用於預防及治療急性冠脈綜合症及抗凝抗血栓治療的多肽及其應用的製作方法
2023-06-01 07:47:31
專利名稱：用於預防及治療急性冠脈綜合症及抗凝抗血栓治療的多肽及其應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於藥物製備技術領域，具體涉及一種用於預防及治療急性冠脈綜合症及抗凝抗血栓治療的多肽及其應用。本發明涉及的多肽來源於人纖維蛋白原，能與人血小板 GPIIb-IIIa受體結合，可阻斷二磷酸腺苷、花生四烯酸和凝血酶誘導的血小板聚集，能夠抑制動脈血栓形成，用於急性冠脈綜合症，不穩定性心絞痛、急性心肌梗死，介入性治療的抗凝抗血栓治療等。
背景技術：
急性冠脈綜合症(Acute coronary syndrome，ACS)是指急性心肌缺血引起的一組臨床症狀，通常因冠狀動脈粥樣硬化斑塊破裂或表面糜爛，誘發血栓形成或血管痙攣，引起心肌供氧量突然減少所致的嚴重心肌缺血事件，包括ST抬高心肌梗死(STEMI)以及不穩定心絞痛/非ST抬高心肌梗死(UA/NSTEMI)。ACS因其發病急，病情變化快及死亡率高，已成為人類健康和生存的嚴重威脅，粗步估算全球每年每十萬人中有234例發生ACS，其中17% 為不穩定型心絞痛、54%為心肌梗死，29%的人出現心臟性猝死。近二十年來，在中國及許多發展中國家，其發病率呈急劇上升趨勢。ACS患者的冠脈血管屬於不穩定的「脆弱」血管，抗血小板治療是治療ACS的基礎。血小板激活是ACS發病、發展的重要始動因子。而血小板活化、聚集到最終血栓形成是一系列級聯反應，在導致血小板聚集的瀑布式反應的許多步驟中，都有機會加以幹預，防止血小板聚集如阿司匹林抑制環氧化酶，阻止花生四烯酸轉變為前列腺素和血栓烷A2 ；氯吡格雷是一種ADP受體拮抗劑，可阻斷引起血小板激活和聚集的ADP通道，並且研究亦證實阿司匹林加氯吡格雷的雙聯抗血小板治療可使ACS藥物治療患者得到顯著獲益，提示雙聯抗血小板治療可作為ACS藥物治療患者的基礎治療。阿司匹林與氯吡格雷臨床常用製劑為口服製劑，對於ACS患者急診入院病人，氯吡格雷口服起效時間較長，難以達到快速有效的通過抑制血小板GPIIb-IIIa受體而抑制血小板聚集，達到快速有效治療急診入院的ACS患者的目的。因此，開發快速有效抑制小板GPIIb-IIIa受體，同時能與阿司匹林協同，雙聯抗血小板治療的急性期藥物，是解決針對臨床急診ACS的關鍵。
發明內容
本發明的目的是提供一種用於預防及治療急性冠脈綜合症及抗凝抗血栓治療的多肽及其應用，有效抑制冠狀動脈血栓和股動脈血栓形成。本發明所採用的技術方案是
用於預防及治療急性冠脈綜合症及抗凝抗血栓治療的多肽，其特徵在於 該多肽部分或全部包含3 30個胺基酸殘基，是包含如下結構的多肽及其類似物和衍生物
Pl Pro-Ser-Hyp-Gly-Asp-TrpP2 Pro-Ser- Hyp-Gly-Asp-Trp-Arg P3 Pro-Ser-Lys-Gly-Asp-Trp P4 Pro-Ser-Val-Gly-Asp-Trp P5 Pro-Ser-Nva-Gly-Asp-Trp-Arg P6 Pro-Ser- Pro-Gly-Asp-Trp P7 Pro-Ser-Thz-Gly-Asp-Trp
