漆黃素作為製備抗凝血、抗血栓形成和心肌保護作用藥物的應用的製作方法

2023-06-01 07:50:31

漆黃素作為製備抗凝血、抗血栓形成和心肌保護作用藥物的應用的製作方法
【專利摘要】本發明涉及一種漆黃素作為製備抗凝血、抗血栓形成和心肌保護作用藥物的應用，其能降低缺血心肌細胞炎症反應，具有抗凝血、抗血栓形成和心肌保護作用。本發明採用的技術方案為：漆黃素作為製備抗凝血藥物的應用，為抑制ADP誘導的血小板聚集、抑制血小板釋放、降低血清Fg和vWF含量而產生抗凝血作用。漆黃素作為製備抗血栓形成藥物的應用，為顯著延長CT、PT、TT和APTT，間接起到抗血栓形成作用。漆黃素作為製備對缺血/再灌注心肌細胞起保護作用藥物的應用，通過抑制炎症細胞侵潤、MMP-9和NF-kB的表達、NF-kB核轉移、心肌細胞凋亡等途徑降低缺血心肌細胞炎症反應，減少損傷心肌的梗死面積，產生對缺血心肌細胞的保護作用。
【專利說明】漆黃素作為製備抗凝血、抗血栓形成和心肌保護作用藥物的應用
[0001]一、【技術領域】:
本發明涉及一種漆黃素作為製備抗凝血、抗血栓形成和心肌保護作用藥物的應用。
[0002]二、【背景技術】 :
心肌缺血 / 再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury, MIRI)是冠心病、心肌梗死等疾病發病和防治的主要因素，如何減輕MIRI已成為防治缺血性心臟病和心臟介入治療方面的重要課題。再灌注後細胞凋亡是心肌缺血再灌注損傷發生的重要機制之一，抑制凋亡可增加心臟射血分數，減少再灌注心臟發生心功能不全的可能性。冠心病是導致人類死亡的主要病因之一，平均每年約380萬男性和340萬女性死於該病，據統計因為心肌再灌注損傷導致患者死亡或心力衰竭的發生率分別為10%和25%[1-3]，因此，尋找MIRI病因，探究其發病機制，尋找其治療方案，研製有效藥物有著非常重要的意義。
[0003]三、
【發明內容】
:
本發明的目的在於提供一種漆黃素作為製備抗凝血、抗血栓形成和心肌保護作用藥物的應用，其能降低缺血心肌細胞炎症反應，減少損傷心肌的梗死面積，產生對缺血心肌細胞的保護作用。具有抗凝血、抗血栓形成和心肌保護作用。
[0004]為實現上述目的，本發明採用的技術方案為:
漆黃素作為製備抗凝血藥物的應用，為抑制ADP誘導的血小板聚集、抑制血小板釋放、降低血清Fg和vWF含量而產生抗凝血作用。
[0005]漆黃素作為製備抗血栓形成藥物的應用，為顯著延長CT、PT、TT和APTT，間接起到抗血栓形成作用。
[0006]漆黃素作為製備對缺血/再灌注心肌細胞起保護作用藥物的應用，通過抑制炎症細胞侵潤、MMP-9和NF-kB的表達、NF-kB核轉移、心肌細胞凋亡等途徑降低缺血心肌細胞炎症反應，減少損傷心肌的梗死面積，產生對缺血心肌細胞的保護作用。
[0007]漆黃素作為製備抗凝血、抗血栓形成和心肌保護作用藥物的應用，其特徵在於:漆黃素的劑量範圍大鼠為為5~45 mg/kg，換算為人劑量為0.8~7.2 mg/kg。
[0008]漆黃素作為製備抗凝血、抗血栓形成和心肌保護作用藥物的應用，其特徵在於:漆黃素的製成品為藥品製劑或保健食品。
[0009]漆黃素作為製備抗凝血、抗血栓形成和心肌保護作用藥物的應用，其特徵在於:漆黃素的劑型為經口、肌肉、靜脈、透皮吸收的製劑及外用製劑。
[0010]與現有技術相比，本發明具有的優點和效果如下:
本發明涉及15mg/kg~45mg/kg的漆黃素對心肌缺血/再灌注心肌細胞的保護作用及機制。所述的漆黃素對心肌缺血/再灌注大鼠有抗血栓活性，具有抗血小板聚集活性，其機制可能為顯著延長CT、PT、TT、APTT，降低血清vWF含量，其15mg/kg~45mg/kg劑量效果與槲皮素或阿司匹林效果相當。漆黃素通過抑制炎症細胞侵潤、MMP-9和NF-kB的表達、NF-kB核轉移、心肌細胞凋亡等途徑降低缺血心肌細胞炎症反應，減少損傷心肌的梗死面積，產生對缺血心肌細胞的保護作用。通過對比試驗研究表明，本發明具有抗凝血、抗血栓形成和心肌保護作用。
[0011]四、【專利附圖】

【附圖說明】:
圖1可見假手術組大鼠的心電圖變化正常。
[0012]圖2可見冠狀動脈結紮後，心電圖ST段高抬/T波高聳，標誌造模成功。
[0013]圖3為漆黃素對心肌缺血/再灌注大鼠全血凝血時間的影響(
i±SEM, n=12，與模型組比較，**Ρ〈0.01，*Ρ〈0.05)。
[0014]圖4為漆黃素對心肌缺血/再灌注大鼠凝血酶原時間的影響(i 土SEM，n=12，與模型組比較，**ρ〈0.01，*Ρ〈0.05)。
[0015]圖5為漆黃素對心肌缺血/再灌注大鼠凝血酶時間的影響(X ±SEM, η=12,
與模型組比較，**ρ〈0.01，*Ρ〈0.05)。
[0016]圖6為漆黃素對心肌缺血/再灌注大鼠白陶土部分凝血活酶時間的影響G±SEM, n=12，與模型組比較，**Ρ〈0.01，*Ρ〈0.05)。
[0017]圖7為漆黃素對心肌缺血/再灌注大鼠血漿vWF的影響(數據用? 土SEM表示，η=12，與模型組比較，**Ρ〈0.01，*Ρ〈0.05。與正常組相比，~Ρ〈0.05, 一Ρ〈0.01)。
[0018]圖8為漆黃素對ADP誘導的人血小板聚集率的影響(η=12，**Ρ<0.01，*Ρ<0.05)。
[0019]圖9為在20 μ M ADP和2 μ M NE誘導人血小板聚集下漆黃素和槲皮素的濃度抑制曲線。
[0020]圖10為漆黃素對心肌缺血/再灌注大鼠心肌細胞凋亡率的影響(i 土 SEM，n=4，與模型組比較，**Ρ〈0.01，*Ρ〈0.05)。
[0021]圖11為為漆黃素對心肌缺血/再灌注大鼠心肌細胞MMP-9表達的影響(i 土SEM，n=8，與模型組比較，**Ρ〈0.01，*Ρ〈0.05)。
[0022]圖12為漆黃素對心肌缺血/再灌注大鼠心肌細胞NF-kB核轉移細胞總數和比率的影響 G 土SEM，n=8，與模型組比較，**Ρ〈0.01，*Ρ〈0.05)。
[0023]圖13為漆黃素對心肌缺血/再灌注大鼠心肌細胞NF-kB表達的影響(χ 土SEM，η=8，與模型組比較，**Ρ〈0.01，*Ρ〈0.05)。
[0024]圖14為漆黃素對心肌缺血/再灌注大鼠心肌細胞梗塞面積的影響(i 土SEM，n=8，與模型組比較，**ρ〈0.01，*Ρ〈0.05)。
[0025]圖15為漆黃素對心肌缺血/再灌注大鼠心肌細胞炎症細胞總數及炎症細胞百分率的影響(i ±SEM, n=8，與模型組比較，**Ρ〈0.01，*Ρ〈0.05)。
[0026]五、【具體實施方式】:
本發明為一種漆黃素作為製備抗凝血、抗血栓形成和心肌保護作用藥物的應用，其具有抗凝血、抗血栓形成和心肌保護作用。具體體現在:
漆黃素作為製備抗凝血藥物的應用，為抑制ADP誘導的血小板聚集、抑制血小板釋放、降低血清Fg和vWF含量而產生抗凝血作用。
[0027]漆黃素作為製備抗血栓形成藥物的應用，為顯著延長CT、PT、TT和APTT，間接起到抗血栓形成作用。
[0028]漆黃素作為製備對缺血/再灌注心肌細胞起保護作用藥物的應用，通過抑制炎症細胞侵潤、MMP-9和NF-kB的表達、NF-kB核轉移、心肌細胞凋亡等途徑降低缺血心肌細胞炎症反應，減少損傷心肌的梗死面積，產生對缺血心肌細胞的保護作用。
