具有抗腫瘤活性的靈芝子實體提取物及其製備方法

2023-06-12 20:37:46 3

專利名稱：：具有抗腫瘤活性的靈芝子實體提取物及其製備方法
技術領域：
：本發明涉及中藥靈芝子實體提取物，具體地說是涉及一種具有抗腫瘤活性的靈芝子實體提取物，以及這種具有抗腫瘤活性的靈芝子實體提取物的製備方法。
背景技術：
：靈芝為多孔菌科真菌，有幾千年的藥用歷史，收載於中國最早的本草學專著《神農本草經》。兩千多年以來，人們一直用靈芝來預防、治療腫瘤；現代科學研究也表明，靈芝有較強的抗腫瘤作用。靈芝三薛類成分被公認為靈芝抗胂瘤的有效成分之一。關於靈芝三闢類成分的提取，常用乙醇加熱回流提取，其存在有機溶劑殘留多、提取溫度高、成本相對較高等缺點。超臨界C02流體技術是提取靈芝三闢類成分的最新技術，克服了以上缺點。中國專利200510047263.9公開了CCVSFE在提取靈芝子實體中三萜類物質上的應用。雖然目前關於靈芝子實體超臨界C02萃取三萜類組分的提取工藝研究較多，但對三闢類組分的純化研究卻相對較少，臨床多以超臨界C02萃取物直接用藥，或將純化後的靈芝三萜酸類成分用於治療。李保明(參見:李保明，劉超,王洪慶,等.靈芝總三萜酸含量測定方法的研究[J].中國中藥雜誌,2007,32(12)1234-1236.)報導將靈芝子實體用乙醇加熱回流提取，氯仿溶解，飽和碳酸氬鈉溶液鹼提，鹽酸酸化，氯仿萃取的方法獲得靈芝三碎酸類成分；中國專利200310117112.7公開了一種靈芝三闢類抗腫瘤組分的提取方法，它將靈芝子實體用甲醇或乙醇超聲循環浸提，然後用飽和碳酸氫鈉溶液石威提，鹽酸酸化，再用氯仿萃取將酸化後的三闢酸類成分，減壓蒸乾得到三闢酸類組分。以上報導有一個共同之處，即均將飽和碳酸氫鈉溶液鹼提之後的氯仿層棄掉，僅保留飽和碳酸氫鈉溶液鹼提液中的三闢酸類成分，將之酸化並萃取出。
發明內容本發明的目的，是提供一種具有抗腫瘤活性的靈芝子實體提取物，這是一種從靈芝子實體超臨界C02萃取物中獲得的具有抗腫瘤活性的提取物。本發明還提供這種具有抗腫瘤活性的靈芝子實體提取物的製備方法。本發明將克服以往普遍使用靈芝三闢中三闢酸類成分，而忽略其中含有的其它具有抗腫瘤活性成分利用的問題。完成本申請第l個發明任務的方案是，一種具有抗腫瘤活性的靈芝子實體提取物，其特徵在於，其中三萜類成分的含量為30~70wt%;同時，該提取物中含有的有效成分還用以下方法表徵用高效液相色譜條件1表徵提取物，由色譜峰保留時間在80128min之間的成分組成(圖1);用高效液相色譜條件2表徵提取物，主要包含色譜峰保留時間為14.8915.67min、30.7431.35min、34.3634.98min、37.03~37.64min、39,47~40.01min的5個成分(圖2)。所述的高效液相色鐠條件1為ZORBAXSB-C18柱(4.6mmx250mm，5pm);流動相A:乙腈，B:0.05%磷酸水溶液，線性梯度洗脫，0min:27°/oA;40min:27%A;60min:35%A;80min:450/0A;90min:65%A;100min:75%A;110min:85%A;120min:100%A;128min:100%A;流速:l.OmL.min-1;檢測波長254nm;柱溫30。C。在此條件下，靈芝子實體超臨界C02萃取的粗提物由色譜峰保留時間在0128min之間的所有成分組成(圖3);該粗提物的碳酸氬鈉萃取層(即以往普遍使用的靈芝三薛酸類成分)由色語峰保留時間在0~80min之間的所有成分組成(圖4),色譜峰保留時間在80~128min之間的所有成分組成本提取物。