該多肽的類似物為在該多肽機構的基礎上，將一個或幾個胺基酸取代、刪除、轉換或增加的分子；
該多肽的衍生物為在該多肽機構的基礎上，具備化學修飾的一個或幾個胺基酸側鏈集團、α-碳原子、末端氨基或末端羧酸基的分子。該多肽可共價連接一個修飾物，該修飾物為牛血清白蛋白、人血清白蛋白、同源的 IgG或聚乙二醇。如所述的用於預防及治療急性冠脈綜合症及抗凝抗血栓治療的多肽的製備方法， 其特徵在於
該多肽的製備方法包括常規固相合成方法和重組體表達的方法。如所述的用於預防及治療急性冠脈綜合症及抗凝抗血栓治療的多肽的應用，其特徵在於
該多肽、其類似物或衍生物單獨使用，或與阿司匹林或氯吡格雷或肝素聯用，或與以藥物可接受的鹽形式使用，或與藥學上可接受的載體和賦形劑組合使用，用於抑制血小板凝集和血栓形成；其中藥物可接受的鹽為鹽酸鹽、磷酸鹽或乙酸鹽。該多肽、其類似物或衍生物單獨使用，或與阿司匹林或氯吡格雷或肝素聯用，或與以藥物可接受的鹽形式使用，或與藥學上可接受的載體和賦形劑組合使用，作為製備預防及治療急性冠脈綜合症、不穩定性心絞痛、急性心肌梗死和介入性治療的抗凝抗血栓治療的藥物的有效成分。本發明具有以下優點
本發明所涉及的多肽能與人血小板GPIIb-IIla受體結合、阻斷二磷酸腺苷、花生四烯酸和凝血酶誘導的血小板聚集，是治療急性冠脈綜合症、不穩定性心絞痛、急性心肌梗死和介入性治療的抗凝抗血栓治療的藥物的有效成分。
圖1為P3對GP II b/ III a受體抑制作用的IC5tl。圖2為P3對TxA2 (AA代謝)抑制作用。圖3為P3靜脈給藥對犬冠狀動脈血栓的抑制作用。
具體實施例方式下面結合具體實施方式
對本發明進行詳細的說明。一、本發明的作用機理
血小板激活是ACS發病、發展的重要始動因子。血栓形成時血小板活化，活化後的血小板GPIIb/IIIa受體分子數目增加，構型從靜止形式轉變為活化狀態，使GPIIb/IIIa配體結合位點暴露，從而與纖維蛋白原a鏈上的R⑶序列發生特異結合，將相鄰的血小板聯在一起，從而形成血栓。這是血小板血栓形成的最後共同通路。纖維蛋白原的a鏈上的兩個RGD 序列，RGDF (95-98位)和RGDS (572-575位)。這兩個序列可以與血小板發生特異結合，因而可以人工合成的RGD及類似物可以競爭性的抑制纖維蛋白原與血小板的結合，即抑制血栓形成的最後共同通路，在理論上可以完全阻斷血小板聚集。以R⑶為先導化合物，在此基礎上對其進行結構修飾、取代、改造，最終進一步提高其活性，降低其副作用，提高藥物與受體的親和力，使候選物與受體得到合適的匹配，達到高選擇性的緊密結合。以纖維蛋白原α 鏈(92-147位)的兩個對GPIIb/IIIa受體高親和力片段a 92-98和a 95-98為模板，利用多肽分析軟體anthe5. 0分析其基本結構，用不同的胺基酸替代進行結構分析，選擇與已知親和力高、結構類似的胺基酸序列作為備選序列進行合成研究、鑑定、篩選候選化合物。二本發明的結構描述
