-12，所編碼的胺基酸中二個有差別(Ala27和Asn263)。
2．如權利要求1所述的工程菌重組質粒pASN，其特徵在於是由以下方法構建的1)從產L-天門冬醯胺酶的原始菌株E.coliIM-602分離提取染色體DNA，2)用PCR方法從上述染色體DNA中釣取酶的基因。3)將酶基因連接在表達質粒pBV220上。
3．如權利要求2所述的酶基因與表達質粒連接的方法，其特徵在於1)PCR所採用二個引物是根據與表達質粒pBV220中EcoRⅠ和SalⅠ的酶切位點相匹配而設計的，並在EcoRⅠ位點後設置起始密碼子ATG，2)酶基因的5』端連在表達質粒EcoRⅠ位點上，3』端連在SalⅠ位點上，從而構成重組質粒pASN。
4．如權利要求1所述的工程菌合適培養基是指含5-10％(W/V)的玉米漿，最佳為7.5％,0.1-2.0％(W/V)酵母膏，0.1-2.0％蛋白腖，pH6.5-8.0.
5．如權利要求1所述的工程菌合適培養條件方法，其特徵在於接種量0.3-4.0％，起始培養溫度28℃-32℃，培養3-10小時，生物量達到A6001.0-6.0，最佳3.0時，然後42℃熱誘導2-8小時，最佳4.5小時，可得到L-天門冬醯胺酶酶活力為120-228單位/毫升的發酵液。
6．一種用權利要求1所述工程菌所生產的酶，其特徵在於該酶的分子量為144000，由四個相同亞基組成，亞基基因全長為1044bp，其中有33中鹼基不同於大腸桿菌K-12，所編碼的胺基酸中二個有差別(Ala27和Asn263)。
7．一種如權利要求1或6所述工程菌生產的酶在製備白血病醫藥方面的使用，其特徵在於在含5-10％(W/V)玉米漿、0.1-2.0(W/V)酵母膏，0.1-2.0％蛋白腖及pH6.5-8.0的基質中，接種0.3-4.0％(V/V)的工程菌，在28-32℃培養3-10小時，然後42℃熱誘導2-8小時，得到L-天門冬醯胺酶酶活力為120-228單位/毫升的發酵液，繼而純化所得製劑用於治療白血病。
全文摘要
本發明是關於新構建的產L－天門冬醯胺酶重組菌及其發酵培養的方法。其中包括從產L－天門冬醯胺酶的菌株中分離染色體DNA，引物的設計，用PCR方法釣取酶的基因，酶基因的序列測定，重組質粒的構建，在幾種宿主菌的表達，工程菌的發酵培養。本方法中，所得到的酶基因區別於已報導的該酶基因序列，並在個別胺基酸組成上也有差異；工程菌所採用的培養基便宜易得，發酵方法簡單可行，每毫升發酵液可達120—228單位。
文檔編號A61K38/43GK1237633SQ9810204
公開日1999年12月8日 申請日期1998年6月1日 優先權日1998年6月1日
發明者錢世鈞, 王穎達, 孟廣震, 葉軍 申請人:中國科學院微生物研究所