高效液相色鐠條件2為ZORBAXSB-C18柱(4.6mmx250mm，5jim);流動相A:乙腈，B:0.05。/。磷酸水溶液，線性梯度洗脫，0min:60%A;25min:90%A;40min:1000/oA;45min:100%A;;危速:l.OmL.min畫l;才企測波長240nm;柱溫30。C。三碎類成分含量測定方法用分光光度法，以熊果酸為對照品，在檢測波長為543nm下測定，供試品及空白樣品的光語掃描圖見圖'5、圖6、圖7。申請人研究發現靈芝子實體用超臨界C02萃取技術提取出的粗提物，經飽和碳酸氫鈉溶液鹼提後的氯仿層，即以上報導中棄去的物質，亦具有很強的抗腫瘤活性。所以，本發明建立了一種從靈芝子實體中提取靈芝三碎酸以外提取物的方法，獲得一種具有抗腫瘤活性的靈芝子實體提取物。更具體和更優化地說，本發明所述的具有抗腫瘤活性的靈芝子實體提取物是指採用以下方法製備得到的提取物(1)靈芝子實體粉碎成粗粉，過篩；(2)將靈芝子實體粗粉以乙醇為夾帶劑用超臨界C02萃取技術進行萃取，得到靈芝子實體粗提物乙醇溶液，減壓回收溶劑，得到靈芝子實體粗提物；(3)將靈芝子實體粗提物用醋酸乙酯溶解，飽和碳酸氫鈉溶液萃取，分別得到飽和碳酸氫鈉層和醋酸乙酯層；(4)取醋酸乙酯層減壓回收溶劑，真空乾燥，得靈芝子實體抗腫瘤提取物。本發明的另一目的是提供上述提取物的製備方法，其特徵在於，步驟如下(1)靈芝子實體粉碎成粗粉，過篩；(2)將靈芝子實體粗粉以乙醇為夾帶劑用超臨界C02萃取技術進行萃取，得到靈芝子實體粗提物乙醇溶液，減壓回收溶劑，得到靈芝子實體粗提物；(3)將靈芝子實體粗提物用醋酸乙酯溶解，飽和碳酸氫鈉溶液萃取，分別得到飽和碳酸氫鈉層和醋酸乙酯層；(4)取醋酸乙酯層減壓回收溶劑，真空乾燥，得靈芝子實體抗腫瘤提取物。在上述步驟(1)中，靈芝子實體並分碎時，過10~50目篩。在本發明的優選實例中，靈芝子實體粗粉過12目篩。在上述步驟(2)中，超臨界C02萃取條件為萃取壓力為25MPa,萃取溫度為45。C，萃取時間為1.5h，夾帶劑乙醇用量為3mL.g"生藥。在上述步驟(2)中，靈芝子實體粗提物乙醇溶液回收乙醇時，溫度控制在30~60。C，最優溫度控制在50。C。在上述步驟(3)中，用醋酸乙酯溶解時，靈芝子實體粗提物與醋酸乙酯兩者的比例為靈芝子實體粗提物質量(g):醋酸乙酯(mL)-l:10l:100,優選為1:401:80,最優選為1:50。在上述步驟(3)中，用飽和碳酸氫鈉溶液萃取醋酸乙酯溶液，萃取次數為18次，優選萃取次數為2~6次，最優選萃取次數為4次。在上述步驟(3)中，用飽和碳酸氬鈉溶液萃取醋酸乙酯溶液時，醋酸乙酯與飽和碳酸氫鈉溶液體積比為1:33:1，優選為1:22:1，最優選為1:1。在上述步驟(4)中，回收醋酸乙酯溶劑和真空乾燥提取物時，溫度控制在30~60。C,優選為50。C。在上述步驟(4)中得到的黑褐色固體即為靈芝子實體抗胂瘤提取物。本發明的靈芝子實體提取物的藥用用途是以所述的靈芝子實體提取物作為抗胂瘤活性成分，加入藥學上可接受的輔料，製成的任何一種劑型的藥物。本發明的有益效果1.本發明使用超臨界co2流體技術萃取靈芝子實體的活性組分，可以大幅度減少有機溶劑產生的環境汙染，保護環境。2.本發明抗腫瘤提取物比以往普遍使用的靈芝三闢酸類成分具有更好的抗腫瘤效果，充分利用本發明提取物可以更好、更充分合理的利用靈芝這味珍貴藥材。