一種紙基靈敏檢測miRNA的方法與流程
2023-06-12 14:08:11
本專利公開了一種紙基靈敏檢測mirna的方法，涉及手繪紙電極方法和手動製作紙金電極方法和電化學檢測技術領域，即在一張紙上利用蠟筆和鉛筆通過手繪技術製作手繪紙電極再通過化學生長法，生長金納米金，製作紙晶片，更確切的說採用特異性雙鏈核酸酶（duplexspecificnuclease，dsn）在紙晶片上構建了mirna的信號放大機制，即目標mirna與亞甲基藍標籤標記巰基修飾的dna髮夾探針sh-cp-21在紙晶片上形成dna/rna的雜交核酸雙鏈，隨後dsn切割rna/dna雙鏈體的氧化還原標記的髮夾探針，切割後帶有標記髮夾探針又會與目標mirna雜交導致rna/dna雙鏈體的形成，照此循環，再通過電化學方法檢測。
背景技術：
隨著現在生活節奏的加快，不健康的飲食和無規律的作息時間等一系列壞習慣導致了人類患上了不同的疾病。癌症已經成為威脅人類健康的一大殺手，近年來其發病率及死亡率更是呈現逐步走高的趨勢。研究發現，mirna與癌症密切相關，可以作為癌症早期的檢測標誌物。它廣泛存在於各種體液裡，包括唾液、血漿、精液、眼淚和尿液等。而且癌症的發生與多種mirna的變化密切相關，用單一mirna的變化來說明癌症的發生存在很大的局限性。由幾個mirna同時變化造成，以mirna等為代表的基因分析已成為臨床診斷的理想生物標記。
mirna是一類具有調節功能的非編碼rna，它通過調節信使rna影響蛋白質的表達，長約為20-25個核苷酸。每個mirna可以有多個靶基因，而幾個mirna也可以調節同一個基因。這種複雜的調節網絡既可以通過一個mirna來調控多個基因的表達，也可以通過幾個mirna的組合來精細調控某個基因的表達。所以mirna與癌症密切相關，可以作為癌症早期的檢測標誌物。
由於癌症的發生與多種mirna的變化密切相關，用單一mirna的變化來說明癌症的發生存在很大的局限性，而且體液中mirna含量極低。所以同時檢測多種mirna和在mirna含量很低時就能有效快速地檢測出變得尤為重要。但是到目前為止，這個過程仍需要通過昂貴的實驗室工作，使用顯微鏡和電腦晶片來實現，而且檢測靈敏性低，這在很多經濟不發達地區是不可能實現的，因此發明一種既能檢測到低濃度又能降低mirna檢測成本的方法具有重要意義。一方面，dsn通過循環切割修飾在紙晶片上的目標mirna與髮夾探針形成dna/rna的雜交雙鏈中的髮夾探針，釋放出目標mirna，然後目標mirna又會返回到下一輪反應，繼續與有標記的髮夾探針結合，dsn又會切割目標mirna與髮夾探針形成dna/rna的雜交雙鏈中的有標記的髮夾探針，照此，dsn通過多次循環切割修飾在紙晶片上的目標mirna與髮夾探針形成dna/rna的雜交雙鏈中的有標記的髮夾探針，髮夾探針被dsn酶裂解成成千上萬的探針分子從而使信號放大。解決高成本、靈敏性檢測低問題。另一方面，電化學方法（方波伏安法）檢測信號具有響應速度快、儀器成本低、檢測靈敏度高等優勢也可以很好地解決上述問題。
技術實現要素：
本發明要解決的技術問題是昂貴的實驗室工作和使用顯微鏡和電腦晶片來實現檢測，而且檢測靈敏性低。
一種紙基靈敏檢測mirna的方法，其特徵是包括以下步驟：
（1）製備所需要的試劑
焦炭酸二乙酯處理水成分是1l無菌水、1000µl焦炭酸二乙酯，經搖床過夜、次日高溫高壓滅菌30min得到；生長溶液是由667µl質量分數為1%的氯金酸、1000µl焦炭酸二乙酯處理水、0.0139g鹽酸羥胺組成；400ml探針dna緩衝溶液成分是1.0412g4-羥乙基哌嗪乙磺酸、24.5g高氯酸鈉，經焦炭酸二乙酯處理水稀釋，濃鹽酸調節ph到7得到；
（2）納米金修飾紙晶片
