特異性抑制PADI2基因表達的siRNA及其重組載體和應用的製作方法

2023-06-01 15:03:51 2

本發明涉及分子生物學與生物醫藥技術領域，具體為一種特異性抑制padi2基因表達的sirna及其重組載體和應用。

背景技術：

rna幹擾(rnainterference,rnai)是動植物中廣泛存在的序列特異性轉錄後基因沉默機制。1998年美國科學家andrewfire在秀麗新小杆線蟲c.elegans體內首次發現將正義鏈和反義鏈的混合物(即dsrna)所產生的基因沉默效應至少10倍於反義核苷酸的抑制作用，而且能在子代中誘導出同樣的基因抑制現象。對rnai現象的機理研究表明，微量sirna即能通過轉錄後基因沉默使大量靶rna沉默，而這種高效、特異降解同源rna從而導致序列特異性基因沉默的關鍵性分子是長為21-23鹼基的小雙鏈寡核苷酸，也稱作小幹擾rna(sirna)。進一步研究發現短於21bp或者長於25bp的雙鏈rna均不能有效啟動rnai，而且其中只要有一個鹼基錯配，基因沉默的效應就明顯減退甚至消失，充分體現了sirna作用的特異性。

顯示出強大基因沉默效能的sirna作為近年來生物技術的重大發現而備受矚目，正是因為它具有特異性和高效性阻斷同源基因的基因抑制功能，是基因功能研究強有力的工具。sirna具有許多傳統方法無法比擬的優勢和特點。目前雖然已有一些抑制特定基因表達的方法，如反義rna、基因敲除(knockout)等，但sirna顯示出了明顯優於這些技術的優勢：與反義rna相比，它具有更高的特異性和持續性；與複雜耗時的基因敲除相比，sirna是更簡便有效的手段。目前利用sirna作為基因沉默的方法被廣泛用於惡性腫瘤機制的研究，研究的關鍵點主要集中在如何提高基因沉默效能，包括靶基因位點選擇、導入系統的優化和對宿主細胞功能的影響等，並由此推動了以該技術為基礎的腫瘤特異高效靶向治療策略的研發進程。

卵巢癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一，其病死率居各類婦科腫瘤的首位。卵巢癌治療最大的障礙是腫瘤細胞耐藥性的產生，特別是出現多藥耐藥。隨著鉑類/泰素藥物聯合化療的實施，卵巢癌的初次化療反應率可達80％。但大多數患者在2～3年內復發。對復發後卵巢癌，即使再採用作用機制完全不同的化療藥物，也產生耐藥，從而使腫瘤治療後生存率得不到顯著的提高。晚期卵巢癌的五年生存率始終徘徊在20～30％。高復發率和復發後的高耐藥率是卵巢癌高死亡率最主要的原因之一，尋找卵巢癌化療耐藥的解決方案是目前腫瘤研究的重要課題。

分子靶向藥物和化療聯合應用是目前提高惡性腫瘤患者生存率最有前景的治療方法。padi2(peptidylargininedeiminase2)是肽基精氨酸脫亞氨酶家族的一員，基因位於染色體1p36.13，padi2能催化蛋白質在翻譯後去亞氨基，將精氨酸殘基轉換為瓜氨酸。padi2具有不同的底物特異性和組織特異性表達模式，已知的底物包括中樞神經系統髓磷脂鹼蛋白、骨骼肌和巨噬細胞中的波形蛋白等。padi2最早被認為在神經退行性疾病包括阿爾茨海默氏病和多發性硬化症的發病和發展中起作用。近年來，陸續有一些研究在乳腺癌、宮頸鱗狀細胞癌、結腸癌、肝癌、肺癌組織中都檢測到padi2的表達增高，雖然到目前為止padi2在腫瘤發生中的具體功能及其作用機制尚不清楚，但padi2參與了腫瘤的發展進程已經被逐步認識。我們先期的研究表明在卵巢癌細胞中padi2也有高表達，並且發現在卵巢癌紫杉醇耐藥細胞株a2780/taxol中有異常升高的現象，但該基因是否與卵巢癌發病和卵巢癌耐藥有關還有待進一步研究。因此，採用rnai技術對卵巢癌耐藥細胞株中padi2基因表達進行幹擾，將是對卵巢癌發病機制的重要補充，是對卵巢癌及其耐藥治療的重要探索和應用。

技術實現要素：

本發明的目的在於提供一種特異性抑制padi2基因表達的sirna，用於卵巢癌發病機制研究。本發明的另一個目的在於提供該sirna在製備治療卵巢癌和逆轉卵巢癌紫杉醇耐藥的藥物中的應用。

為實現上述目的，本發明採用如下技術方案：

本發明設計、合成3對特異性抑制padi2基因表達的sirna，轉染到卵巢癌紫杉醇耐藥細胞株a2780/taxol中，結果發現s1抑制padi2基因表達的幹擾效果最明顯。

本發明提供了一種特異性抑制padi2基因表達的sirna(s1)，包括正義鏈和反義鏈，

所述正義鏈：5』-aauguacagaacuaucucgua-3』(seqidno.1)；

所述反義鏈：5』-cgagauaguucuguacauuuc-3』(seqidno.2)。

作為優選，所述正義鏈和反義鏈的5』和3』端的3個鹼基進行2』-甲氧基修飾。本發明研究證明，2』-甲氧基修飾後的sirna(s1)穩定性增加，能提高其在體內抵抗核糖酶的水解的能力，降低免疫刺激反應，延長sirna幹擾基因表達下調的作用時間，使其作用具有高效性、特異性。