圖1為本發明提取物HPLC圖語(色譜條件1);圖2為本發明提取物HPLC圖鐠(色鐠條件2);圖3為靈芝子實體超臨界C02粗提物HPLC圖譜(色譜條件1);圖4為靈芝子實體超臨界C02粗提物的碳酸氫鈉萃取層的HPLC圖譜(色譜條件1);圖5為熊果酸對照品的光鐠掃描圖；圖6為供試品的光語掃描圖；圖7為空白樣品的光譜掃描圖。圖8為從靈芝子實體中獲得一種具有抗腫瘤活性的提取物的製備方法流程圖。具體實施例方式下面結合實例對本發明作進一步詳細說明，但本發明的範圍並不受這些實例的限制。實施例1將靈芝子實體粉碎，過12目篩，取100g置於超臨界萃取裝置中的1L萃取釜中，設定萃取釜溫度為45°C,分離釜I溫度為50。C,分離釜II溫度為36。C,打開C02鋼瓶(需保持出口壓力在4MPa以上)，同時調節萃取釜壓力為25MPa、分離釜I壓力為7MPa、分離釜II壓力為4MPa，調節C02流量為30L/h，萃取時間1.5h,夾帶劑乙醇用量為300mL。使超臨界<:02流體在設定的壓力、溫度下進行萃取循環，當達到試驗設定的萃取時間後，從分離釜I和分離釜II出料口接收萃取液；將得到的提取液，50。C減壓回收溶劑，得到靈芝子實體粗提物。將上述所得到的靈芝子實體粗提物，用50倍醋酸乙酯溶解；再用飽和碳酸氫鈉溶液萃取4次，萃取時飽和碳酸氫鈉溶液與醋酸乙酯體積比為1:1,得到碳酸氫鈉溶液層和醋酸乙酯層；5(TC減壓回收醋酸乙酯溶劑，並於50。C真空乾燥，得黑褐色固體粉末1.06g。本發明提取物中三萜類成分含量測定取靈芝子實體抗腫瘤提取物50mg,用無水乙醇定容到50mL,用可見分光光度法測定三碎類成分的含量。對照品溶液的製備精密稱取熊果酸對照品2.21mg，置於10mL量瓶中，加無水乙醇適量使溶解，定容，搖勻，即得。顯色方法及檢測波長的確定取上述熊果酸對照品溶液0.5mL，置10mL具塞試管中，沸水浴中揮幹溶劑，依次加入新配製的5%香草醛-冰醋酸溶液0.5mL，高氯酸0.8mL,密塞，於60。C水浴中加熱15min,取出，水水浴中冷卻5min，加冰醋酸5mL，搖勻。用UV-2802型可見分光光度儀進行全波長掃描，在543nm處有最大吸收峰，故選擇檢測波長為543nm。標準曲線的製備分別精密吸取熊果酸對照品溶液0.2,0,3,0.4，0.5，0.6,0.7,0.8mL,按上述條件及步驟在543nm處測定吸光度，以吸光度為縱坐標(y)，熊果酸對照品含量(嗎)為橫坐標(Z)，繪製標準曲線，線性方程為0.0035,產0.9995，結果表明熊果酸在44.2154.7嗎呈現良好的線性關係。含量測定取上述製備的靈芝子實體抗肺瘤提取物乙醇溶液60^L,按"顯色方法"項下測定吸光度，根據標準曲線計算靈芝三薛的含量。結果見表2。固形物的含量測定精密量取上述靈芝子實體抗腫瘤提取物乙醇溶液IOmL，置已乾燥恆重的蒸發亞中，水浴揮幹溶劑，置105。C烘箱中恆重，稱定，計算固形物的含量，結果見表l。表1本發明提取物的三萜含量、固形物含量的測定樣品固形物含量/%三砲含量/%本發明提取物__53.49實施例2將靈芝子實體粉碎，過10目篩，取100g置於超臨界萃取裝置中的1L萃取釜中，設定萃取釜溫度為45°C，分離釜I溫度為50°C，分離釜II溫度為36。C,打開C02鋼瓶(需保持出口壓力在4MPa以上)，同時調節萃取釜壓力為25MPa、分離釜I壓力為7MPa、分離釜II壓力為4MPa,調節C02流量為30L/h,萃取時間1.5h,夾帶劑乙醇用量為300mL。