[0029]在實際應用中，漆黃素的劑量範圍為5~45 mg/kg ;漆黃素的製成品為藥品製劑或保健食品；漆黃素的劑型為經口、肌肉、靜脈、透皮吸收的製劑及外用製劑。
[0030]漆黃素具有抗凝血、抗血栓形成和心肌保護作用的實驗:
方法: 84隻SD大鼠，雌雄各半，隨機分為七組，分別為假手術組(Shame operation)，模型組(Model),漆黃素(Fisetin)45 mg/kg、15 mg/kg、5 mg/kg 組,槲皮素組(Quercetin)和阿司匹林腸溶片組(Aspirin)陽性對照組。前兩組用0.5%的CMC-Na溶液以10 ml/kg灌胃，其它各組分別用相應藥物的0.5%CMC-Na溶液灌胃。7 d後，在10%的水合氯醛麻醉(350 mg/kg)下，結紮左冠狀動脈前室間支30 min再灌注2 h，製備心肌缺血/再灌注損傷模型。隨後，大鼠斷尾，採血測全血凝血時間(CT) ；3.8%枸櫞酸鈉抗凝採集腹主動脈血，分離血漿，按試劑盒說明書檢測血漿凝血酶原時間(PT)、凝血酶時間(TT)和凝血活酶時間(APTT)；ELISA法檢測血漿中血管性假性血友病因子(vWF)水平。取缺血心肌，採用Annexinv/PI雙染，流式細胞儀檢測心肌細胞的凋亡情況；TTC染色法測定心肌梗死面積；HE染色法測定心肌細胞的病理性病變；免疫組化方法測定NF-kB和MMP-9的表達。結果:與模型組相比較，漆黃素各劑量組、槲皮素和阿司匹林組均顯著延長了心肌缺血/再灌注大鼠CT、PT、TT和APTT時間(P〈0.01或P〈0.05)。模型組血漿vWF的含量均顯著高於假手術組、漆黃素45mg/kg 和 15 mg/kg 劑量組、槲皮素(15 mg/kg)組和阿司匹林(47 mg/kg)組(Ρ〈0.05, P〈0.01 )。與假手術組比較，模型組心肌細胞排列紊亂、細胞壁損壞、細胞腫脹、甚至細胞核破裂、細胞顏色深淺不一以及吞噬細胞聚集。模型組心肌細胞的炎症細胞侵潤率、凋亡率方面，ΜΜΡ-9表達、NF-kB表達和NF-kB核轉移百分率均升高(P〈0.01或Ρ〈0.05)。漆黃素45 mg/kgU5mg/kg組、陽性對照組與缺血再灌注組比較，可維持心肌纖維完整性、細胞核正常性，可降低心肌細胞凋亡百分率、抑制MMP-9和NF-kB表達以及降低NF-kB核轉移百分率(P〈0.01或P〈0.05)，其作用介於假手術組和模型組之間。漆黃素對缺血再灌損傷心肌的保護作用呈劑量依賴性。
[0031]結論:漆黃素對心肌缺血/再灌注大鼠有抗血栓活性，其機制可能為顯著延長CT、PT、TT、APTT,降低血清VWF含量，其大、中劑量效果與槲皮素或阿司匹林效果相當。漆黃素通過抑制炎症細胞侵潤、MMP-9和NF-kB的表達、NF-kB核轉移、心肌細胞凋亡等途徑降低缺血心肌細胞炎症反應，減少損傷心肌的梗死面積，產生對缺血心肌細胞的保護作用。
[0032]材料和方法 1.1動物
SD大鼠，雌雄各半，體重180-220 g，由西安交通大學醫學院實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號:SCXK (陝)2007-001，實驗動物使用許可證號:SYXK (陝)2007-003。所有動物均按照陝西省動物養護和使用委員會提供的指導原則進行對待。動物房室溫(26±3)°C，相對溼度(30-70)%，每日人工照明12 h，每天上下午各換氣0.5 h按性別分籠飼養，自由飲水，餵顆粒飼料。[0033]1.2藥品和試劑
阿司匹林腸溶片，洛陽奧吉娜藥業有限公司，批號121004 ；
95%乙醇，西安化學試劑廠，批號:120612 ；
枸櫞酸鈉，天津市天力化學試劑有限公司，批號20121108 ；
