一種用於檢測RhD變異表型的SNP標記的製作方法
2023-06-12 09:41:36
本發明屬於基因診斷製品技術領域，具體涉及一種用於檢測紅細胞rhd變異血型的snp標記。
發明背景
rh血型系統(rhesusmonkeys)是由著名科學家、諾貝爾獎得主karllandsteiner率先從恆河猴的紅細胞上發現，故因此得名。rh血型系統是目前人類36個血型系統中最複雜的，其重要性僅次於abo系統，在臨床輸血、新生兒溶血病的診治中佔有重要地位。rh血型系統中d抗原是免疫原性最強、多態性最複雜的。對於中國大陸的漢族人來講，rhd陰性人群只佔千分之三左右，由於十分罕見，故又名熊貓血。由於rhd的強抗原性，導致rhd陰性者不能接受rhd陽性血液，因為rhd抗原將刺激rhd陰性人體產生抗-rhd抗體。如果再次輸入rhd陽性血液，即可導致溶血性輸血反應。同樣，若rhd陰性婦女由於妊娠或輸血刺激體內產生抗-rhd抗體，再次懷孕則會導致新生兒溶血病的發生。
rhd血型系統而除了正常的rhd陽性、陰性外，還存在許多變異型，包括弱d(weakd)、部分d(partiald)及del型(放散型)。這些變異型的紅細胞表面存在不完全的、或者變異的rhd抗原，若輸注給陰性個體也有可能刺激產生抗體，因此這些變異型的個體有兩個主要特點：一是他們作為受血者和獻血者是不同的兩種處理，作為受血者，他們只能輸入rhd陰性血液；而作為獻血者，他們的血液只能作為rhd陽性血使用。二是容易漏檢，由於rhd抗原的變異，導致在常規的血型血清學檢測時常規抗體無法與之反應，故易錯判為rhd陰性，由於目前沒有特別有效的清除不規則抗體的措施，所以這對於需多次輸血的患者、妊娠期婦女來說危害十分巨大。因此準確的定型是確保正確輸注的前提。目前血型的常規檢測方法是血清學實驗，但這個實驗受多種限制，比如樣本的質量、自身抗體或不規則抗體的幹擾、疾病的影響等，同時對於del型這種只能通過吸收放散試驗才能檢測到的類別更是無法判斷，這就需要利用分子生物學的方法在基因水平進行診斷。
技術實現要素：
本發明的目的是提供一種用於檢測rhd變異血型的snp標記，可以準確的對紅細胞rhd變異血型進行確證，從而彌補現有技術的不足。
本發明提供一種與rhd變異血型相關的snp標記，所述的snp標記，是rhd基因編碼區域由起始密碼子起第739位鹼基發生了突變，由g突變為c。
本發明的另一個方面提供上述snp標記的應用，是在製備檢測紅細胞rhd變異血型的製品中的應用；
根據本發明的另一個方面，是提供上述snp標記在檢測紅細胞rhd變異血型中的應用。
上述的測定方法，是通過能擴增上述snp標記的引物對待檢測的血樣dna進行pcr擴增，擴增產物進行測序後進行基因型分析，確定待檢樣品是否存在上述的snp標記。
上述方法中所使用的引物對，其引物的序列信息如下：
rhd-5f:5』-agcacttcacagagcaggttca-3』(seqidno:1)
rhd-5r:5』-actgtgaccacccagcattcta-3』(seqidno:2)。
其中seqidno：1同時為測序引物。
本發明通過檢測篩選獲得的snp位點，從而提供了一種有效的進行rhd血型基因診斷途徑，應用效果表明本發明所提供的snp位點及檢測引物可以有效的用於臨床患者及血站獻血員進行rhd基因的快速檢測。
附圖說明
圖1：實施例1的rhd變異表型rhd基因測序圖，其中a：先證者父親，正常rhd陽性表型，攜帶rhd全缺失基因；b：先證者母親，正常rhd陽性表型，攜帶突變基因；c：先證者，rhd變異表型。該家系中兩名rhd基因編碼區域由起始密碼子起第739位鹼基發生了突變，由g突變為c。
具體實施方式
申請人從226例血清學檢測為rhd陰性或變異型個體進行rhd基因測序，發現了一例新的snp突變導致rhd變異型，從而促成了本發明。
rh基因位於染色體1p34.3-1p36.1區域，可轉錄成2837bp的mrna(ncbi登錄號為nm_016124.4)，最終翻譯形成417個胺基酸組成的蛋白質。由rhd基因(編碼rhd抗原)和rhce基因(編碼rhc、c、e和e抗原)緊密串聯排列組成。rhd基因和rhce基因結構高度同源，均由10個外顯子和9個內含子組成，其中兩者的第8外顯子完全相同，差異較大的是外顯子3、4、5、7、9和內含子4。因此採用分子生物學的手段，建立rhd基因檢測系統，並應用於臨床和採供血工作當中，有助於rhd陰性個體的準確檢出，有助於降低受血者不規則抗體的產生，有助於產前不規則抗體的預防和監測，有助於降低新生兒溶血病的發生。
對於本發明所涉及snp標記，申請人解釋如下：
snp(singlenucleotidepolymorphism，snp，即單核苷酸多態性)是指基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的dna序列多態性。snp表現出的多態性僅涉及到單個鹼基的變異，表現是有轉換、顛換、插入和缺失等。
下面結合實施例對本發明進行詳細的描述。
實施例1：snp標記的篩選
1、提取外周血基因組dna：
在符合國家相關政策規定，並在取樣對象同意的基礎上，抽取rhd陰性或變異型獻血員外周靜脈血2-5ml，放入edta抗凝管內，-80℃凍存備用；凍存的edta抗凝血在室溫融化後，取500μl放於離心管，加入等體積te(ph8.0)，混勻，4℃，10000rpm離心10分鐘，棄上清。
加入180μlte、20μlsds(10％)、8μl蛋白酶k(l0mg/ml)混勻，置於37℃水浴過夜。從水浴中取出樣品，瞬時離心沉澱樣本。在反應管中加入等體積的tris-飽和酚(約300μl)，充分混勻，室溫下10000rpm離心10分鐘，吸取上清液(約300μl)至一新離心管中。重複酚抽提一次，吸取上清液至一新離心管中。
加入等體積的tris飽和酚:氯仿混合液(酚、氯仿各150μl)，混勻，室溫10000rpm離心10分鐘，轉移上清液至一新離心管。
加入等體積的tris飽和酚:氯仿:異戊醇混合液(酚、氯仿、異戊醇各100μl)，混勻，室溫10000rpm離心10分鐘，轉移上清液至一新離心管。
加入l/10體積3mol/l、ph5.2醋酸鈉(約30μl)，2倍體積預冷100％乙醇，輕輕混合，可見白色絮狀沉澱。室溫10000rpm離心10分鐘，使dna沉澱於管底，棄上清。
向dna沉澱加入70％乙醇，漂洗一次，室溫7000rpm離心5分鐘，棄上清，置於室溫中揮發剩餘乙醇，最後加入50μlte(ph8.0)，4℃過夜溶解dna。
對提取的dna行瓊脂糖膠電泳，並應用紫外分光光度計在260nm和280nm比色，檢測dna純度及濃度。
2、直接測序法尋找該獻血員rhd基因的突變
pcr擴增目的片段：反應條件與反應體系：
(1)pcr反應條件：95℃5m；95℃30s，58℃30s，72℃60s，35cycles；72℃5m。
(2)反應體系：(onelambda公司faststarttaqpolymerase)
應用該反應體系分別進行每位rhd陰性或d變異型獻血員的基因組dna模板與該rhd引物的擴增反應。
pcr產物測序：應用常規sanger測序法對上述pcr產物進行測序，rhd-5f:5』-agcacttcacagagcaggttca-3』，在該rhd變異型獻血員rhd基因第五外顯子處發現一處突變，第739位鹼基g突變為c，(圖1c)，從而導致nt739-741由gtc突變為ctc,胺基酸密碼子由纈氨酸(val)變為亮氨酸(leu)，造成rhd蛋白構象改變，血清學顯示rhd變異表型。多次測序結果表明此突變位點並不是因為擴增或測序錯誤引進的，應為為一新生突變。該突變不存在於下面的四個資料庫中：單核苷酸多態性資料庫(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/snp/database/)，千人基因組計劃(ftp://ftp-trace.ncbi.nih.gov/1000genomes/ftp/)，hapmap8資料庫(http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/)，及炎黃資料庫(http://yh.genomics.org.cn/)，表明該突變非常罕見，該突變導致了rhd蛋白構象改變，從而導致rhd變異型。而在200例rhd陽性獻血員的外周血基因組dna樣本中進行該位點的突變篩查，未發現該突變。