使超臨界C02流體在設定的壓力、溫度下進行萃取循環，當達到試驗設定的萃取時間後，從分離釜I和分離釜II出料口接收萃取液；將得到的提取液，30。C減壓回收溶劑，得到靈芝子實體粗提物。將上述所得到的靈芝子實體粗提物，用IOO倍醋酸乙酯溶解；再用飽和碳酸氫鈉溶液萃取6次，萃取時飽和碳酸氫鈉溶液與醋酸乙酯體積比為2:1,得到碳酸氬鈉溶液層和醋酸乙酯層；4(TC減壓回收醋酸乙酯溶劑，並於40。C真空乾燥，得到黑褐色固體粉末0.95g。實施例3將靈芝子實體粉碎，過50目篩，取100g置於超臨界萃取裝置中的1L萃取釜中，設定萃取釜溫度為45°C,分離釜I溫度為50°C，分離釜II溫度為36。C，打開C02鋼瓶(需保持出口壓力在4MPa以上)，同時調節萃取釜壓力為25MPa、分離釜I壓力為7MPa、分離釜II壓力為4MPa，調節C02流量為30L/h，萃取時間1.5h,夾帶劑乙醇用量為300mL。使超臨界C02流體在設定的壓力、溫度下進行萃取循環，當達到試驗設定的萃取時間後，從分離釜I和分離釜II出料口接收萃取液；將得到的提取液，50。C減壓回收溶劑，得到靈芝子實體粗提物。13將上述所得到的靈芝子實體粗提物，用10倍醋酸乙酯溶解；再用飽和碳酸氫鈉溶液萃取2次，萃取時飽和碳酸氫鈉溶液與醋酸乙酯體積比為1:3，得到飽和碳酸氬鈉溶液溶液層和醋酸乙酯層；30。C減壓回收醋酸乙酯，30°C真空乾燥，得到黑褐色固體粉末1.31g。實施例4將靈芝子實體粉碎，過12目篩，取100g置於超臨界萃取裝置中的1L萃取釜中，設定萃取釜溫度為45°C,分離釜I溫度為50°C,分離釜II溫度為36。C,打開C02鋼瓶(需保持出口壓力在4MPa以上)，同時調節萃取釜壓力為25MPa、分離釜I壓力為7MPa、分離釜II壓力為4MPa，調節C02流量為30L/h,萃取時間1.5h，夾帶劑乙醇用量為300mL。使超臨界C02流體在設定的壓力、溫度下進行萃取循環，當達到試驗設定的萃取時間後，從分離釜I和分離釜II出料口接收萃取液；將得到的提取液，60。C減壓回收溶劑，得到靈芝子實體粗提物。將上述所得到的靈芝子實體粗提物，用80倍醋酸乙酯溶解；再用飽和碳酸氫鈉溶液萃取5次，萃取時飽和碳酸氫鈉溶液與醋酸乙酯體積比為3:1，得到飽和碳酸氬鈉溶液和醋酸乙酯層；60。C減壓回收醋酸乙酯，60。C真空乾燥，得到黑褐色固體粉末0.81g。實施例5將靈芝子實體粉碎，過12目篩，取100g置於超臨界萃取裝置中的1L萃取釜中，設定萃取釜溫度為45°C，分離釜I溫度為50°C，分離釜II溫度為36。C,打開C02鋼瓶(需保持出口壓力在4MPa以上)，同時調節萃取釜壓力為25MPa、分離釜I壓力為7MPa、分離釜II壓力為4MPa，調節C02流量為30L/h，萃取時間1.5h，夾帶劑乙醇用量為300mL。使超臨界C02流體在設定的壓力、溫度下進行萃取循環，當達到試驗設定的萃取時間後，從分離釜I和分離釜II出料口接收萃取液；將得到的提取液，50。C減壓回收溶劑，得到靈芝子實體粗提物。將上述所得到的靈芝子實體粗提物，用40倍醋酸乙酯溶解；再用飽和碳酸氬鈉溶液萃取4次，萃取時飽和碳酸氳鈉溶液與醋酸乙酯體積比為1:2，得到飽和碳酸氫鈉溶液層和醋酸乙酯層；40。C減壓回收醋酸乙酯溶劑，40°C真空乾燥，得到黑褐色固體粉末U9g。實施例6將靈芝子實體粉碎，過12目篩，取100g置於超臨界萃取裝置中的1L萃取釜中，設定萃取釜溫度為45°C,分離釜I溫度為50°C,分離釜II溫度為36。