該多肽本發明所涉及的用於預防及治療急性冠脈綜合症及抗凝抗血栓治療的多肽，能與人血小板GPIIb-IIIa受體結合、阻斷二磷酸腺苷、花生四烯酸和凝血酶誘導的血小板聚集，可有效抑制冠狀動脈血栓和股動脈血栓形成，可作為治療急性冠脈綜合症、不穩定性心絞痛、急性心肌梗死和介入性治療的抗凝抗血栓治療的藥物的有效成分。該多肽包含3 30個胺基酸殘基，是包含如下結構的多肽及其類似物和衍生物 Pl Pro-Ser-Hyp-Gly-Asp-Trp
P2 Pro-Ser- Hyp-Gly-Asp-Trp-Arg P3 Pro-Ser-Lys-Gly-Asp-Trp P4 Pro-Ser-Val-Gly-Asp-Trp P5 Pro-Ser-Nva-Gly-Asp-Trp-Arg P6 Pro-Ser- Pro-Gly-Asp-Trp P7 Pro-Ser-Thz-Gly-Asp-Trp
該多肽的類似物為在該多肽機構的基礎上，將一個或幾個胺基酸取代、刪除、轉換或增加的分子。該多肽中胺基酸殘基可為生物活性近似殘基替換，如疏水性殘基異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸、蛋氨酸之間互相替換；或者極性殘基間的相互替換，如精氨酸替代賴氨酸，穀氨酸替代門冬氨酸等。胺基酸殘基間保守置換還包括精氨酸-賴氨酸，天冬氨酸-穀氨酸，半胱氨酸-絲氨酸，甘氨酸-脯氨酸，異亮氨酸-亮氨酸或纈氨酸，亮氨酸-纈氨酸或異亮氨酸，賴氨酸-精氨酸或穀氨酸，蛋氨酸-亮氨酸或異亮氨酸，苯丙氨酸-酪氨酸或亮氨酸或蛋氨酸，絲氨酸-蘇氨酸，色氨酸-酪氨酸，纈氨酸-異亮氨酸或亮氨酸等。該多肽的衍生物為在該多肽機構的基礎上，具備化學修飾的一個或幾個胺基酸側鏈集團、α -碳原子、末端氨基或末端羧酸基的分子。用於化學修飾的側鏈集團不影響發明多肽的活性，無毒性。該多肽可共價連接一個修飾物，該修飾物為牛血清白蛋白、人血清白蛋白、同源的 IgG或聚乙二醇。三、本發明的獲得方法
該多肽可通過常規固相合成方法合成使用α氨基被酸或鹼敏感性集團保護的胺基酸，這種保護基應該在肽鍵形成條件下穩定，又容易除去而不破壞成長的肽鏈，不會引起其中的任何手性中心外消旋。適當的保護基有9-芴基甲氧基羰基、叔丁氧羰基、苄氧羰基、2-氰基叔丁氧羰基等。多肽合成後用HPLC純化，純度達到95%以上，為白色粉末。該多肽也可以使用基因表達的方式獲得重組基因表達載體優選質粒或粘粒包括編碼本發明多肽的多聚核苷酸，也可以為病毒或逆轉錄病毒載體。用於本發明的各種病毒載體包括腺病毒、皰疹病毒、痘病毒、RNA病毒如逆轉錄病毒等。逆轉錄病毒有莫洛尼鼠白血病病毒(MoMuLV)、哈維鼠肉瘤病毒(HaMuS-V)、鼠乳腺腫瘤病毒(MuMTV)和勞斯肉瘤病毒(RSV)等。四、本發明的應用
該多肽能與人血小板GPIIb-IIIa受體結合、阻斷二磷酸腺苷、花生四烯酸和凝血酶誘導的血小板聚集，是治療急性冠脈綜合症、不穩定性心絞痛、急性心肌梗死和介入性治療的抗凝抗血栓治療的藥物的有效成分。一下為該多肽的應用方式
1、該多肽、其類似物或衍生物可以單獨使用，也可以以藥物可接受的鹽形式使用。藥物可接受的鹽指適於與人或動物的組織接觸，而無過多的毒性、刺激、變態反應等的鹽。藥物可接受的鹽是本領域熟知的。可以是鹽酸鹽、磷酸鹽、乙酸鹽等，這種鹽可以在本發明多肽的最終分離和純化的過程中製備，也可以將多肽與適當的有機或無機酸或鹼反應單獨製備。2、該多肽、其類似物或衍生物與阿司匹林或氯吡格雷或肝素聯用，對抗血栓形成具有明顯的協同作用。3、該多肽、其類似物或衍生物與藥學上可接受的載體和賦形劑組合使用，藥學上可接受的載體和賦形劑指無毒固態、半固態或液態填充劑、稀釋劑、包囊材料或其他製劑輔料。可以根據預防和治療的目的，給藥途徑的需要將藥物組合物製成各種劑型，例如凍乾粉針劑、溶液劑、脂質體包裹劑、微膠囊劑及其他緩釋製劑。常用的載體或賦形劑包括碳酸鎂， 二氧化肽，乳糖，甘露醇，乳蛋白，明膠，澱粉，維生素，纖維素，動物和植物油，聚乙二醇，和溶劑有滅菌水，生理鹽水，緩衝鹽水，乙醇，甘油和多元醇等。本發明中，包含本發明多肽的藥物組分作為抗血小板劑可通過各種途徑給藥，如靜脈、肌注或皮下注射、局部、口服、鼻內等。根據所採用的給藥方式，可將本發明的多肽藥物組合物製成合適的劑型，其中包含至少一種有效劑量的本發明多肽和至少一種藥學上可接受的藥用載體。適當劑型的實例為凍乾粉針劑、透皮吸收劑、片劑、膠囊、糖衣片劑、粒劑、口服溶液和糖漿，氣霧膠，鼻噴劑，以及可用於注射的無菌溶液等。劑型中還可含有其它常規組分，如防腐劑、穩定劑、表面活性劑、緩衝液、調節滲透壓的鹽、乳化劑、增甜劑、著色劑、調味劑等。五、本發明的給藥途徑
本發明所涉及的多肽可靜脈給藥，局部給藥或鼻內給藥，具體而言為靜脈注射、透皮給藥、肌肉注射或鼻噴劑等。給藥的最佳劑量取決於已知因素，如疾病類型、年齡、體重以及病情的嚴重程度，劑型及所選用的給藥途徑等。六、本發明對體外人血小板聚集的抑制作用實驗
1、原理比濁法測試血小板聚集，富血小板血漿具有一定的濁度，PRP中所含的血小板數目直接影響濁度的高低。當誘導劑加入PRP後，在攪拌的作用下，血小板聚集形成聚集物，PRP的濁度下降，透光率增加，因此通過測定PRP的濁度變化來表示血小板的聚集程度。 血小板聚集儀的光電系統可將PRP的濁度變化轉換為電信號的變化，並用記錄儀進行描記。因而從描記的曲線可以求出血小板聚集的程度。
2、試驗材料
(1)受試者健康志願者，年齡20-40周歲，男女各半，近期一個月內未服用抗凝藥以及其他藥物。(2)受試藥品本發明合成肽白色粉末。(3)試劑的配製方法3. 8%的枸櫞酸鈉，精密稱取的枸櫞酸鈉3. Sg加生理鹽水定容至IOOml配製成3. 8%的溶液備用；腎上腺素取Iml加入75ml的生理鹽水中配製成 60 μ M的溶液；ADP的配製精密稱取ADP14. 3mg溶於5ml的生理鹽水中得到6000 μ mol/ L的ADP溶液，將其稀釋成1200 μ mol/L備用；AA的配製精密稱取花生四烯酸500mg溶於 2. 7ml的生理鹽水中配製成600mM，將其稀釋成60mM的AA溶液備用；TH的配製精密稱取凝血酶1. 93mg溶於560 μ 1的磷酸緩衝液(ρΗ=7. 4)中，得到200kU/L的凝血酶，將其稀釋成12kU/L的凝血酶備用；受試藥多肽的配製稱取20. 12mg樣品溶於IOml生理鹽水中得到 3 X 10-3M的溶液，將其稀釋成2. 56 X 10-4M備用。按0. 7倍比例稀釋得到以下濃度的P3多肽溶液，見表1。表1 P3多肽不同濃度的配製表
權利要求
