集落形成刺激因子的製造方法

2023-06-12 14:36:46 1

專利名稱:集落形成刺激因子的製造方法
本發明是關於以高收率，高純度含有集落形成刺激因子(以下簡稱CSF)的人尿中回收CSF的方法。
CSF是以極微量存在於人尿中的生理活性物質，是作用於骨髓中前驅細胞促進白血球組成細胞處的顆粒球及單球巨噬細胞分裂、增殖的糖蛋白，可期望有治療白血球降低症的藥效。
作為CSF的精製方法有採用吸附劑的方法，陰離子交換體的方法及採用超濾膜的方法等。
在人尿中由於CSF含量極微，使CSF有效地分離、濃縮和精製是困難的。例如以往經常採用的使矽酸鹽、硅藻土等礦物與尿接觸，吸附CSF，然後使CSF溶出的方法，利用各種陰離子交換色譜來回收的方法。它們的缺點是操作複雜，且因一次所能處理的尿也有限，大量回收微量或分CSF，其成本必然很高。
例如，在採用各種陰離子交換體的色譜法中，柱體法的吸附劑的填充及分批法的利用過濾或離心分離回收吸附等操作都是很複雜的，因而，它們作為大規模有效獲取CSF的方法是有缺點的。
再者，尿中有許多雜質，採用以往的方法，這些雜質很容易與CSF一起被回收，這對後續的精製工序是十分不利的。
本發明的目的就是提供一種從含有微量的來自尿的CSF，並且含有許多雜質的溶液中以高收率，高純度，低成本且操作簡單的回收，製造CSF的方法。
本發明的目的是提供一種精製來自人尿中的集落形成刺激因子的方法，其特徵是將以纖維素來為基質的片狀原料捲成螺旋狀結構，製成濾筒，作為陽離子交換體，用這種陰離子交換體來處理含有來自人尿的集落形成刺激因子的溶液。
本發明中所用的含CSF的溶液，並不只限於CSF的水溶液，例如含微量CSF旦有大量雜質的尿液等也可應用。
作為陰離子交換體，如二乙氨乙基-葡聚糖凝膠，季銨乙基(QAE基)-葡聚糖凝膠、二乙氨乙基-纖維素、季銨乙基-纖維素、二乙氨乙基-セファロ-ス，二乙氨乙基-セファセル，スフェロッル-DEA等均可採用，但最好採用含有陰離子交換基的纖維素為基質的片狀原料捲成螺旋形，製成濾筒，較為有利。
將通用載體(如纖維素，葡聚糖瓊脂糖)用乙烯聚合物交聯，再導入季銨乙基，二乙氨乙基(DEAE基)，三乙氨乙基(TEAE基)，氨乙基(AE基)，胍基乙基(GE基)等(離子交換基體參閱圖1)，將其捲成螺旋狀即可製成上述結構的濾筒。其最好形狀如圖2所示。在圖2中，1為離子交換基體(層厚0.1-1mm)，2為透水性支持體(層厚0.1-1mm)，該支持體最好採用網格狀或編織狀，其材料可採用如聚苯乙烯、尼龍、聚碳酸酯、聚縮醛、聚四氟乙烯樹脂、不鏽鋼等。
圖3是使用該結構的精製方法實施例的一個剖面圖，從入口3進入的CSF液體，從外圍向中心部4聚集，從出口5排出。箭頭所指為CSF液的流動方向，6為放氣孔，7為排出口。圖4為橫截面圖，為從外圍進入的CSF液體向中心聚集的狀態。
作為本發明的使用條件，含CSF的液體最好在pH值為5～7，導電度為20ms/cm(25℃)以下經過圓筒，而使CSF被吸附。在這樣的條件下，CSF被吸附，大部分雜質不被吸附而直接通過。然後，用pH為5～7的稀鹽溶液〔例如導電度為20ms/cm(25℃)以下的磷酸緩衝溶液〕洗滌。用這種洗滌操作，可進一步除去雜質，而CSF仍原樣吸附而殘留下來。
為使吸附的CSF溶出，通入pH為5～9的濃鹽溶液〔例如導電度為30ms/cm(25℃)以上的磷酸緩衝劑，食鹽溶液〕就很容易地達到目的。