C,打開C02鋼瓶(需保持出口壓力在4MPa以上)，.同時調節萃取釜壓力為25MPa、分離釜I壓力為7MPa、分離釜II壓力為4MPa,調節C02流量為30L/h，萃取時間1.5h，夾帶劑乙醇用量為300mL。使超臨界C02流體在設定的壓力、溫度下進行萃取循環，當達到試驗設定的萃取時間後，從分離釜I和分離釜II出料口接收萃取液；將得到的提取液，50。C減壓回收溶劑，得到靈芝子實體粗提物。將上述所得到的靈芝子實體粗提物，用60倍醋酸乙酯溶解；再用飽和碳酸氫鈉溶液萃取5次，萃取時飽和碳酸氬鈉溶液與醋酸乙酯體積比為1:1，得到飽和碳酸氫鈉溶液層和醋酸乙酯層；60。C減壓回收醋酸乙酯溶劑，60。C真空乾燥，得到黑褐色固體粉末0.90g。實施例715將靈芝子實體粉碎，過12目篩，取100g置於超臨界萃取裝置中的1L萃取釜中，設定萃取釜溫度為45°C，分離釜I溫度為50°C，分離釜II溫度為36。C,打開C02鋼瓶(需保持出口壓力在4MPa以上)，同時調節萃取釜壓力為25MPa、分離釜I壓力為7MPa、分離釜II壓力為4MPa,調節C02流量為30L/h,萃取時間1.5h,夾帶劑乙醇用量為300rnL。使超臨界C02流體在設定的壓力、溫度下進行萃取循環，當達到試驗設定的萃取時間後，從分離釜I和分離釜II出料口接收萃取液；將得到的提取液，50。C減壓回收溶劑，得到靈芝子實體粗提物。將上述所得到的靈芝子實體粗提物，用80倍醋酸乙酯溶解；再用飽和碳酸氫鈉溶液萃取8次，萃取時飽和碳酸氫鈉溶液與醋酸乙酯體積比為1:1，得到飽和碳酸氫鈉溶液層和醋酸乙酯層；50。C減壓回收醋酸乙酯，50。C真空乾燥，得到黑褐色固體粉末0.76g。實施例8將靈芝子實體粉碎，過12目篩，取100g置於超臨界萃取裝置中的1L萃取釜中，設定萃取釜溫度為45°C，分離釜I溫度為50°C,分離釜II溫度為36。C，打開C02鋼瓶(需保持出口壓力在4MPa以上)，同時調節萃取釜壓力為25MPa、分離釜I壓力為7MPa、分離釜II壓力為4MPa，調節C02流量為30L/h，萃取時間1.5h，夾帶劑乙醇用量為300mL。使超臨界C02流體在設定的壓力、溫度下進行萃取循環，當達到試驗設定的萃取時間後，從分離釜I和分離釜II出料口接收萃取液；將得到的提取液，60。C減壓回收溶劑，得到靈芝子實體^L提物。將上述所得到的靈芝子實體粗提物，用70倍醋酸乙酯溶解；再用飽和碳酸氫鈉溶液萃取l次，萃取時飽和碳酸氫鈉溶液與醋酸乙酯體積比為1:1，得到飽和碳酸氫鈉溶液層和醋酸乙酯層；40。C減壓回收醋酸乙酯，40。C真空乾燥，得到黑褐色固體粉末1.79g。實施例9本發明提取物的體外抗腫瘤實驗人肝癌BEL-7402細胞林取對數生長期人肝癌BEL-7402細胞(購自中科院上海細胞生物學研究所細胞庫)用胰酶消化，用含小牛血清RPMI1640培養基配製成一定濃度的細胞懸液，細胞的濃度為5xl(^個/mL，然後接種於96孔板，每孔加入100pL，置37°C、5。/。C02培養箱及飽和溼度條件下培養24h，然後棄去含小牛血清的培養基，每孔加入90pL無血清培養基，及10jiL不同濃度的藥物，陽性藥物組給予60jig.mL"的順柏溶液，空白組加入等體積的PBS緩衝鹽溶液，另每組各設兩個本底孔(即不含腫瘤細胞，只含對應的培養基與藥物)，以去除培養基及藥液顏色的影響。受試藥分別為本發明提取物(即醋酸乙酯層)和靈芝子實體三闢酸提取物(即飽和碳酸氫鈉層)，均設5個劑量組，分別用PBS稀釋至濃度為20、5、1.25、0.3125、0.0781嗎提取物'mL-l,每組設3個平行孔。於37。C、5。/。C02培養箱培養48h後，每孔加MTT溶液(5mg.m!/1)10pL，繼續培養4h，終止培養，吸棄孔中上清液，然後每孔加100jxLDMSO溶解MTT曱瓚顆粒，用微型振蕩器振蕩10min後，於酶聯免疫檢測儀570nm波長測定光密度值(OD),實驗重複3次，取平均值，計算藥物對腫瘤細胞的抑制率，結果見表2。藥物抑制率=[OD對照組一OD藥物組]/OD對照組xl000/0表2本發明提取物和靈芝子實體三萜酸提取物.對人肝癌BEL-7402細胞的增殖抑制作用比較(-±s，n=3)tableseeoriginaldocumentpage18注陽性對照順鉑組細胞生長抑制率分別為(70.47±0.65)%"--"表示抑制率均小於50%，不能計算IC50結果表明，本發明提取物有較強的抑制人肝癌BEL-7402細胞增殖的活性；並且在同樣濃度下，比靈芝子實體三萜酸提取物抑制率高，具有更好的抑制人肝癌BEL-7402腫瘤細胞增殖的活性。人肺癌SPC-A-1細胞抹取對數生長期人肺癌SPC-A-1細胞(購自中科院上海細胞生物學研究所細胞庫)用胰酶消化，使其脫壁，用10。/。胎牛血清RPMI1640培養液重懸成單細胞懸液，細胞的濃度為5xl(^個/mL，然後接種於96孔細胞培養板，每孔加入100pL。受試藥分別為本發明提取物(即醋酸乙酯層)和靈芝子實體三闢酸提取物(即飽和碳酸氫鈉層)，均設5個劑量組，分別用PBS稀釋至濃度為20、10、5、1.25、0.3125嗎提取物'mL-l，每組設3個平行孔。其餘操作與人肝癌BEL-7402細胞的相同，計算藥物對腫瘤細胞的抑制率，結果見表3。表3本發明提取物和靈芝子實體三萜酸提取物對人肺癌SPC-A-1細胞的增殖抑制作用比較(5±&n=3)tableseeoriginaldocumentpage19注陽性對照順鉑組細胞生長抑制率分別為(74.08±0.59)%"---"表示抑制率均小於50%，不能計算ICso所得結果表明本發明提取物有較強的抑制人肺癌SPC-A-1的增殖活性；並且在同樣濃度下，比靈芝子實體三萜酸提:f又物抑制率高，具有更好的抑制SPC-A-1腫瘤細胞增殖的活性。實施例10本發明提取物的體內抗腫瘤實驗選擇接種7d，生長良好的荷Heps肝癌小鼠，頸推脫臼處死，無菌抽取腹水，以無菌生理鹽水按l:4比例稀釋成2xl(^個/mL的瘤細胞懸液，接種於健康小鼠右前肢皮下，每隻0.2mL。接種次日，按體重隨機分為6組，分別為生理鹽水空白對照組；環磷醯胺陽性對照組；本發明提取物高低劑量組(140mg提取物'kg-l'd-l、70mg提取物'kg-l'd-l);靈芝子實體三薛酸提取物高低劑量組(140mg提取物'kg-l'd-l、70mg提取物'kg-l'd-l)。環磷醯胺陽性對照組為腹腔注射UOmg'kg^d-1),其它組為灌胃給藥，均為每曰1次，連續7d。期間，每日觀察小鼠的一般活動、皮毛、糞便等情況。與末次給藥後24h後頸推脫臼處死小鼠剝取瘤組織，同時剖耳又小鼠脾臟、胸腺，稱重，計算抑瘤率、脾指數、胸腺指數，結果見表4、表5。抑瘤率(％)=(l-治療組平均瘤重/對照組平均瘤重)xioo%;脾指數=脾重(mg)/小鼠體重(g);胸腺指數=胸腺重(mg)/小鼠體重(g)。