硫酸氫氯吡格雷片，濟南樂康信藥業有限公司，批號080301 ；
雙嘧達莫注射液，山西亞保藥業集團股份有限公司，批號:216126 ；
鹽酸腎上腺素注射液，天津金耀胺基酸有限公司，批號070412 ；
PT試劑盒，上海太陽生物技術有限公司，批號2001092 ；
APTT試劑盒，上海太陽生物技術有限公司，批號2011102 ；
TT試劑盒，上海太陽生物技術有限公司，批號:2021036。
[0034]阿司匹林，Sigma，美國，貨號A 2093-100G ;
漆黃素，陝西昌嶽植物技術有限公司，批號121016 ；
阿司匹林腸溶片，華東醫藥(西安)博華製藥有限公司，批號1103009 ；
槲皮素，陝西昌嶽植物技術有限公司，批號121116 ；
水合氯醛，上海山浦化工有限公司，批號121004 ；
福馬林，天津市天力化學試劑有限公司，批號20120708 ；
75%酒精，寶雞市康利工貿有限公司，批號20130103 ；
二甲苯，天津市津東天正精細化學試劑廠，批號20081001 ；
磷酸氫二鈉，天津市天力化學試劑有限公司，20121108 ；
磷酸二氫鈉，天津市天力化學試劑有限公司，20121108 ；
生理鹽水，天津市天力化學試劑有限公司，批號20110508 ；
2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC，美國Sigma公司)，中國華東師範大學化工廠，
批號 20121122 ；
5%牛血清蛋白(BSA)，武漢博士德生物工程有限公司；
SABC，武漢博士德生物工程有限公司；
一抗(大鼠)，武漢博士德生物工程有限公司；
生物素化山羊抗大鼠IgG，武漢博士德生物工程有限公司；
鏈黴素親和素-生物素-過氧化酶複合物免疫組化試劑(SABC)，武漢博士德生物工程有限公司；
二氨基苯甲氨(DAB)，武漢博士德生物工程有限公司；
免疫組化試劑盒NF-kB、MMP-9，武漢博士德生物工程公司；
凱基Annexin V-EGFP/PI細胞凋亡檢測試劑盒，南京凱基生物科技發展有限公司；
1.3主要儀器
SC-2000型四通道血小板聚集儀型，上海天呈科技有限公司；
LDZ5-2尚;1_1、機，北點醫用尚;1_1、機/)^ ；
BL-420F生物機能實驗系統，成都泰盟科技有限公司；
FCR0502-UF除熱原型超純水機，青島富勒姆科技有限公司；
動物人工呼吸機DH- 150，浙江大學醫學儀器廠；
AB 135-S型電子分析天平，Mettler Toledo,瑞士；NICHIRYO自動移液器，日本；
XW-80A漩渦混合器，上海精科實業有限公司；
CQ-120超聲波清洗機，上海躍進醫用光學器械廠；
10 μ L、20 μ L微量進樣器，上海安亭微量進樣器廠；
HHS電熱恆溫水浴鍋，江蘇省醫療器械廠；
FACS Calibur 流式細胞儀，Becton Dickinson,美國；
Powerlab/8sp數據記錄和分析系統，ADInstruments, Austrilia,澳大利亞；
Leica RM 2235型徠卡手動轉輪切片機，德國徠卡；
Microm GmbH HM 505E Cryostat, Walldrof, Gernany,德國；
BL-420F生物機能實驗系統，成都臺盟科技有限公司；自動移液槍，NICHIRYO,日本；NIKON ECLIPSE BOI 顯微鏡，日本，分析系統 Image-Pro Plus 6.1 Windows S/N ;手術器械、
秒表等。
[0035]2試驗方法
2.1心肌缺血/再灌注模型的製備
84隻SD大鼠雌雄各半，隨機分為七組。分別為:假手術組，模型組，漆黃素大、中、小劑量組，槲皮素組及阿司匹林腸溶片陽性對照組，手術組和缺血再灌注組每天用0.5% CMC-Na溶液灌胃，其它各組用相應藥物的0.5% CMC-Na溶液灌胃。7 d天后，用10%水合氯溶液(4ml/kg)腹腔注射麻醉，仰臥固定，用電極插入大鼠四肢皮下記錄II導聯心電圖。氣管切開，插氣管插管。再於胸骨左緣3~4肋間開胸，暴露心臟，在左心耳與肺動脈幹間結紮左冠狀動脈前室間支，同時在結紮線與血管之間穿一段直徑1.5 mm,長0.5 cm的矽膠管,結紮30min，結紮線遠端心肌顏色發紺，心電圖表現ST段抬高或T波高聳為結紮成[14]。剪斷縫合線，取出矽膠管，缺血部位心肌顏色恢復，抬高的ST段下降50%以上外圍模型成功，再灌注
2h，假手術組僅分離前室間支，不結紮。
[0036]2.2全血凝血時間(CT)試驗
大鼠心肌缺血/再灌注造模成功後，剪大鼠尾(據末端0.5~1cm)，取血2滴血分開滴於玻璃片上(直徑4~5mm)，自血液滴在玻片上開始計時，每隔30s用Iml注射器針頭通過血滴，並挑血液一次，如見針尖挑起纖維蛋白絲，停止計時，記錄全血凝血(CT)時間。再挑動另一滴未挑過的血液作對照，並以前一滴血作為結果報告。
[0037]2.3 PT、TT、APTT 和 vWF 檢測
大鼠心肌缺血/再灌注造模成功後,腹主動脈採血,將4ml注入放有3.8%枸櫞酸鈉抗凝劑的試管中(抗凝劑和全血的比例為1:9),輕度混勻,3000r/min離心15min。首先,收集上層血漿0.8ml，放置於1.5mLEP管中，常溫下，按試劑盒說明書操作，測定凝血酶時間(TT)、凝血酶原時間(PT)及活化部分凝血活酶時間(APTT);其次，收集上層血漿0.8ml，放置於1.5mLEP管中，按照vWF試劑盒說明書測定的水平。
[0038]2.4血小板聚集抑制試驗
2.4.1採血及血小板製備
人抗凝血採自健康志願者肘前靜脈，以3.8%枸櫞酸鈉:全血為1: 9抗凝。上下顛倒試管混勻，1000r/min離心IOmin,製備富血小板血眾(PRP);吸取上清後,3000r/min離心lOmin，製備貧血小板血漿(PPP)，取無溶血現象的血漿備用。用PPP調節PRP中血小板數，使達到250個/nL。為了避免血小板被激活，以上操作均在室溫下進行。
[0039]2.4.2藥物溶液配製 漆黃素(6X10_3mol/L):稱取漆黃素固體1.72mg，加l%Na2C03溶液127 μ L，超聲溶解，加生理鹽水至lmL，並調節PH至7.0。槲皮素(6X 10_3mol/L):稱取槲皮素固體1.81mg，加1% Na2CO3溶液159 μ L，超聲溶解，加生理鹽水至lmL，並調節PH至7.0。雙嘧達莫(120父10-611101/1):取雙嘧達莫注射液(21^: 10mg)12.1 μ L，加生理鹽水至lmL。阿司匹林(3mg/mL):取3mg阿司匹林溶於適量l%Na2C03水溶液中，調PH至7.0,總體積為lmL。氯吡格雷(360 μ g/mL):稱取0.36mg固體，加生理鹽水至lmL。3.8%枸櫞酸鈉:取1.9g枸櫞酸鈉固體，加生理鹽水溶解至50mL。NE (120 μ mol/L)的配製:取鹽酸腎上腺素注射液(lmg/mL) 13.2 μ L，加生理鹽水至500mL。阿司匹林臨用前溶於適量l%Na2C03水溶液中，以0.9%氯化鈉稀釋，以HCl調節pH值至7.0。ADP用生理鹽水配製成3 000 μ mo I/L的溶液分裝備用，臨用前用生理鹽水稀釋至所需濃度。
[0040]2.4.3血小板聚集實驗步驟
取含血小板數為250個/nL的血漿300 μ L，置四通道血小板聚集儀的測定樣品方杯中，分別加入生理鹽水、漆黃素(終濃度分別為I X 10' I X 10' I X 10' I X 10' I X I(T8和 I X l(T10mol/L)、槲皮素(終濃度分別為 I X 10' I X 10' I X 10' I X 10' I X I(T8 和lXl0.mol/L)、氯吡格雷(終濃度為3 X Kr5 mol/L)、和雙嘧達莫(終濃度為2X1(T6 mol/L)和阿司匹林(終濃度為2.8X10_4 mol/L)，37°C培育20 min後，用PRP調節透光率為0%，用PPP調節透光率為100%。各受試管分別加入ADP (終濃度為20 μ mol/L)和腎上腺素(終濃度為2 μ mol/L)、誘導血小板活化，同時加入磁子攪拌後，開始計時，記錄血小板抑制率。並計算血小板聚集抑制率(%)=(對照組血小板聚集率-給藥組血小板聚集率)/對照組血小板聚集率X 100%。
[0041]2.5心肌細胞凋亡的測定
Annexinv/PI雙染，流式細胞儀測定心肌細胞凋亡水平:再灌注後取缺血區心肌組織5mm3約70 mg,步驟:(I)將左心室肌至於5-6 mL D-Hanks液中剪碎洗淨,後棄去D-Hanks液體；(2)加入0.08%胰蛋白酶10 mL、室溫、輕搖消化5 min ; (3)過200目尼龍網並收集濾液，加含小牛血清的培養液10 mL終止消化；(4)於1800 r/min離心10 min,棄去上清液,加含小牛血清的培養液5 mL，吹散細胞、於1800 r/min再離心10 min，棄去上清液；(5)加PBS ImL，吹散細胞，取200 μ L細胞懸液做流式，將細胞重懸於300 μ L Binding Buffer，加入3μ L Annexin V-EGFP 和 3 μ L Propidium 1dide (PI)，混勻，室溫避光反應 20 min,上機檢測，自動計算凋亡心肌細胞的百，結果判斷:Annexin V —/PI —為正常細胞，Annexin V VPI 一為凋亡細胞，Annexin V +/PI+為壞死細胞；(6)取200 μ L做流式；(7)按照AnnexinV-EGFP/PI細胞凋亡檢測試劑盒說明書方法加試劑；(8)上機檢測[15_17]。
[0042]2.6 NF-kb 和 MMP-9 表達的測定
免疫組化方法測定NF-kB和MMP-9的表達:①MMP-9:取材同上，石蠟切片常規脫蠟，3%H202室溫20 min滅活內源性過氧化物酶，蒸餾水洗3次。用0.01 mmol/L枸櫞酸鹽緩衝液(PH6.0)進行抗原熱修復。磷酸鹽緩衝液(PBS) (pH7.2)洗滌2次。滴加5%牛血清蛋白(BSA)封閉，室溫放置20 min。甩去多餘液體，滴加1: 100稀釋的一抗(大鼠)，4°C放置過夜。PBS (pH7.2)洗3次，每次2 min。滴加生物素化山羊抗大鼠IgG，37°C反應20 min。PBS (pH7.2)洗3次，每次2 min。滴加鏈黴素親和素-生物素-過氧化酶複合物免疫組化試劑(SABC)，37 °C反應30 min。PBS (pH7.2)洗4次，每次5 min。二氨基苯甲胺(DAB)顯色劑室溫顯色，鏡下控制反應時間，HE輕度復染，脫水，透明，封片，顯微鏡觀察MMP-9表達情況
[18]。②NF-kB:再灌注2 h後，取左心室前壁的部分肌肉組織，10%福馬林固定，酒精梯度脫水，二甲苯透明，常規石蠟包埋切片，免疫組化染色按試劑盒說明書採用SABC法、DAB顯色、蘇木精復染，中性樹膠封固。鼠抗NF-kB p65單克隆抗體與NF-kB結合後理論上顯棕黃色顆粒。每組取8個樣本，於高倍顯微鏡(400倍)下，每個樣本取5個視野，統計NF-kB表達及其核轉移百分率[19】]。實驗設備，Olympus BX51 Positive Position FluorescenceMicroscope, Japan。圖像分析軟體，Image Pro Plus6.0圖像分析系統。
[0043]2.7心肌細胞梗死面積
TTC染色法測定心肌梗死面積:再灌注2 h後，經主動脈根部注入0.1~0.2 mL 1%TTC緩衝液，每組4例，將心臟置於37 °C恆溫箱孵化30 min後，再放置於_20°C冰箱冷凍20 min。用生理鹽水清洗，去除附著的血管和脂肪，從心尖到心基底平行切取I mm厚心肌片。正常心肌組織將被染成紅色，梗死區為灰白色，照相，用Image Pro Plus6.0圖像分析系統統計梗死面積[21_24]。
[0044]2.8心肌細胞病理變化測定
HE染色法測定心肌細胞的病理性變化:再灌注2 h後，每組8例，取左心室前壁70大小心肌肉組織塊，10%福馬林固定，酒精梯度脫水，二甲苯透明，常規石蠟包埋切片，進行蘇木素-伊紅(HE)染色，光學顯微鏡下觀察心肌組織形態學變化[25』26]。
[0045]2.9統計分析方法
用統計學軟體spssl3.0處理數據，結果均用均數土標準差(土 SEM )表示，組間比較採用t檢驗，P〈0.05表示有統計學差異，P〈0.01表示有顯著性差異。用GraphPad Prism
5.0軟體繪圖。
[0046]3實驗結果
3.1動態心電圖監測
圖1可見，假手術組大鼠的心電圖變化正常。圖2可見，冠狀動脈結紮後，心電圖ST段聞抬/T波聞聳，標誌造|旲成功。
[0047]3.2心肌缺血/再灌注大鼠全血凝血時間
圖3可見，與模型組相比較，漆黃素各劑量組、槲皮素和阿司匹林組均顯著延長了心肌缺血/再灌注大鼠CT時間(P〈0.01或Ρ〈0.05)，漆黃素45mg/kg、15mg/kg延長CT效果與阿司匹林(47mg/kg)劑量組或槲皮素(15mg/kg)沒有顯著性差異。結果表明，漆黃素可明顯延長心肌缺血/再灌注大鼠全血凝血時間。
[0048]圖3為漆黃素對心肌缺血/再灌注大鼠全血凝血時間的影響(χ土SEM，n=12，與模型組比較，**P<0.01，*P<0.05)
3.3心肌缺血/再灌注大鼠PT、TT、APTT
由圖4、圖5和圖6可見，同模型組相比，漆黃素45mg/kg、15mg/kg和5mg/kg三個劑量組PT、TT和APTT顯著延長(P〈0.01或P〈0.05)，且對PT的影響呈劑量相關性。與模型組比較，槲皮素(15mg/kg)組和阿司匹林(47mg/kg)組可延長ΡΤ(Ρ〈0.05)。結果表明，漆黃素可延長心肌缺血再灌大鼠PT、TT和APTT值，具有抗凝血作用，且延長TT和APTT的效果優於槲皮素和阿司匹林。
[0049]3.4心肌缺血/再灌注大鼠vWF因子
圖7可見，模型組血漿vWF的含量均顯著高於假手術組、漆黃素45mg/kg和15mg/kg劑量組、槲皮素(15mg/kg)組和阿司匹林(47mg/kg)組(P〈0.05，P〈0.01)。與假手術組相比較，阿司匹林顯著降低了血漿vWF的含量(P〈0.01)。結果表明，漆黃素可降低心肌缺血再灌大鼠血漿vWF的含量，具有抗血小板聚集作用。
[0050]3.5血小板聚集試驗
圖8可見，I X KT9M~I X KT5M漆黃素、雙嘧達莫(終濃度為2X10—6 mol/L)、氯比格雷(終濃度為3X10_5 mol/L)和阿司匹林(終濃度為2.8X10_4 mol/L)同模型組相比有顯著性差異(P〈0.01)。圖9可見，使用Scott比值法計算漆黃素的IC5tl為4.54XlO-7M,槲皮素IC502.71 X IO-7M,漆黃素和槲皮素對人血小板聚集的影響呈劑量相關性。結果表明漆黃素能顯著抑制血小板聚集率，且比雙嘧達莫、氯比格雷和阿司匹林作用效果明顯。
[0051]3.6心肌細胞凋亡率
圖10可見，流式細胞儀檢測Annexinv-EGFP標記的心肌細胞調亡情況，模型組與假手術組比較，心肌細胞凋亡率升高(P〈0.05)。45mg/kg和15mg/kg漆黃素組、槲皮素組和阿司匹林組，與模型組比較，可顯著抑制缺血再灌注大鼠心肌細胞凋亡(P〈0.01或P〈0.05)，漆黃素抑制缺血再灌注大鼠心肌細胞的凋亡有劑量依賴關係。
[0052]3.7 MMP-9 和 NF_kb 的表達
MMP-9參與炎症反應，主要表達在細胞質中，染色呈淡黃色顆粒。圖11可見，模型組與假手術組比較表達有顯著差異(P〈0.01)，45mg/kg漆黃素組、15mg/kg漆黃素組及槲皮素組與模型組比較，抑制MMP-9表達(P〈0.01)，其分布和密度都減少。15mg/kg漆黃素組和15mg/kg槲皮素組效果相當。
[0053]NF-kb具有逆轉錄功能的結構蛋白，表達與細胞質中。模型組與假手術組比較，黃色顆粒密度大、分布廣、核轉移顯著(p〈0.01)。漆黃素各組及槲皮素組與模型組比較，可明顯抑制其表達和核轉移(P〈0.01)。槲皮素組較15mg/kg漆黃素組抑制其表達作用接近。見圖12和圖13。
[0054]3.8心肌細胞梗死面積
圖14可見，大鼠心肌缺血再灌注後TTC染色，選擇染色紅色的正常心肌，進行灰度統計，結果顯示，各組正常心肌面積，模型組與正常組比較，有較大面積梗死(P〈0.01);漆黃素各劑量組、槲皮素、阿司匹林與模型組比較，顯著降低了心肌梗死面積(p〈0.01或P〈0.05)，且漆黃素各組有劑量依賴性。結果表明，漆黃素可抑制心肌缺血再灌大鼠的缺血心肌的壞死。
[0055]3.9心肌細胞病理變化
模型組與假手術組(p〈0.01)比較心肌細胞結構變化明顯，心肌肌絲排列紊亂，橫紋模糊不清楚，肌原纖維明暗帶清晰；模型組心肌細胞嚴重水腫，大量吞噬細胞聚集，細胞膜模糊，細胞核腫脹、變淡、破裂溶解，肌絲斷裂、溶解；漆黃素各劑量組、槲皮素組與模型組比較心肌纖維結構損傷程度明顯減輕，心肌肌絲排列整齊，橫紋清楚，細胞、細胞核膜完整，肌原纖維明暗清晰(p〈0.01或P〈0.05)。見圖15。
【權利要求】
1.漆黃素作為製備抗凝血藥物的應用，為抑制ADP誘導的血小板聚集、抑制血小板釋放、降低血清vWF含量而產生抗凝血作用。
2.漆黃素作為製備抗血栓形成藥物的應用，為顯著延長CT、PT、TT和APTT，間接起到抗血栓形成作用。
3.漆黃素作為製備對缺血/再灌注心肌細胞起保護作用藥物的應用，通過抑制炎症細胞侵潤、MMP-9和NF-kB的表達、NF-kB核轉移、心肌細胞凋亡途徑降低缺血心肌細胞炎症反應，減少損傷心肌的梗死面積，產生對缺血心肌細胞的保護作用。
4.根據權利要求1、2或3所述的漆黃素作為製備抗凝血、抗血栓形成和心肌保護作用藥物的應用，其特徵在於:漆黃素的劑量範圍為5~45 mg/kg。
5.根據權利要求1、2或3所述的漆黃素作為製備抗凝血、抗血栓形成和心肌保護作用藥物的應用，其特徵在於:漆黃素的製成品為藥品製劑或保健食品。
6.根據權利要求1、2或3所述的漆黃素作為製備抗凝血、抗血栓形成和心肌保護作用藥物的應用，其特徵在於: 漆黃素的劑型為經口、肌肉、靜脈、透皮吸收的製劑及外用製劑。
【文檔編號】A61P9/10GK103536587SQ201310384907
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2013年8月30日 優先權日:2013年8月30日
【發明者】龍麗輝, 李亞軍, 劉凱歌, 曹永孝, 郭增軍, 馬星明, 劉琳潔 申請人:西安醫學院附屬醫院