將納米金溶液滴加至紙晶片的工作區域，待其自然乾燥後，重複滴加兩次，將生長溶液滴加至紙晶片的工作區域，待其自然乾燥後，重複滴加兩次；
（3）巰基和納米金形成金-硫鍵
紙晶片上滴加5µl10nm用亞甲基藍標籤標記巰基修飾的dna髮夾探針sh-cp-21，在黑暗環境下室溫放置2h，然後用20µl一倍的磷酸鹽緩衝鹽水洗，自然晾乾；
（4）巰基乙醇的表面阻擋
紙晶片上滴加8µl巰基己醇自然晾乾，最後用20µl一倍的磷酸鹽緩衝鹽水洗，自然晾乾；
（5）放大和復用過程
取一定量的50fm目標分子mirna-21、特異性雙鏈核酸酶和特異性雙鏈核酸酶緩衝液，使總體積為7µl，攪拌離心混勻後滴加至紙晶片工作區域，孵育2h；
（6）檢測過程
將紙晶片置於適量探針dna緩衝溶液中，用方波伏安法檢測；方波伏安法檢測的實驗參數如下：初始電壓為-0.5v、終止電壓為0.5v、電位增量為0.004v、振幅為0.025v、頻率為25赫茲、靜置時間為2s。
本發明的有益效果
（1）可實現個性化基因診斷和疾病精準預防；
（2）可以在飛摩爾範圍內直接檢測mirna，比傳統的雜交試驗的靈敏度高五個數量級；
（3）由於紙的內部立體結構，其內部纖維縱橫交錯，生長的金納米可以從上到下布滿整條紙纖維，這樣可以大大地增加比表面積，同時能夠改善其導電性及生物相容性，進而大大提高電極的性能。紙纖維的網狀多孔結構和大的比表面積，為mirna雙特異性酶信號放大提供了廣闊的空間和平臺，更有利於雙鏈特異性核酸酶的信號放大；
（4）本發明所述方法檢測成本低、靈敏度高、時間短、檢測便捷。
附圖說明
圖1為本文所述方法的實驗原理圖。
具體實施方式
為了更好地理解本發明，下面結合實施例和附圖進一步闡明本發明的內容，但本發明的內容不僅僅局限於下面的實施。
實施例1
一種紙基靈敏檢測mirna的方法，其特徵是包括以下步驟：
（1）製備所需要的試劑
焦炭酸二乙酯處理水成分是1l無菌水、1000µl焦炭酸二乙酯，經搖床過夜、次日高溫高壓滅菌30min得到；生長溶液是由667µl質量分數為1%的氯金酸、1000µl焦炭酸二乙酯處理水、0.0139g鹽酸羥胺組成；400ml探針dna緩衝溶液成分是1.0412g4-羥乙基哌嗪乙磺酸、24.5g高氯酸鈉，經焦炭酸二乙酯處理水稀釋，濃鹽酸調節ph到7得到；
（2）納米金修飾紙晶片
將納米金溶液滴加至紙晶片的工作區域，待其自然乾燥後，重複滴加兩次，將生長溶液滴加至紙晶片的工作區域，待其自然乾燥後，重複滴加兩次；
（3）巰基和納米金形成金-硫鍵
紙晶片上滴加5µl10nm用亞甲基藍標籤標記巰基修飾的dna髮夾探針sh-cp-21，在黑暗環境下室溫放置2h，然後用20µl一倍的磷酸鹽緩衝鹽水洗，自然晾乾；
（4）巰基乙醇的表面阻擋
紙晶片上滴加8µl巰基己醇自然晾乾，最後用20µl一倍的磷酸鹽緩衝鹽水洗，自然晾乾；
（5）放大和復用過程
取一定量的50fm目標分子mirna-21、特異性雙鏈核酸酶和特異性雙鏈核酸酶緩衝液，使總體積為7µl，攪拌離心混勻後滴加至紙晶片工作區域，孵育2h；
（6）檢測過程
將紙晶片置於適量探針dna緩衝溶液中，用方波伏安法檢測；方波伏安法檢測的實驗參數如下：初始電壓為-0.5v、終止電壓為0.5v、電位增量為0.004v、振幅為0.025v、頻率為25赫茲、靜置時間為2s、靈敏度為10-6a/v。
實施例2
檢測步驟同例1，不同之處是：步驟（6）中檢測參數靈敏度為10-5a/v。
sequencelisting
濟南大學
一種紙基靈敏檢測mirna的方法
170409
2
patentinversion3.3
1
38
dna
人工合成
1
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人工合成
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