表4本發明提取物和靈芝子實體三萜酸提取物對Heps移植性腫瘤的抑制作用比較(5±力tableseeoriginaldocumentpage20注與陰性對照組比較承P0.05結果表明本發明提取物有較強的抑制小鼠體內肝癌Heps腫瘤的生長作用，其高、低劑量組與對照組的瘤重相比均有顯著性降低(P〈0.05);並且在相同濃度下，比靈芝子實體三萜酸提取物抑瘤率高，具有更好的抑制小鼠體內肝癌Heps肺瘤的生長的活性。表5本發明提取物和靈芝子實體三萜酸提取物對荷瘤小鼠免疫器官的影響比較(5±力組別提取物給藥量(mg.kg".d誦1)脾指數(mg/g)胸腺指數(mg/g)空白組06.93±1.542.64±0.47環磷醯胺組203.73±1.15*1.46±0.55*本發明1406.77±0.932.49±0.88提取物組706.42±1.222.53±0.86靈芝子實體1406.81±1.302.64±0.72三萜酸提取物組707.20±1.002.61±0.61注與陰性對照組比較*P<0.05實驗結果表明，本發明提取物組的脾指數和胸腺指數與空白組比較無顯著性差異，即表明靈芝子實體提取物對荷瘤小鼠的免疫器官物無毒副作用，可以保持機體的免疫活性。權利要求1、一種具有抗腫瘤活性的靈芝子實體提取物，其特徵在於，其中三萜類成分的含量為30～70wt％；同時，該提取物中的有效成分還用以下方法表徵用高效液相色譜條件1表徵提取物，由色譜峰保留時間在80～128min之間的成分組成；用高效液相色譜條件2表徵提取物，包含色譜峰保留時間為14.89～15.67min、30.74～31.35min、34.36～34.98min、37.03～37.64min、39.47～40.01min的5個成分；所述的高效液相色譜條件1為ZORBAXSB-C18柱；流動相A乙腈，B0.05％磷酸水溶液，線性梯度洗脫，0min27％A；40min27％A；60min35％A；80min45％A；90min65％A；100min75％A；110min85％A；120min100％A；128min100％A；流速1.0mL·min-1；檢測波長254nm；柱溫30℃；所述的高效液相色譜條件2為ZORBAXSB-C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；流動相A乙腈，B0.05％磷酸水溶液，線性梯度洗脫，0min60％A；25min90％A；40min100％A；45min100％A；流速1.0mL·min-1；檢測波長240nm；柱溫30℃。2、根據權利要求1所述的具有抗腫瘤活性的靈芝子實體提取物，其特徵在於，該具有抗肺瘤活性的靈芝子實體提取物是指採用以下方法製備得到的提取物(1)靈芝子實體粉碎成粗粉，過篩；(2)將靈芝子實體粗粉以乙醇為夾帶劑用超臨界C02萃取技術進行萃取，得到靈芝子實體粗提物乙醇溶液，減壓回收溶劑，得到靈芝子實體粗提物；(3)將靈芝子實體粗提物用醋酸乙酯溶解，飽和碳酸氫鈉溶液萃取，分別得到飽和碳酸氬鈉層和醋酸乙酯層；(4)取醋酸乙酯層減壓回收溶劑，真空乾燥，得靈芝子實體抗腫瘤提取物。3、一種權利要求1所述的具有抗腫瘤活性的靈芝子實體提取物的製備方法，其特徵在於，步驟如下(1)靈芝子實體粉碎成粗粉，過篩；(2)將靈芝子實體粗粉以乙醇為夾帶劑用超臨界C02萃取技術進行萃取，得到靈芝子實體粗提物乙醇溶液，減壓回收溶劑，得到靈芝子實體粗提物；(3)將靈芝子實體粗提物用醋酸乙酯溶解，飽和^f友酸氫鈉溶液萃取，分別得到飽和碳酸氬鈉層和醋酸乙酯層；(4)取醋酸乙酯層減壓回收溶劑，.真空乾燥，得靈芝子實體抗腫瘤提取物。