通過上述的分析，證明該方法可以準確測定rhd基因，從而可以更加精準的確定待測者的rhd血型，對於患者制定輸血政策具有重要意義。
實施例2：對snp突變先證者的父母進行遺傳驗證
1、提取外周血基因組dna：
在符合國家相關政策規定，並在取樣對象同意的基礎上，抽取rhd陰性或變異型獻血員外周靜脈血2-5ml，放入edta抗凝管內，-80℃凍存備用；凍存的edta抗凝血在室溫融化後，取500μl放於離心管，加入等體積te(ph8.0)，混勻，4℃，10000rpm離心10分鐘，棄上清。
加入180μlte、20μlsds(10％)、8μl蛋白酶k(l0mg/ml)混勻，置於37℃水浴過夜。從水浴中取出樣品，瞬時離心沉澱樣本。在反應管中加入等體積的tris-飽和酚(約300μl)，充分混勻，室溫下10000rpm離心10分鐘，吸取上清液(約300μl)至一新離心管中。重複酚抽提一次，吸取上清液至一新離心管中。
加入等體積的tris飽和酚:氯仿混合液(酚、氯仿各150μl)，混勻，室溫10000rpm離心10分鐘，轉移上清液至一新離心管。
加入等體積的tris飽和酚:氯仿:異戊醇混合液(酚、氯仿、異戊醇各100μl)，混勻，室溫10000rpm離心10分鐘，轉移上清液至一新離心管。
加入l/10體積3mol/l、ph5.2醋酸鈉(約30μl)，2倍體積預冷100％乙醇，輕輕混合，可見白色絮狀沉澱。室溫10000rpm離心10分鐘，使dna沉澱於管底，棄上清。
向dna沉澱加入70％乙醇，漂洗一次，室溫7000rpm離心5分鐘，棄上清，置於室溫中揮發剩餘乙醇，最後加入50μlte(ph8.0)，4℃過夜溶解dna。
對提取的dna行瓊脂糖膠電泳，並應用紫外分光光度計在260nm和280nm比色，檢測dna純度及濃度。
2、直接測序法尋找該先證者父母rhd基因第二外顯子的突變
pcr擴增目的片段：反應條件與反應體系：
(1)pcr反應條件：95℃5m；95℃30s，58℃30s，72℃60s，35cycles；72℃5m。
(2)反應體系：(onelambda公司faststarttaqpolymerase)
應用該反應體系分別進行先證者父母的基因組dna模板與擴增引物的擴增反應。
pcr產物測序：採用常規sanger測序法對上述pcr產物進行測序(圖1)，先證者父親(a)為正常rhd陽性表型，攜帶rhd全缺失基因；先證者母親(b)為正常rhd陽性表型，攜帶突變基因，表現為rhd正常基因與snp突變基因雜合峰；先證者(c)遺傳父親rhd全缺失基因和母親snp突變基因，故表現為rhd變異表型。該突變不存在於下面的四個資料庫中：單核苷酸多態性資料庫(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/snp/database/)，千人基因組計劃(ftp://ftp-trace.ncbi.nih.gov/1000genomes/ftp/)，hapmap8資料庫(http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/)，及炎黃資料庫(http://yh.genomics.org.cn/)，表明該突變非常罕見。而在200例rhd陽性獻血員的外周血基因組dna樣本中進行該位點的突變篩查，未發現該突變。
上述的實驗結果表明，該snp突變位點能夠精準的確定待測者的rhd血型，對於患者制定輸血政策具有重要意義。
sequencelisting
青島市中心血站（青島市公民義務獻血辦公室青島市輸血醫學研究所）
一種用於檢測rhd變異表型的snp標記
2
patentinversion3.5
1
22
dna
1
1
agcacttcacagagcaggttca22
2
22
dna
2
2
actgtgaccacccagcattcta22