在本發明中，最好進一步利用起濾膜進行處理。超濾膜的處理，在前述陰離子交換體處理前進行。
作為超濾膜，最好採用能除去較CSF小的低分子物質的超濾膜(即用於分離低分子量者)及能除去比CSF大的高分子物質的超濾膜(即用於分離高分子量者)中的一種，或兩種都用。用作分離低分子量者，通常採用1×104～4×104道爾頓的超濾膜。用作分離高分子量者，通常用105～106道爾頓的超濾膜。作為超濾膜，最好採用聚丙烯腈類超濾膜和聚碸類超濾膜及纖維素系超濾膜等。
含有CSF的溶液，通過超濾膜時的條件通常為處理液的pH值為5～8操作壓力為1～5kg/cm2本發明的超濾膜處理法，可用於CSF的回收、製取中的任一工序，但最好先用分離低分子量的超膜濾膜進行處理，然後再用分離高分子量的超濾膜進行處理。
這樣一來，回收的CSF，最好進一步採用已知的高精度精製手段(如親和色譜法、凝膠過濾法等)處理。並加熱(如在50～80℃加熱1～10小時)滅菌，然後，冷凍乾燥，經這樣處理後，可用作醫療用CSF製劑。當然，也可不進行冷凍乾燥，而採用已知的手段進行分離、精製。
採用本發明可高純度，高收率回收CSF。並且可以獲得比活性高、除去了發熱原的CSF。再者，與已有的方法相比，具有簡易、效率高的操作性和經濟性。
為了更詳細地說明本發明，特舉出如下的實施例，但本發明並不只限於這些。
實施例1
用聚丙烯腈超濾膜(可分去分子量＜20000部分)除去50l新鮮尿中的低分子量雜質後，濃縮至1l。
然後使此濃縮液通過AMF公司製造的Zetaprep季銨乙基-濾筒R250，該筒是用預先製備的0.05M的磷酸緩衝液〔pH為6.5，導電度為8.5ms/cm(25℃)〕進行平衡處理後而製成的。CSF流經該筒時被吸附。
接著將此季銨乙基筒用0.05M的磷酸緩衝液(pH為6.5)充分洗滌後，用含1.0M NaCl的0.05M磷酸緩衝液(pH為6.5)〔導電度為8.5ms/cm(25℃)〕溶出，就可得到含CSF的溶液。再者，為了對比，另將新鮮尿50l稀釋且四倍後，再加入用0.05M磷酸緩衝液(pH6.5)平衡後的二乙氨乙基纖維素100g，攪拌一小時使之吸附，進行與上面相同的洗滌、溶出，可得到含CSF的溶出液。
關於這些溶出液，分別測定它們的CSF活性，求出它們的比活性及回收率，其結果示於表1-1及1-2。
再者，CSF的活性是採用利用單層瓊脂平板法的集落形成法測定的，單層瓊脂平板法用的是C57BL/6N鼠骨髓細胞。即用含2%(體積比)牛血清的蒸餾水將試料適當稀釋，除菌過濾後(0.45μ膜過濾器)，將上述溶液以0.1ml分別滴入三個表面皿中，再在其中加入含有0.3%(重)的瓊脂、20%(容積)的牛胎血清及含C57BL/6N鼠骨髓細胞10個的Mc Coy′s 5A培養基溶液1ml，充分混合以後，在處於含7.5%(容積)二氧化碳的氣氛下的孵化器中，在37℃下培養七天。培養後在顯微鏡下測定由50個以上的細胞組成的集落的個數，用形成的集落數來表示CSF的活性，即，以每形成一個集落表示CSF一個活性單位。
如表1-1及表1-2所示，本發明與過去採用的方法相比，由於採用了超濾膜進行精製，預先除去雜質，因而雖然回收率相同，但比活性(純度)提高十多倍以上。