4、根據權利要求3所述的具有抗腫瘤活性的靈芝子實體提取物的製備方法，其特徵在於，在所述步驟(l)中，靈芝子實體粉碎時，過1050目篩；'在所述步驟(2)中，超臨界C02萃取條件為萃取壓力為25MPa，萃取溫度為45。C，萃取時間為1.5h，夾帶劑乙醇用量為3mL.g"生藥；靈芝子實體粗提物乙醇溶液回收乙醇時，溫度控制在3060°C;在所述步驟(3)中，用醋酸乙酯溶解時，靈芝子實體粗提物與醋酸乙酯兩者的比例為靈芝子實體粗提物質量(g):醋酸乙酯(mL)-l:10~1:100;在所述步驟(3)中，用飽和碳酸氫鈉溶液萃取醋酸乙酯時，萃取次數為1~8次；在所述步驟(3)中，用飽和碳酸氬鈉溶液萃取醋酸乙酯時，醋酸乙酯與飽和碳酸氬鈉溶液體積比為醋酸乙酯飽和碳酸氬鈉溶液=1:3~3:1;在所述步驟(3)中，用飽和碳酸氬鈉溶液萃取醋酸乙酯時，萃取次數為18次。5、根據權利要求4所述的具有抗胂瘤活性的靈芝子實體提取物的製備方法，其特徵在於，在所述步驟(l)中，靈芝子實體粗粉過12目篩；在所述步驟(2)中，靈芝子實體粗提物乙醇溶液回收乙醇時，溫度控制在50°C;在所述步驟(3)中，用醋酸乙酯溶解時，靈芝子實體粗提物與醋酸乙酯兩者的比例為靈芝子實體粗提物質量g:醋酸乙酯容積mL為1:401:80;在所述步驟(3)中，用飽和碳酸氫鈉溶液萃取醋酸乙酯時，萃取次數為2~6次。6、根據權利要求5所述的具有抗腫瘤活性的靈芝子實體提取物的製備方法，其特徵在於，在所述步驟(3)中，用醋酸乙酯溶解時，靈芝子實體粗提物與醋酸乙酯兩者的比例為靈芝子實體粗提物質量g:醋酸乙酯容積mL為1:50。在所述步驟(3)中，用飽和碳酸氫鈉溶液萃取醋酸乙酯時，萃取次數為4次。7、根據權利要求4~6之一所述的具有抗腫瘤活性的靈芝子實體提取物的製備方法，其特徵在於，在所述步驟(3)中，用飽和碳酸氬鈉溶液萃取醋酸乙酯時，醋酸乙酯與飽和碳酸氫鈉溶液體積比1:33:1;在所述步驟(4)中，回收醋酸乙酯溶劑和真空乾燥提取物時，溫度控制在3060。C。8、根據權利要求7所述的具有抗腫瘤活性的靈芝子實體提取物的製備方法，其特徵在於，在所述步驟(3)中，用飽和碳酸氫鈉溶液萃取醋酸乙酯時，醋酸乙酯與飽和碳酸氫鈉溶液體積比為1:22:1。在所述步驟(4)中，回收醋酸乙酯溶劑和真空乾燥^是:取物時，溫度控制在50。C。9、根據權利要求8所述的具有抗腫瘤活性的靈芝子實體提取物的製備方法，其特徵在於，在所述步驟(3)中，用飽和^f友酸氬鈉溶液萃取醋酸乙酯時，醋酸乙酯與飽和碳酸氫鈉溶液體積比為1:1。全文摘要具有抗腫瘤活性的靈芝子實體提取物及其製備方法，其中靈芝子實體提取物中三萜類成分的含量為30～70wt％；同時提取物中含有以下方法表徵的有效成分用條件1表徵提取物，由色譜峰保留時間在80～128min之間的成分組成；用條件2表徵提取物，包含色譜峰保留時間為14.89～15.67min、30.74～31.35min、34.36～34.98min、37.03～37.64min、39.47～40.01min的5個成分。本發明克服了現有技術使用靈芝三萜中三萜酸類成分忽略其它具有抗腫瘤活性成分利用的問題，可以更好、更充分利用靈芝藥材。並大幅度減少有機溶劑產生的環境汙染，保護環境。文檔編號A61K36/06GK101559083SQ200910027230公開日2009年10月21日申請日期2009年5月25日優先權日2009年5月25日發明者宋師花,賈曉斌,彥陳申請人:江蘇省中醫藥研究院