從海參生長環境中分離光合細菌及微生態製劑的製備方法
2023-06-12 14:51:26
從海參生長環境中分離光合細菌及微生態製劑的製備方法
【專利摘要】本發明提供從海參生長環境中分離光合細菌的方法及微生態製劑的製備方法，包括以下步驟：(1)選取試樣；(2)配置富集培養基；(3)光合細菌的富集培養；(4)固體分離培養基板；(5)光合細菌的分離；(6)菌種鑑定；(7)擴大培養；(8)製備微生態製劑。本發明得到深紅紅螺菌質量優良，調節養殖水體中化學因子，避免有害細菌和條件致病菌大量滋生，製成的微生態製劑大大改善水產養殖產品的水體環境。深紅紅螺菌在沒有有機物的條件下，可利用光能，固定二氧化碳固定有機物；在有有機物的條件下，又可以利用有機物進行生長。深紅紅螺菌能將養魚水中的殘餌、排洩物等完全分解，具有改善水產養殖生態環境，降低氨氮、BOD的優點。
【專利說明】從海參生長環境中分離光合細菌及微生態製劑的製備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於細菌培養與分離【技術領域】，尤其是涉及一種從海參生長環境中分離光合細菌及微生態製劑的製備方法。
【背景技術】
[0002]由於全球人口的持續增長和社會經濟的快速發展，人們對水生食物產品的需求也在增加，目前，水產養殖已成為世界上增長最快的食物生產行業。在集約化養殖水體中，水產動物放養密度高，投餵餌料量大，養殖水體中極易蓄積大量的殘餌、動植物排洩物、死亡殘體等含氮有機物，未經處理的養殖廢水和工業、生活汙水被排放或被雨水衝刷進入養殖水體，導致養殖水體中化學因子嚴重超標，有害細菌和條件致病菌大量滋生，魚、蝦等養殖動物的體質下降，因水體環境較小水面更為複雜，水質調節困難，用藥成本高且困難，而光合細菌具有天然、無毒、無副作用、無汙染、無殘留、安全可靠等特點，光合細菌以光作為能源、能在厭氧光照或好氧黑暗條件下利用自然界中的有機物、硫化物、氨等作為供氫體兼碳源進行光合作用。光合細菌在淨化水質、促進魚蝦生長等方面顯示出強有力的優勢，環境效益十分顯著。光合細菌是自然界中廣泛存在的比較古老的細菌類群，分布於自然界的土壤、水田、沼澤、湖泊、江海等處。經研宄發現，海參生長環境非常適合光合細菌的生存，並且由此得到的光合細菌質量優良。本發明對海參生長環境中光合細菌進行分離並將其製成用於廢水處理微生態製劑，大大改善了水產養殖產品的水體環境。
【發明內容】
[0003]本發明要解決的問題是提供一種從海參生長環境中分離光合細菌及微生態製劑的製備方法，該方法得到光合細菌質量優良，調節養殖水體中化學因子，避免有害細菌和條件致病菌大量滋生，製成的微生態製劑大大改善水產養殖產品的水體環境。
[0004]為解決上述技術問題，本發明採用的技術方案是:
[0005]從海參生長環境中分離光合細菌的方法，包括以下步驟是:
[0006](1)選取海參生長水域的底泥作為試樣，放入容器中；
[0007](2)配置富集培養基似 1.0-3.08，似 0.3-38，(^?) 28040? 3-3邑，18804.7！！20 0.5-2。匕腦及 7-3。匕訓及 2-1 克，05。胞噸。.0025-0.0050邑，？6 8040 ? 005-0.010呂，乙醇2-501,酵母膏0.1-0.5呂，穀氨酸1.0呂，蒸飽水定容至11,調邱至7.5 ；
[0008](3)光合細菌的富集培養:將富集培養基進行高壓蒸汽滅菌，然後將海參生長水域的底泥的樣品置於無菌具塞細頸瓶中，添加經過高壓蒸汽滅菌後的富集培養基11，蓋緊瓶蓋，將細頸瓶置於^^-3001-(}型微電腦光照培養箱中，在光照度為1000?60001狀，溫度為15?301，無氧，至培養基內出現紅色，即獲得光合細菌富集培養菌懸液；
[0009](4)固體分離培養基板3.0-5.0。酵母膏 3.0-6.0。3-1.0。1叻04.7！！20 0.5-1.08，調邱至7.4，加入瓊脂20-22。加水至11 ；
[0010](5)光合細菌的分離:將光合細菌富集培養菌懸液搖床振蕩處理，然後光合細菌富集培養菌懸液滴到固體分離培養基板上，固體分離培養基板上塗布和劃線，將塗布後的固體分離培養基平板倒扣至蓋內，對培養皿邊緣密封，將密封后的培養皿倒置暗處5-7小時後拿出，再倒置於光照培養箱中，於光照度為1000?60001UX，溫度為15?30°C條件下光照厭氧培養；當厭氧培養7天後，平板上長出紅色的小型菌落，挑取單個菌落重複劃線分離多次，至得到細胞形態一致的菌株；
[0011](6)菌種鑑定:對菌株的細胞形態特徵、生理生化特徵和16SrDNA序列進行測定；該菌株屬於深紅紅螺菌種；
[0012](7)擴大培養:將步驟(6)得到的深紅紅螺菌進行搖瓶一級液體擴大培養:將菌體置於1L發酵罐，培養完成後，然後將擴大培養得到的菌體進行二級液體擴大培養，即菌體被放置於100L發酵罐培養，然後得到二級液體擴大培養的菌株。
[0013]所述高壓蒸汽滅菌滅菌條件為:0.103MPa，150°C，30_40min。
[0014]步驟(7)中的1L發酵罐內培養基的組分為=CH3COONa 30.0-32.0g,(NH4)2SO41.0-13.0g, MgS042.0 -4.0g, NaCl 1.0-1.2g，ΚΗ2Ρ043.0-5.0g, Κ2ΗΡ045.0-7.0g,CaCl20.5-1.0g，酵母膏1.0-2.0g，微量元素溶液l_2mL，蒸餾水1L0
[0015]步驟(7)中的100L發酵罐內培養基的組分與1L發酵罐內培養基的組分相同。
[0016]所述微量元素溶液包括以下重量組分:EDTA-2Na 2_3g，FeSO40.2-0.5g，MnCl2.4Η200.1-0.5g，CoCl2.6Η20 0.1-0.3g，ZnCl20.1-0.3g，Na2MoO4.2H20 0.02-0.05g，H3BO30.1-0.4g，蒸餾水 100mLo
[0017]從海參生長環境中分離光合細菌的微生態製劑的製備方法，利用尼龍濾布除去上述方法得到的二級液體擴大培養的菌株中大部分水分，收集菌體細胞，乾燥、粉碎，製備成活的幹菌粉，即得到光合細菌的微生態製劑。
[0018]本發明得到深紅紅螺菌產量高、質量優良，可以用於調節養殖水體中化學因子，避免有害細菌和條件致病菌大量滋生，製成的微生態製劑大大改善水產養殖產品的水體環境。深紅紅螺菌在沒有有機物的條件下，可利用光能，固定二氧化碳固定有機物；在有有機物的條件下，又可以利用有機物進行生長。深紅紅螺菌能將養魚水中的殘餌、排洩物等完全分解，具有改善水產養殖生態環境，降低氨氮、BOD的優點。作為魚、蝦、蟹育苗開口餌料，可以增加營養，提高成活率。本發明得到的深紅紅螺菌既不像好氧微生物那樣受汙水中溶解氧濃度的限制，可以利用光能進行高效的能量代謝，既使是微弱的光照也能進行，同時也可以在有氧條件下分解有機物。菌種來自海參生長環境的生化系統中，自身具有多樣性及較強的適應能力，其對廢水中其他汙染物也有較好的去除能力。
【具體實施方式】
[0019]實施例1
[0020]從海參生長環境中分離光合細菌的方法，包括以下步驟是:
[0021](I)選取海參生長水域的底泥作為試樣，放入容器中；
[0022](2)配置富集培養基:CH3COONa 1.0g, CH3CH2COONa 0.3g，(NH4)2SO40.3g,MgSO4.7H20 0.5g，K2HPO40.7g, K2HPO40.3 克，CaCl20.05g，MnSO40.0025g，FeSO40.005-0.010g，乙醇2_5mL，酵母膏0.1-0.5g，穀氨酸1.0g,蒸飽水定容至1L，調pH至7.5 ；
[0023](3)光合細菌的富集培養:富集培養基在0.1031？^ 1501:條件下高壓蒸汽滅菌30-40-1然後將海參生長水域的底泥的樣品置於無菌具塞細頸瓶中，添加經過高壓蒸汽滅菌後的富集培養基1匕蓋緊瓶蓋，將細頸瓶置於^^-3001-(}型微電腦光照培養箱中，在光照度為1000?60001狀，溫度為15?301:，無氧，至培養基內出現紅色，即獲得光合細菌富集培養菌懸液；
[0024](4)固體分離培養基板3.08，酵母膏 3.08，0^1辦 38，1叻04 ? 7！！200.58，調邱至7.4，加入瓊脂20。加水至11 ；
[0025](5)光合細菌的分離:將光合細菌富集培養菌懸液搖床振蕩處理，然後光合細菌富集培養菌懸液滴到固體分離培養基板上，固體分離培養基板上塗布和劃線，將塗布後的固體分離培養基平板倒扣至蓋內，對培養皿邊緣密封，將密封后的培養皿倒置暗處5-7小時後拿出，再倒置於光照培養箱中，於光照度為1000?60001狀，溫度為15?301:條件下光照厭氧培養；當厭氧培養7天後，平板上長出紅色的小型菌落，挑取單個菌落重複劃線分離多次，至得到細胞形態一致的菌株；
[0026](6)菌種鑑定:對菌株的細胞形態特徵、生理生化特徵和16&'0嫩序列進行測定；該菌株屬於深紅紅螺菌種；
[0027](7)將步驟(6)得到的深紅紅螺菌進行搖瓶一級液體擴大培養:將菌體置於101發酵罐，培養完成後，然後將擴大培養得到的菌體進行二級液體擴大培養，即菌體被放置於1001發酵罐培養，然後得到二級液體擴大培養的菌株；
[0028]其中，10[發酵罐內培養基的組分為30.08，(順丨挪。.08，1叻042丨08，就1 1.08，狃2？043丨08，舊?。# 08，0^1^ 58，酵母膏1.08，微量元素溶液1-21^，蒸餾水 101。
[0029]步驟(7)中的100[發酵罐內培養基的組分與10[發酵罐內培養基的組分、含量均相同。
[0030]所述微量元素溶液包括以下重量組分:201八-2版1 28，？630及28，1冗12 ?祖200.18，00012.6！！20 0.1。211?:120^ 1。琴。04.2！！20 0.02。比80辦 1邑，從海參生長環境中分離光合細菌的微生態製劑的製備方法，利用尼龍濾布除去上述方法得到的二級液體擴大培養的菌株中大部分水分，收集菌體細胞，乾燥、粉碎，製備成活的幹菌粉，即得到光合細菌的微生態製劑。
[0031]實施例2
[0032]從海參生長環境中分離光合細菌的方法，包括以下步驟是:
[0033](1)選取海參生長水域的底泥作為試樣，放入容器中；
[0034]⑵配置富集培養基2.08，⑶0似1.⑶230山 58，18804.7！！20 1.2。匕腳山 2。尺2腦辦 7 克，05。胞噸。.0035。？63040^ 007^，乙醇311^，酵母膏0.3仏穀氨酸1.0仏蒸飽水定容至11，調邱至7.5。
[0035](3)光合細菌的富集培養:將富集培養基在0.1031？^ 1501:條件下進行高壓蒸汽滅菌30-40-1然後將海參生長水域的底泥的樣品置於無菌具塞細頸瓶中，添加經過高壓蒸汽滅菌後的富集培養基1匕蓋緊瓶蓋，將細頸瓶置於^^-3001-(}型微電腦光照培養箱中，在光照度為1000?60001狀，溫度為15?301:，無氧，至培養基內出現紅色，即獲得光合細菌富集培養菌懸液；
[0036](4)固體分離培養基板:CH3COONa 4.0g，酵母膏 5.0g, CaCl20.7g，MgSO4.7H200.7g，調pH至7.4，加入瓊脂21g，加水至1L。
[0037](5)光合細菌的分離:將光合細菌富集培養菌懸液搖床振蕩處理，然後光合細菌富集培養菌懸液滴到固體分離培養基板上，固體分離培養基板上塗布和劃線，將塗布後的固體分離培養基平板倒扣至蓋內，對培養皿邊緣密封，將密封后的培養皿倒置暗處5-7小時後拿出，再倒置於光照培養箱中，於光照度為1000?60001UX，溫度為15?30°C條件下光照厭氧培養；當厭氧培養7天後，平板上長出紅色的小型菌落，挑取單個菌落重複劃線分離多次，至得到細胞形態一致的菌株；
[0038](6)菌種鑑定:對菌株的細胞形態特徵、生理生化特徵和16SrDNA序列進行測定；該菌株屬於深紅紅螺菌種。
[0039](7)將步驟(6)得到的深紅紅螺菌進行搖瓶一級液體擴大培養:將菌體置於1L發酵罐，培養完成後，然後將擴大培養得到的菌體進行二級液體擴大培養，即菌體被放置於100L發酵罐培養，然後得到二級液體擴大培養的菌株。
[0040]其中，1L發酵罐內培養基的組分為=CH3COONa31.0g, (NH4)2SO412.0g,MgS043.0g,NaCl 1.lg, KH2P044.0g, K2HP046.0g, CaCl20.7g，酵母膏 1.5g，微量元素溶液 lmL，蒸餾水1L0
[0041]步驟(7)中的100L發酵罐內培養基的組分與1L發酵罐內培養基的組分相同。
[0042]微量元素溶液包括以下重量組分:EDTA-2Na2g，FeSO40.2g，MnCl2.4H20 0.lg，CoCl2.6H20 0.lg, ZnCl20.lg, Na2MoO4.2H20 0.02g，H3BO30.lg。
[0043]從海參生長環境中分離光合細菌的微生態製劑的製備方法，利用尼龍濾布除去上述方法得到的二級液體擴大培養的菌株中大部分水分，收集菌體細胞，乾燥、粉碎，製備成活的幹菌粉，即得到光合細菌的微生態製劑。
[0044]實施例3
[0045]從海參生長環境中分離光合細菌的方法，包括以下步驟是:
[0046](I)選取海參生長水域的底泥作為試樣，放入容器中；
[0047](2)配置富集培養基:CH3C00Na 3.0g, CH3CH2COONa 3g，(NH4) 2S043g，MgSO4.7H202g，K2HP043g，K2HPO4I 克，CaCl20.05g，MnSO40.0050g，FeSO40.010g，乙醇 2_5mL，酵母膏 0.5g，穀氨酸1.0g,蒸飽水定容至1L，調pH至7.5。
[0048](3)光合細菌的富集培養:將富集培養基在0.103MPa，150°C條件下進行高壓蒸汽滅菌30-40min，然後將海參生長水域的底泥的樣品Ig置於無菌具塞細頸瓶中，添加經過高壓蒸汽滅菌後的富集培養基1L，蓋緊瓶蓋，將細頸瓶置於SPX-3001-G型微電腦光照培養箱中，在光照度為1000?60001UX，溫度為15?30°C，無氧，至培養基內出現紅色，即獲得光合細菌富集培養菌懸液；
[0049](4)固體分離培養基板！CH3COONa 5.0g，酵母膏6.0g,CaCl2L OgjMgSO4.7Η201.0g,調pH至7.4，加入瓊脂22g，加水至1L。
[0050](5)光合細菌的分離:將光合細菌富集培養菌懸液搖床振蕩處理，然後光合細菌富集培養菌懸液滴到固體分離培養基板上，固體分離培養基板上塗布和劃線，將塗布後的固體分離培養基平板倒扣至蓋內，對培養皿邊緣密封，將密封后的培養皿倒置暗處5-7小時後拿出，再倒置於光照培養箱中，於光照度為1000?60001狀，溫度為15?301:條件下光照厭氧培養；當厭氧培養7天後，平板上長出紅色的小型菌落，挑取單個菌落重複劃線分離多次，至得到細胞形態一致的菌株；
[0051](6)菌種鑑定:對菌株的細胞形態特徵、生理生化特徵和16&'0嫩序列進行測定；該菌株屬於深紅紅螺菌種。
[0052](7)將步驟(6)得到的深紅紅螺菌進行搖瓶一級液體擴大培養:將菌體置於101發酵罐，培養完成後，然後將擴大培養得到的菌體進行二級液體擴大培養，即菌體被放置於1001發酵罐培養，然後得到二級液體擴大培養的菌株。
[0053]所述高壓蒸汽滅菌滅菌條件為:0.1031？3，150。0，30-40111111。
[0054]步驟⑵中的10[發酵罐內培養基的組分為32.(順》230413丨08，1叻044 08，就1 1.28，狃2？045丨08，切？047^ 08，08，酵母膏2.08，微量元素溶液2齓，蒸餾水101。
[0055]步驟(7)中的100[發酵罐內培養基的組分與10[發酵罐內培養基的組分相同。
[0056]所述微量元素溶液包括以下重量組分:201八-2版1 38，？630及58，1冗12 ?祖20
0.58，00012.6！！20 0.3。211?:120^ 3。琴。04.2！！20 0.05。只風。.48，蒸餾水 10001
[0057]從海參生長環境中分離光合細菌的微生態製劑的製備方法，利用尼龍濾布除去上述方法得到的二級液體擴大培養的菌株中大部分水分，收集菌體細胞，乾燥、粉碎，製備成活的幹菌粉，即得到光合細菌的微生態製劑。
[0058]以上對本發明的三個實施例進行了詳細說明，但所述內容僅為本發明的較佳實施例，不能被認為用於限定本發明的實施範圍。凡依本發明申請範圍所作的均等變化與改進等，均應仍歸屬於本發明的專利涵蓋範圍之內。
【權利要求】
1.從海參生長環境中分離光合細菌的方法，其特徵在於:包括以下步驟是: (I)選取海參生長水域的底泥作為試樣，放入容器中； ⑵配置富集培養基:CH3COONal.0-3.0g, CH3CH2COONa0.3_3g，(NH4)2SO40.3_3g，MgSO4.7Η200.5-2g，K2HPO40.7_3g，K2HPO40.2-1 克，CaCl20.05g，MnSO40.0025-0.0050g，FeSO40.005-0.010g，乙醇2_5mL，酵母膏0.1-0.5g，穀氨酸1.0g,蒸飽水定容至1L，調pH至7.5 ； (3)光合細菌的富集培養:將富集培養基進行高壓蒸汽滅菌，然後將海參生長水域的底泥的樣品Ig置於無菌具塞細頸瓶中，添加經過高壓蒸汽滅菌後的富集培養基1L，蓋緊瓶蓋，將細頸瓶置於SPX-3001-G型微電腦光照培養箱中，在光照度為1000?60001ux，溫度為15?30°C，無氧，至培養基內出現紅色，即獲得光合細菌富集培養菌懸液； (4)固體分離培養基板:CH3C00Na3.0-5.0g，酵母膏 3.0-6.0g, CaCl20.3-1.0g,MgSO4.7Η200.5-1.0g,調 pH 至 7.4，加入瓊脂 20_22g，加水至 IL ； (5)光合細菌的分離:將光合細菌富集培養菌懸液搖床振蕩處理，然後光合細菌富集培養菌懸液滴到固體分離培養基板上，固體分離培養基板上塗布和劃線，將塗布後的固體分離培養基平板倒扣至蓋內，對培養皿邊緣密封，將密封后的培養皿倒置暗處5-7小時後拿出，再倒置於光照培養箱中，於光照度為1000?60001UX，溫度為15?30°C條件下光照厭氧培養；當厭氧培養7天後，平板上長出紅色的小型菌落，挑取單個菌落重複劃線分離多次，至得到細胞形態一致的菌株； (6)菌種鑑定:對菌株的細胞形態特徵、生理生化特徵和16SrDNA序列進行測定；該菌株屬於深紅紅螺菌種； (7)擴大培養:將步驟(6)得到的深紅紅螺菌進行搖瓶一級液體擴大培養:將菌體置於1L發酵罐，培養完成後，然後將擴大培養得到的菌體進行二級液體擴大培養，即菌體被放置於100L發酵罐培養，然後得到二級液體擴大培養的菌株。
2.根據權利要求1所述的從海參生長環境中分離光合細菌的方法，其特徵在於:所述高壓蒸汽滅菌滅菌條件為:0.103MPa，150°C，30_40min。
3.根據權利要求1所述的從海參生長環境中分離光合細菌的方法，其特徵在於:步驟⑵中的1L發酵罐內培養基的組分為:CH3C00Na30.0-32.0g, (NH4)2SO41.0-13.0g,MgS042.0-4.0g, NaCl1.0-1.2g，ΚΗ2Ρ043.0-5.0g, Κ2ΗΡ045.0-7.0g, CaCl20.5-1.0g，酵母膏1.0-2.0g，微量元素溶液l-2mL，蒸飽水10L。
4.根據權利要求1所述的從海參生長環境中分離光合細菌的方法，其特徵在於:步驟(7)中的100L發酵罐內培養基的組分與10L發酵罐內培養基的組分相同。
5.根據權利要求1所述的從海參生長環境中分離光合細菌的方法，其特徵在於:所述微量元素溶液包括以下重量組分:EDTA-2Na2-3g，FeSO40.2-0.5g，MnCl2.4H200.1-0.5g，CoCl2.6Η200.1-0.3g，ZnCl20.1-0.3g，Na2MoO4.2H200.02-0.05g，H3BO30.1-0.4g，蒸餾水100mL0
6.製備如權利要求1所述的從海參生長環境中分離光合細菌的微生態製劑的方法，其特徵在於:利用尼龍濾布除去上述方法得到的二級液體擴大培養的菌株中大部分水分，收集菌體細胞，乾燥、粉碎，製備成活的幹菌粉，即可得到光合細菌的微生態製劑。
【文檔編號】C12R1/01GK104480050SQ201410847816
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年12月31日 優先權日:2014年12月31日
【發明者】季延濱, 孫學亮 申請人:天津市茂林水產養殖有限公司