1.用於預防及治療急性冠脈綜合症及抗凝抗血栓治療的多肽，其特徵在於該多肽部分或全部包含3 30個胺基酸殘基，是包含如下結構的多肽及其類似物和衍生物Pl Pro-Ser-Hyp-Gly-Asp-TrpP2 Pro-Ser- Hyp-Gly-Asp-Trp-ArgP3 Pro-Ser-Lys-Gly-Asp-TrpP4 Pro-Ser-Val-Gly-Asp-TrpP5 Pro-Ser-Nva-Gly-Asp-Trp-ArgP6 Pro-Ser- Pro-Gly-Asp-TrpP7 Pro-Ser-Thz-Gly-Asp-Trp。
2.根據權利要求1所述的用於預防及治療急性冠脈綜合症及抗凝抗血栓治療的多肽， 其特徵在於該多肽的類似物為在該多肽機構的基礎上，將一個或幾個胺基酸取代、刪除、轉換或增加的分子；該多肽的衍生物為在該多肽機構的基礎上，具備化學修飾的一個或幾個胺基酸側鏈集團、α-碳原子、末端氨基或末端羧酸基的分子。
3.根據權利要求1所述的用於預防及治療急性冠脈綜合症及抗凝抗血栓治療的多肽， 其特徵在於該多肽可共價連接一個修飾物，該修飾物為牛血清白蛋白、人血清白蛋白、同源的IgG或聚乙二醇。
4.如權利要求1所述的用於預防及治療急性冠脈綜合症及抗凝抗血栓治療的多肽的製備方法，其特徵在於該多肽的製備方法包括常規固相合成方法和重組體表達的方法。
5.如權利要求1所述的用於預防及治療急性冠脈綜合症及抗凝抗血栓治療的多肽的應用，其特徵在於該多肽、其類似物或衍生物單獨使用，或與阿司匹林或氯吡格雷或肝素聯用，或與以藥物可接受的鹽形式使用，或與藥學上可接受的載體和賦形劑組合使用，用於抑制血小板凝集和血栓形成；其中藥物可接受的鹽為鹽酸鹽、磷酸鹽或乙酸鹽。
6.根據權利要求5所述的用於預防及治療急性冠脈綜合症及抗凝抗血栓治療的多肽的應用，其特徵在於該多肽、其類似物或衍生物單獨使用，或與阿司匹林或氯吡格雷或肝素聯用，或與以藥物可接受的鹽形式使用，或與藥學上可接受的載體和賦形劑組合使用，作為製備預防及治療急性冠脈綜合症、不穩定性心絞痛、急性心肌梗死和介入性治療的抗凝抗血栓治療的藥物的有效成分。
全文摘要
本發明涉及一種用於預防及治療急性冠脈綜合症及抗凝抗血栓治療的多肽及其應用。本發明所涉及的多肽的序列為P1 Pro-Ser-Hyp-Gly-Asp-TrpP2 Pro-Ser-Hyp-Gly-Asp-Trp-ArgP3 Pro-Ser-Lys-Gly-Asp-TrpP4 Pro-Ser-Val-Gly-Asp-TrpP5 Pro-Ser-Nva-Gly-Asp-Trp-ArgP6 Pro-Ser-Pro-Gly-Asp-TrpP7 Pro-Ser-Thz-Gly-Asp-Trp，單獨使用或與阿司匹林、氯吡格雷或肝素聯用，用於抑制血小板凝集和血栓形成，作為製備預防及治療急性冠脈綜合症、不穩定性心絞痛、急性心肌梗死和介入性治療的抗凝抗血栓治療的藥物的有效成分。本發明所述的多肽能與人血小板GPIIb-IIIa受體結合、阻斷二磷酸腺苷、花生四烯酸和凝血酶誘導的血小板聚集，有效抑制冠狀動脈血栓和股動脈血栓形成。
文檔編號A61K38/08GK102241735SQ20111017126
公開日2011年11月16日 申請日期2011年6月23日 優先權日2011年6月23日
發明者王冰 申請人:陝西麥科奧特科技有限公司