再者，以往所採用的方法，在吸附時，由於利用稀釋的辦法來調整異電度，從而使液體量增加;與此相反，本發明的方法，由於引入了超濾膜精製作為預處理，因而使液體量少量化，同時使導電度調整既簡單易行，又可提高後工序利用陰離子交換體處理時的操作性能，也能改善作業效率。再者，由於引入的超濾設備是濾筒型，可進一步提高採用陰離子交換體色譜法時的作業性能。
表1-1本發明的數據CSF試料名稱比活性，U/E280nm 回收率，%尿 3.0 100濃縮液 72 88季銨乙基- 7500 84筒溶出的液體表1-2以前方法的數據CSF試料名稱比活性，U/E280nm 回收率，%尿 3.0 100二乙氨乙基- 350 84.8纖維素溶出液實施例2用聚碸類的平板狀超濾膜(可分去分子量＞1000000部分)，將含有CSF的溶液4000ml進行分離，循環過濾4000ml溶液需三十分鐘。
然後，與實施例1相同，採用季銨乙基-筒進行離子交換色譜法的分離。
對過濾前的液體，過濾後的液體及季銨乙基-筒溶出液體採用實施例1的方法，測定CSF活性，然後求出總活性，比活性及回收率。再根據第九次修訂的日本藥典，利用兔子測定發熱原的去除效率，其結果示於表2。
如表2所示，可以高回收率來回收CSF，同時也提高了比活性(純度)。再者，關於CSF，由於用超濾膜除去阻塞物質，所以也提高了活性。
再者，在除去發熱原方面，也有明顯的效果。
表2發熱原實驗試料名稱 (上升溫比活性U/E280nm 回收率，% 度，℃)過濾前液體 6500 100 0.6，0.8，0.7合計2.1過濾後液體 21000 135.2 0.2，0.3，0.1合計0.6季銨乙基- 85000 118 0，0，0.1筒溶出液 合計0.1
附圖的簡單說明第1圖為將含有陰離子交換基的片狀原料捲成螺旋體狀後的結構簡圖;
第2圖為上述結構的橫截面圖;
第3圖為將片狀原料捲成螺旋狀後的陰離子交換體的一個實施例的垂直截面圖;
第4圖為上述實施例的橫截面圖。
其中C-載體;
P-乙烯聚合物;
Q-季銨乙基或二乙氨乙基;
1-離子交換基體;
2-透水性支持體;
3-入口;
4-中心部;
5-出口;
6-放氣孔;
7-排出口。
權利要求
來自人尿的集落形成刺激因子的精製方法，其特徵在於該方法是將以纖維素為基質的片狀原料捲成螺旋狀結構，製成濾筒型陰離子交換體，用這種交換體來處理含有來自人尿的集落形成刺激因子的溶液，進一步還要用至少能除去下列兩種物質之一的超濾膜來處理上述溶液；即比集落形成刺激因子分子量小的低分子物質和比集落形成刺激因子分子量大的高分子物質。
專利摘要
來自人尿的集落形成刺激因子的精製方法。該方法是將以纖維素為基質的片狀材料捲成螺旋狀結構，製成濾筒型陰離子交換體。用該交換體處理含有來自人尿的集落形成刺激因子的溶液，進一步還要用至少能除去比集落形成刺激因子分子量大的物質和比集落形成刺激因子分子量小的物質兩者之一的超濾膜來處理上述溶液。該方法可以高純度、高收率回收、比活性高且除去發熱原的CSF。與已有方法相比，該方法操作簡單，效率高，且經濟效益好。
文檔編號C07K14/435GK86107102SQ86107102
公開日1987年8月12日 申請日期1986年10月17日
發明者森本和郎, 河富芳明, 川野武彥, 西田正行 申請人:株式會社綠十字, 森永乳業株式會社導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan