一種新的大鼠類風溼性關節炎的造模方法與流程

2023-06-12 09:36:01 1

本發明提供一種新的大鼠類風溼性關節炎的造模方法，屬於生物技術領域。

背景技術：

類風溼關節炎（Rheumatoid Arthritis，RA）是一類慢性炎性自身免疫性疾病，在全世界的發病率約為1%。RA動物模型可以模擬RA的發病，提供了RA的病理學、遺傳學及分子生物學等資料，為研究RA的發病機制及治療策略發揮了重要作用。因此，動物模型被廣泛應用於RA的研究和新藥研發當中。目前，用於研究RA的動物模型有多種，包括膠原誘導關節炎（collagen type II induced arthritis，CIA）、佐劑誘導關節炎(adjuvant arthritis，AA)、鏈球菌細胞壁誘導關節炎、降植焼誘導關節炎和蛋白聚糖誘導關節炎等。這些動物模型都存在不同程度的缺陷，存在個體造模穩定性低、批次間一致性差、造模成功率低等方面的問題，對研究結果造成很大的影響。

伯氏疏螺旋體是萊姆病的病原體，感染伯氏疏螺旋體後引起的慢性炎性萊姆關節炎可以導致關節軟骨和骨質的破壞，進而造成永久的關節功能障礙。伯氏疏螺旋體蛋白的整體或部分可激活Toll樣受體-2(Toll like receptor2，TLR2)和Toll樣受體-4(Toll like receptor4，TLR-4)，活化關節組織內巨隨細胞進而釋放炎性細胞因子，開始炎症反應。此後，螺旋體抗原被巨噬細胞加工處理後，提呈給CD4+T細胞並引起後者的活化。活化的CD4+T細胞可發揮細胞免疫反應並釋放多種細胞因子，進而加重關節炎症並最終導致慢性關節炎。

寡核苷酸CGCpGGC是一種新型DNA佐劑，是Toll樣受體9（Toll like receptor9，TLR9）的一個較強的激動劑，可以刺激免疫T細胞分泌TNF-α、IL-1、IL-6等多種細胞因子和炎性介質以產生炎症反應。所以，寡核苷酸CGCpGGC可以協同伯氏疏螺旋體蛋白，在誘導大鼠類風溼性關節炎中發揮重要的作用，成為製備大鼠類風溼性關節炎動物模型的一種有效成分。

不完全弗氏佐劑是用於製備免疫原的油包水乳液，可輔助抗原刺激機體出現高效長期的抗體應答，但單獨使用其免疫大鼠並不能誘導出理想的關節炎模型。

基於此，本發明應用重組伯氏疏螺旋體P100蛋白、加上寡核苷酸CGCpGGC，結合不完全弗氏佐劑免疫Lewis大鼠，建立一種新的、穩定、高效造模的RA動物模型。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種新的大鼠類風溼性關節炎的造模方法，達到穩定高效的製備大鼠類風溼性關節炎動物模型的目的。

本發明提供的一種在Lewis大鼠中製備RA動物模型的方法，其技術解決方案如下：

1）使用超聲波細胞粉碎儀將終濃度為5-10mg/mL的重組伯氏疏螺旋體P100蛋白、終濃度為1-3mg/mL的CGCpGGC寡核苷酸與不完全弗氏佐劑混勻，製成全菌蛋白乳化液，37℃內孵育20分鐘（min）後待用；

試驗組為18隻Lewis大鼠，將製備的0.1-0.25mL全菌蛋白乳化液在大鼠右足足邸皮內注射，2周（w）後以0.1-0.25mL的全菌蛋白乳化液腹腔注射，加強免疫1次。對照組為18隻Lewis大鼠，以相同的程序注射0.25mL，0.85% NaCl；

在造模後第16天（d），試驗組大鼠RA造模成功率為88.89%以上，病變關節病理顯示關節滑膜増生，炎細胞浸潤，軟骨組織及骨組織侵蝕，呈典型的關節炎病變。對照組大鼠沒有出現任何症狀和病理變化；

2）外觀評分：

於造模後第6d、8d、10d、12d、14d、16d，採用關節炎指數(arthritis index，AI)評分法對關節腫脹程度及活動度進行評分，具體如下：

（1）0分,無任何改變；

（2）1分,僅足趾關節發病,包括皮膚變紅,輕度腫脹；

（3）2分,足趾關節和足巧部均發病,包括皮膚變紅,中度腫脹；

（4）3分,踝關節以下發病,包括皮膚變紅,重度腫脹；

（5）4分,包括踝關節在內全部紅腫,伴關節強直及活動受限；

造模後第16d，試驗組大鼠的關節出現明顯紅腫，足部及踝關節腫脹最為明顯，足趾成鼓捶狀，且病變呈對稱性；不能負重，行走困難。外觀評分為3-4分。對照組大鼠無任何改變；

3）測量足蹠部腫脹率：

在每隻大鼠踝關節上緣劃線做標記，於造模後第0d，2d，4d，6d，8d，10d，12d，14，16d用足趾容積測量儀測量對側腳踝關節及其以下體積，詳細記錄並計算足蹠部腫脹率。計算方法：

足蹠部腫脹率(%)=(造模後第nd大鼠踝關節及其以下體積-造模後第0d踝關節及其以下體積)/造模後第0d踝關節及其以下體積×100%

其中，n表示測量時間點；

造模後第16d，試驗組大鼠的足蹠部腫脹率在63-78%，存在明顯的改變。對照組大鼠無任何改變；

4）HE染色及病理學評價：

（1）標本收集：將大鼠斷頸處死，切下注射對側足踝關節，剔除皮膚和肌肉組織，10%中性福馬林固定2-3d；

（2）標本脫鈣、石蠟包埋及切片：將標本放入22倍體積的脫鈣液中,置於恆溫水浴箱保持37℃，每日振蕩脫鈣液1-2次，每10天更換一次脫鈣液，脫鈣5-7周；標本切割後脫水，石蠟包埋，常規切片；

（3）蘇木素-伊紅（hematoxylin eosin，HE）染色：

①二甲苯脫蠟5min,吸水紙吸乾液體。二甲苯第二次脫蠟lOmin至切片透明,吸水紙吸乾液體；

②無水乙醇浸潤5min；無水乙醇第二次浸潤5min；95%乙醇浸潤3min；流水2min,用吸水紙吸乾水分；

③蘇木素染色,4到8min，流水衝洗5min；

④1%鹽酸水溶液分化5-10s(切片由藍變紅)，流水洗返藍15-30min；

⑤0.5%伊紅(水溶性)染色,30s-1min；

⑥95%乙醇脫水5min，95%乙醇第二次脫水5min；

⑦二甲苯透明2-3min，二甲苯透明5min；

⑧中性樹膠封片，鏡下觀察結果,拍攝病理圖片；

（4）病理學評價：

HE染色後觀察關節周圍炎症、滑膜增生、血管翳形成及軟骨下骨質破壞程度，對病理改變進行描述；病理損傷評分分為5級：0分，正常；1分，輕微局部炎性細胞浸潤；2分，中度炎性細胞浸澗；3分，重度炎性細胞浸潤，無軟骨損傷、血管翳形成；4分，重度炎性細胞浸潤並伴有血管翳形成和(或)軟骨、骨質破壞；

在造模後第16d，試驗組大鼠病理評價分數為3-4分，病變關節病理顯示關節滑膜増生，炎細胞浸潤，軟骨組織及骨組織侵蝕，呈典型的關節炎病變。對照組大鼠沒有病理損傷和病理變化。

本發明的積極效果在於：

在傳統的不完全弗氏佐劑的基礎上，將重組伯氏疏螺旋體P100蛋白和CGCpGGC寡核苷酸結合在一起，用於Lewis大鼠的類風溼動物模型的造模實驗，建立一種穩定高效的新的造模方法，造模的成功率為88.89%以上，為研究和開發類風溼性關節炎的治療藥物打下基礎。

具體實施方式

為了便於理解本發明，特例舉以下實施例。其作用被理解為是對本發明的闡釋而非對本發明的任何形式的限制。

實施例1

1）使用超聲波細胞粉碎儀將終濃度為5mg/mL的重組伯氏疏螺旋體P100蛋白、終濃度為1mg/mL的CGCpGGC寡核苷酸與不完全弗氏佐劑混勻，製成全菌蛋白乳化液，37℃內孵育20分鐘（min）後待用；

試驗組為18隻Lewis大鼠，將製備的0.1mL全菌蛋白乳化液在大鼠右足足邸皮內注射，2周（w）後以0.1mL的全菌蛋白乳化液腹腔注射，加強免疫1次。對照組為18隻Lewis大鼠，以相同的程序注射0.25mL，0.85% NaCl；

在造模後第16d，試驗組大鼠RA造模成功率為86.66%，病變關節病理顯示關節滑膜増生，炎細胞浸潤，軟骨組織及骨組織侵蝕，呈典型的關節炎病變；對照組大鼠沒有出現任何症狀和病理變化；

2）外觀評分：

於造模後第6d、8d、10d、12d、14d、16d，採用關節炎指數(arthritis index，AI)評分法對關節腫脹程度及活動度進行評分，具體如下：

（1）0分,無任何改變；

（2）1分,僅足趾關節發病,包括皮膚變紅,輕度腫脹；

（3）2分,足趾關節和足巧部均發病,包括皮膚變紅,中度腫脹；

（4）3分,踝關節以下發病,包括皮膚變紅,重度腫脹；

（5）4分,包括踝關節在內全部紅腫,伴關節強直及活動受限；

造模後第16d，試驗組大鼠的關節出現明顯紅腫，足部及踝關節腫脹最為明顯，足趾成鼓捶狀，且病變呈對稱性；不能負重，行走困難；外觀評分為3.12±0.38分；對照組大鼠無任何改變；

3）測量足蹠部腫脹率：

在每隻大鼠踝關節上緣劃線做標記，於造模後第0d，2d，4d，6d，8d，10d，12d，14，16d用足趾容積測量儀測量對側腳踝關節及其以下體積，詳細記錄並計算足蹠部腫脹率。計算方法：足蹠部腫脹率(%)=(造模後第nd大鼠踝關節及其以下體積-造模後第0d踝關節及其以下體積)/造模後第0d踝關節及其以下體積×100%，（n表示測量時間點）

造模後第16d，試驗組大鼠的足蹠部腫脹率68%，存在明顯的改變；對照組大鼠無任何改變。

4）HE染色及病理學評價：

（1）標本收集：將大鼠斷頸處死，切下注射對側足踝關節，剔除皮膚和肌肉組織，10%中性福馬林固定2-3d；

（2）標本脫鈣、石蠟包埋及切片：將標本放入22倍體積的脫鈣液中,置於恆溫水浴箱保持37℃，每日振蕩脫鈣液1-2次，每10天更換一次脫鈣液，脫鈣5-7周；標本切割後脫水，石蠟包埋，常規切片；

（3）蘇木素-伊紅（hematoxylin eosin，HE）染色：

①二甲苯脫蠟5min,吸水紙吸乾液體。二甲苯第二次脫蠟lOmin至切片透明,吸水紙吸乾液體；

②無水乙醇浸潤5min；無水乙醇第二次浸潤5min；95%乙醇浸潤3min；流水2min,用吸水紙吸乾水分；

③蘇木素染色,4到8min，流水衝洗5min；

④1%鹽酸水溶液分化5-10s(切片由藍變紅)，流水洗返藍15-30min；

⑤0.5%伊紅(水溶性)染色,30s-1min；

⑥95%乙醇脫水5min，95%乙醇第二次脫水5min；

⑦二甲苯透明2-3min，二甲苯透明5min；

⑧中性樹膠封片，鏡下觀察結果,拍攝病理圖片；

（4）病理學評價：

HE染色後觀察關節周圍炎症、滑膜增生、血管翳形成及軟骨下骨質破壞程度，對病理改變進行描述。病理損傷評分分為5級：0分，正常；1分，輕微局部炎性細胞浸潤；2分，中度炎性細胞浸澗；3分，重度炎性細胞浸潤，無軟骨損傷、血管翳形成；4分，重度炎性細胞浸潤並伴有血管翳形成和(或)軟骨、骨質破壞；

在造模後第16d，試驗組大鼠病理評價分數為3.36±0.22分，病變關節病理顯示關節滑膜増生，炎細胞浸潤，軟骨組織及骨組織侵蝕，呈典型的關節炎病變。對照組大鼠沒有病理損傷和病理變化。

實施例2

1）使用超聲波細胞粉碎儀將終濃度為10mg/mL的重組伯氏疏螺旋體P100蛋白、終濃度為3mg/mL的CGCpGGC寡核苷酸與不完全弗氏佐劑混勻，製成全菌蛋白乳化液，37℃內孵育20分鐘（min）後待用；

試驗組為18隻Lewis大鼠，將製備的0.1mL全菌蛋白乳化液在大鼠右足足邸皮內注射，2周（w）後以0.1mL的全菌蛋白乳化液腹腔注射，加強免疫1次。對照組為18隻Lewis大鼠，以相同的程序注射0.25mL，0.85% NaCl；

在造模後第16d，試驗組大鼠RA造模成功率為94.44%，病變關節病理顯示關節滑膜増生，炎細胞浸潤，軟骨組織及骨組織侵蝕，呈典型的關節炎病變；對照組大鼠沒有出現任何症狀和病理變化；

2）外觀評分：

於造模後第6d、8d、10d、12d、14d、16d，採用關節炎指數(arthritis index，AI)評分法對關節腫脹程度及活動度進行評分，具體如下：

（1）0分,無任何改變；

（2）1分,僅足趾關節發病,包括皮膚變紅,輕度腫脹；

（3）2分,足趾關節和足巧部均發病,包括皮膚變紅,中度腫脹；

（4）3分,踝關節以下發病,包括皮膚變紅,重度腫脹；

（5）4分,包括踝關節在內全部紅腫,伴關節強直及活動受限；

造模後第16d，試驗組大鼠的關節出現明顯紅腫，足部及踝關節腫脹最為明顯，足趾成鼓捶狀，且病變呈對稱性；不能負重，行走困難；外觀評分為3.56±0.26分；對照組大鼠無任何改變；

3）測量足蹠部腫脹率：

在每隻大鼠踝關節上緣劃線做標記，於造模後第0d，2d，4d，6d，8d，10d，12d，14，16d用足趾容積測量儀測量對側腳踝關節及其以下體積，詳細記錄並計算足蹠部腫脹率。計算方法：足蹠部腫脹率(%)=(造模後第nd大鼠踝關節及其以下體積-造模後第0d踝關節及其以下體積)/造模後第0d踝關節及其以下體積×100%，（n表示測量時間點）

造模後第16d，試驗組大鼠的足蹠部腫脹率77%，存在明顯的改變；對照組大鼠無任何改變；

4）HE染色及病理學評價：

（1）標本收集：將大鼠斷頸處死，切下注射對側足踝關節，剔除皮膚和肌肉組織，10%中性福馬林固定2-3d；

（2）標本脫鈣、石蠟包埋及切片：將標本放入22倍體積的脫鈣液中,置於恆溫水浴箱保持37℃，每日振蕩脫鈣液1-2次，每10天更換一次脫鈣液，脫鈣5-7周；標本切割後脫水，石蠟包埋，常規切片；

（3）蘇木素-伊紅（hematoxylin eosin，HE）染色：

①二甲苯脫蠟5min,吸水紙吸乾液體。二甲苯第二次脫蠟lOmin至切片透明,吸水紙吸乾液體；

②無水乙醇浸潤5min；無水乙醇第二次浸潤5min；95%乙醇浸潤3min；流水2min,用吸水紙吸乾水分；

③蘇木素染色,4到8min，流水衝洗5min；

④1%鹽酸水溶液分化5-10s(切片由藍變紅)，流水洗返藍15-30min；

⑤0.5%伊紅(水溶性)染色,30s-1min；

⑥95%乙醇脫水5min，95%乙醇第二次脫水5min；

⑦二甲苯透明2-3min，二甲苯透明5min；

⑧中性樹膠封片，鏡下觀察結果,拍攝病理圖片；

（4）病理學評價：

HE染色後觀察關節周圍炎症、滑膜增生、血管翳形成及軟骨下骨質破壞程度，對病理改變進行描述。病理損傷評分分為5級：0分，正常；1分，輕微局部炎性細胞浸潤；2分，中度炎性細胞浸澗；3分，重度炎性細胞浸潤，無軟骨損傷、血管翳形成；4分，重度炎性細胞浸潤並伴有血管翳形成和(或)軟骨、骨質破壞；

在造模後第16d，試驗組大鼠病理評價分數為3.45±0.28分，病變關節病理顯示關節滑膜増生，炎細胞浸潤，軟骨組織及骨組織侵蝕，呈典型的關節炎病變；對照組大鼠沒有病理損傷和病理變化。

實施例3

1）使用超聲波細胞粉碎儀將終濃度為5mg/mL的重組伯氏疏螺旋體P100蛋白、終濃度為1mg/mL的CGCpGGC寡核苷酸與不完全弗氏佐劑混勻，製成全菌蛋白乳化液，37℃內孵育20分鐘（min）後待用；

試驗組為18隻Lewis大鼠，將製備的0.25mL全菌蛋白乳化液在大鼠右足足邸皮內注射，2周（w）後以0.25mL的全菌蛋白乳化液腹腔注射，加強免疫1次；對照組為18隻Lewis大鼠，以相同的程序注射0.25mL，0.85% NaCl；

在造模後第16d，試驗組大鼠RA造模成功率為94.44%，病變關節病理顯示關節滑膜増生，炎細胞浸潤，軟骨組織及骨組織侵蝕，呈典型的關節炎病變；對照組大鼠沒有出現任何症狀和病理變化；

2）外觀評分：

於造模後第6d、8d、10d、12d、14d、16d，採用關節炎指數(arthritis index，AI)評分法對關節腫脹程度及活動度進行評分，具體如下:

（1）0分,無任何改變；

（2）1分,僅足趾關節發病,包括皮膚變紅,輕度腫脹；

（3）2分,足趾關節和足巧部均發病,包括皮膚變紅,中度腫脹；

（4）3分,踝關節以下發病,包括皮膚變紅,重度腫脹；

（5）4分,包括踝關節在內全部紅腫,伴關節強直及活動受限；

造模後第16d，試驗組大鼠的關節出現明顯紅腫，足部及踝關節腫脹最為明顯，足趾成鼓捶狀，且病變呈對稱性；不能負重，行走困難；外觀評分為3.47±0.12分；對照組大鼠無任何改變；

3）測量足蹠部腫脹率：

在每隻大鼠踝關節上緣劃線做標記，於造模後第0d，2d，4d，6d，8d，10d，12d，14，16d用足趾容積測量儀測量對側腳踝關節及其以下體積，詳細記錄並計算足蹠部腫脹率。計算方法：足蹠部腫脹率(%)=(造模後第nd大鼠踝關節及其以下體積-造模後第0d踝關節及其以下體積)/造模後第0d踝關節及其以下體積×100%，（n表示測量時間點）

造模後第16d，試驗組大鼠的足蹠部腫脹率71%，存在明顯的改變。對照組大鼠無任何改變。

4）HE染色及病理學評價：

（1）標本收集：將大鼠斷頸處死，切下注射對側足踝關節，剔除皮膚和肌肉組織，10%中性福馬林固定2-3d；

（2）標本脫鈣、石蠟包埋及切片：將標本放入22倍體積的脫鈣液中,置於恆溫水浴箱保持37℃，每日振蕩脫鈣液1-2次，每10天更換一次脫鈣液，脫鈣5-7周。標本切割後脫水，石蠟包埋，常規切片；

（3）蘇木素-伊紅（hematoxylin eosin，HE）染色：

①二甲苯脫蠟5min,吸水紙吸乾液體。二甲苯第二次脫蠟lOmin至切片透明,吸水紙吸乾液體；

②無水乙醇浸潤5min；無水乙醇第二次浸潤5min；95%乙醇浸潤3min；流水2min,用吸水紙吸乾水分；

③蘇木素染色,4到8min，流水衝洗5min；

④1%鹽酸水溶液分化5-10s(切片由藍變紅)，流水洗返藍15-30min；

⑤0.5%伊紅(水溶性)染色,30s-1min；

⑥95%乙醇脫水5min，95%乙醇第二次脫水5min；

⑦二甲苯透明2-3min，二甲苯透明5min；

⑧中性樹膠封片，鏡下觀察結果,拍攝病理圖片；

（4）病理學評價：

HE染色後觀察關節周圍炎症、滑膜增生、血管翳形成及軟骨下骨質破壞程度，對病理改變進行描述。病理損傷評分分為5級：0分，正常；1分，輕微局部炎性細胞浸潤；2分，中度炎性細胞浸澗；3分，重度炎性細胞浸潤，無軟骨損傷、血管翳形成；4分，重度炎性細胞浸潤並伴有血管翳形成和(或)軟骨、骨質破壞；

在造模後第16d，試驗組大鼠病理評價分數為3.42±0.27分，病變關節病理顯示關節滑膜増生，炎細胞浸潤，軟骨組織及骨組織侵蝕，呈典型的關節炎病變；對照組大鼠沒有病理損傷和病理變化。

實施例4

1）使用超聲波細胞粉碎儀將終濃度為8mg/mL的重組伯氏疏螺旋體P100蛋白、終濃度為2mg/mL的CGCpGGC寡核苷酸與不完全弗氏佐劑混勻，製成全菌蛋白乳化液，37℃內孵育20分鐘（min）後待用；

試驗組為18隻Lewis大鼠，將製備的0.2mL全菌蛋白乳化液在大鼠右足足邸皮內注射，2周（w）後以0.1mL的全菌蛋白乳化液腹腔注射，加強免疫1次。對照組為18隻Lewis大鼠，以相同的程序注射0.25mL，0.85% NaCl；

在造模後第16d，試驗組大鼠RA造模成功率為94.44%，病變關節病理顯示關節滑膜増生，炎細胞浸潤，軟骨組織及骨組織侵蝕，呈典型的關節炎病變。對照組大鼠沒有出現任何症狀和病理變化；

2）外觀評分：

於造模後第6d、8d、10d、12d、14d、16d，採用關節炎指數(arthritis index，AI)評分法對關節腫脹程度及活動度進行評分，具體如下:

（1）0分,無任何改變；

（2）1分,僅足趾關節發病,包括皮膚變紅,輕度腫脹；

（3）2分,足趾關節和足巧部均發病,包括皮膚變紅,中度腫脹；

（4）3分,踝關節以下發病,包括皮膚變紅,重度腫脹；

（5）4分,包括踝關節在內全部紅腫,伴關節強直及活動受限。

造模後第16d，試驗組大鼠的關節出現明顯紅腫，足部及踝關節腫脹最為明顯，足趾成鼓捶狀，且病變呈對稱性；不能負重，行走困難。外觀評分為3.26±0.28分；對照組大鼠無任何改變；

3）測量足蹠部腫脹率：

在每隻大鼠踝關節上緣劃線做標記，於造模後第0d，2d，4d，6d，8d，10d，12d，14，16d用足趾容積測量儀測量對側腳踝關節及其以下體積，詳細記錄並計算足蹠部腫脹率。計算方法：足蹠部腫脹率(%)=(造模後第nd大鼠踝關節及其以下體積-造模後第0d踝關節及其以下體積)/造模後第0d踝關節及其以下體積×100%，（n表示測量時間點）

造模後第16d，試驗組大鼠的足蹠部腫脹率74%，存在明顯的改變。對照組大鼠無任何改變；

4）HE染色及病理學評價：

（1）標本收集：將大鼠斷頸處死，切下注射對側足踝關節，剔除皮膚和肌肉組織，10%中性福馬林固定2-3d；

（2）標本脫鈣、石蠟包埋及切片：將標本放入22倍體積的脫鈣液中,置於恆溫水浴箱保持37℃，每日振蕩脫鈣液1-2次，每10天更換一次脫鈣液，脫鈣5-7周。標本切割後脫水，石蠟包埋，常規切片；

（3）蘇木素-伊紅（hematoxylin eosin，HE）染色：

①二甲苯脫蠟5min,吸水紙吸乾液體。二甲苯第二次脫蠟lOmin至切片透明,吸水紙吸乾液體；

②無水乙醇浸潤5min；無水乙醇第二次浸潤5min；95%乙醇浸潤3min；流水2min,用吸水紙吸乾水分；

③蘇木素染色,4到8min，流水衝洗5min；

④1%鹽酸水溶液分化5-10s(切片由藍變紅)，流水洗返藍15-30min；

⑤0.5%伊紅(水溶性)染色,30s-1min；

⑥95%乙醇脫水5min，95%乙醇第二次脫水5min；

⑦二甲苯透明2-3min，二甲苯透明5min；

⑧中性樹膠封片，鏡下觀察結果,拍攝病理圖片；

（4）病理學評價：

HE染色後觀察關節周圍炎症、滑膜增生、血管翳形成及軟骨下骨質破壞程度，對病理改變進行描述；病理損傷評分分為5級：0分，正常；1分，輕微局部炎性細胞浸潤；2分，中度炎性細胞浸澗；3分，重度炎性細胞浸潤，無軟骨損傷、血管翳形成；4分，重度炎性細胞浸潤並伴有血管翳形成和(或)軟骨、骨質破壞；

在造模後第16d，試驗組大鼠病理評價分數為3.38±0.29分，病變關節病理顯示關節滑膜増生，炎細胞浸潤，軟骨組織及骨組織侵蝕，呈典型的關節炎病變；對照組大鼠沒有病理損傷和病理變化。

實施例5

1）使用超聲波細胞粉碎儀將終濃度為7mg/mL的重組伯氏疏螺旋體P100蛋白、終濃度為1mg/mL的CGCpGGC寡核苷酸與不完全弗氏佐劑混勻，製成全菌蛋白乳化液，37℃內孵育20分鐘（min）後待用；

試驗組為18隻Lewis大鼠，將製備的0.1mL全菌蛋白乳化液在大鼠右足足邸皮內注射，2周（w）後以0.25mL的全菌蛋白乳化液腹腔注射，加強免疫1次。對照組為18隻Lewis大鼠，以相同的程序注射0.25mL，0.85% NaCl；

在造模後第16d，試驗組大鼠RA造模成功率為88.89%，病變關節病理顯示關節滑膜増生，炎細胞浸潤，軟骨組織及骨組織侵蝕，呈典型的關節炎病變；對照組大鼠沒有出現任何症狀和病理變化；

2）外觀評分：

於造模後第6d、8d、10d、12d、14d、16d，採用關節炎指數(arthritis index，AI)評分法對關節腫脹程度及活動度進行評分，具體如下:

（1）0分,無任何改變；

（2）1分,僅足趾關節發病,包括皮膚變紅,輕度腫脹；

（3）2分,足趾關節和足巧部均發病,包括皮膚變紅,中度腫脹；

（4）3分,踝關節以下發病,包括皮膚變紅,重度腫脹；

（5）4分,包括踝關節在內全部紅腫,伴關節強直及活動受限；

造模後第16d，試驗組大鼠的關節出現明顯紅腫，足部及踝關節腫脹最為明顯，足趾成鼓捶狀，且病變呈對稱性；不能負重，行走困難；外觀評分為3.18±0.26分。對照組大鼠無任何改變；

3）測量足蹠部腫脹率：

在每隻大鼠踝關節上緣劃線做標記，於造模後第0d，2d，4d，6d，8d，10d，12d，14，16d用足趾容積測量儀測量對側腳踝關節及其以下體積，詳細記錄並計算足蹠部腫脹率。計算方法：足蹠部腫脹率(%)=(造模後第nd大鼠踝關節及其以下體積-造模後第0d踝關節及其以下體積)/造模後第0d踝關節及其以下體積×100%，（n表示測量時間點）

造模後第16d，試驗組大鼠的足蹠部腫脹率69%，存在明顯的改變；對照組大鼠無任何改變。

4）HE染色及病理學評價：

（1）標本收集：將大鼠斷頸處死，切下注射對側足踝關節，剔除皮膚和肌肉組織，10%中性福馬林固定2-3d；

（2）標本脫鈣、石蠟包埋及切片：將標本放入22倍體積的脫鈣液中,置於恆溫水浴箱保持37℃，每日振蕩脫鈣液1-2次，每10天更換一次脫鈣液，脫鈣5-7周。標本切割後脫水，石蠟包埋，常規切片；

（3）蘇木素-伊紅（hematoxylin eosin，HE）染色：

①二甲苯脫蠟5min,吸水紙吸乾液體。二甲苯第二次脫蠟lOmin至切片透明,吸水紙吸乾液體；

②無水乙醇浸潤5min；無水乙醇第二次浸潤5min；95%乙醇浸潤3min；流水2min,用吸水紙吸乾水分；

③蘇木素染色,4到8min，流水衝洗5min；

④1%鹽酸水溶液分化5-10s(切片由藍變紅)，流水洗返藍15-30min；

⑤0.5%伊紅(水溶性)染色,30s-1min；

⑥95%乙醇脫水5min，95%乙醇第二次脫水5min；

⑦二甲苯透明2-3min，二甲苯透明5min；

⑧中性樹膠封片，鏡下觀察結果,拍攝病理圖片；

（4）病理學評價：

HE染色後觀察關節周圍炎症、滑膜增生、血管翳形成及軟骨下骨質破壞程度，對病理改變進行描述；病理損傷評分分為5級：0分，正常；1分，輕微局部炎性細胞浸潤；2分，中度炎性細胞浸澗；3分，重度炎性細胞浸潤，無軟骨損傷、血管翳形成；4分，重度炎性細胞浸潤並伴有血管翳形成和(或)軟骨、骨質破壞；

在造模後第16d，試驗組大鼠病理評價分數為3.31±0.26分，病變關節病理顯示關節滑膜増生，炎細胞浸潤，軟骨組織及骨組織侵蝕，呈典型的關節炎病變；對照組大鼠沒有病理損傷和病理變化。