本發明提供了一種包含編碼所述sirna的dna序列的rna幹擾試劑盒。所述試劑盒中包含克隆了所述sirna的dna質粒載體，應用時，該質粒載體在真核細胞中轉錄表達所述的sirna，進而沉默padi2基因的表達。

本發明提供了一種含有編碼所述sirna的dna序列的重組載體。作為優選，採用的原始載體為慢病毒載體plko.1puro。

本發明還提供了重組載體的構建方法，包括：

(1)合成padi2-s1片段，選擇agei和ecori兩個酶切位點，根據s1的序列，設計其shrna序列，序列如下：

正義鏈：

5』-ccgggtaatgtacagaactatctcgtattcaagagatacgagatagttctgtacatttcttttttggtacc-3』(seqidno.7)；

反義鏈：

5』-aattggtaccaaaaaagaaatgtacagaactatctcgtatctcttgaatacgagatagttctgtacattac-3』(seqidno.8)；

(2)退火得到padi2-s1的dna片段；

(3)用慢病毒載體plko.1puro構建plko.1-padi2-sh1重組載體。

本發明提供的sirna能夠高效特異性抑制卵巢癌細胞padi2基因的表達，減少細胞增殖，增加細胞凋亡，降低細胞遷移和侵襲能力，因此，所述sirna和重組載體作為padi2基因表達抑制劑可以應用於腫瘤疾病發病機制的研究當中。

本發明提供了所述sirna和重組載體在製備padi2基因表達抑制劑中的應用。

本發明提供了所述sirna和重組載體在製備治療卵巢癌、乳腺癌、宮頸鱗狀細胞癌、結腸癌、肝癌或肺癌藥物中的應用。

本發明研究表明，紫杉醇耐藥株a2780/taxol轉染所述sirna後，該細胞株對紫杉醇的敏感性明顯提高，逆轉指數為14.39，說明本發明提供的sirna對紫杉醇耐藥株a2780/taxol的耐藥具有非常顯著的逆轉效果，因此，所述sirna對逆轉卵巢癌紫杉醇耐藥的治療具有潛在應用價值。

本發明提供了所述的sirna和重組載體在製備逆轉卵巢癌紫杉醇耐藥的藥物中的應用。

本發明具備的有益效果：

本發明提供的sirna能夠特異性、高效地抑制padi2基因的mrna和蛋白表達，減少腫瘤細胞增殖，增加細胞凋亡，降低腫瘤細胞遷移和侵襲能力，並能有效逆轉卵巢癌細胞對紫杉醇的耐藥。將其應用於腫瘤發病機制研究以及製備腫瘤治療及逆轉卵巢癌耐藥治療的藥物中，具有重要意義。

附圖說明

圖1為qrt-pcr檢測a2780細胞和a2780/taxol細胞padi2mrna表達。

圖2為westernblotting檢測a2780細胞和a2780/taxol細胞padi2蛋白表達。

圖3為qrt-pcr檢測s1，s2，s3轉染48h後a2780/taxol細胞padi2mrna表達。

圖4為westernblotting檢測s1，s2，s3轉染72h後a2780/taxol細胞padi2蛋白表達。

圖5為plko.1-padi2-sh1重組質粒及插入酶切位點示意圖。

圖6為小發卡shrna示意圖。u6啟動子指導下遊小發卡shrna的轉錄；包括23個s1正義鏈鹼基，23個s1反義鏈鹼基。

圖7為westernblotting檢測轉染plko.1-padi2-sh1後a2780/taxol細胞padi2蛋白表達。

圖8為相差顯微鏡觀察轉染plko.1-padi2-sh1後a2780/taxol細胞數量和形態變化。

圖9為溴標法檢測轉染plko.1-padi2-sh1後a2780/taxol細胞的增殖。

圖10為caspase3活性檢測轉染plko.1-padi2-sh1後a2780/taxol細胞的凋亡。

圖11為細胞劃痕實驗檢測轉染plko.1-padi2-sh1後a2780/taxol細胞遷移能力。

圖12為transwell檢測轉染plko.1-padi2-sh1後a2780/taxol細胞遷移能力和侵襲能力。

圖13為轉染plko.1-padi2-sh1後a2780/taxol細胞對紫杉醇耐藥的逆轉。

具體實施方式

下面結合實施例對本發明作進一步說明。以下的實施例中採用的方法目的是更好地理解本發明，但並不限於本發明。如無特殊說明，實施例中涉及的實驗方法均為常規方法，所用的實驗材料均為常規試劑公司購買。

採用spss18.0統計分析軟體，各樣本數據以均數±標準差表示，兩組之間的差異用t檢驗(independent-samplettest)，多組之間的檢驗用單因素方差分析(one-wayanova)，ic50使用probit回歸分析，p＜0.05有統計學差異。

卵巢癌細胞株a2780及卵巢癌紫杉醇耐藥細胞株a2780/taxol由浙江省女性生殖健康研究重點實驗室細胞庫保存；

鼠抗人padi2一抗(cat.66386-1-ig)、鼠抗人gapdh一抗(cat.60004-1-ig)、辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠igg(h+l)二抗(cat.sa00001-1)均購自proteintech公司；

westernblottingluminolreagent檢測試劑盒(cat.sc-2048)購自santacruz公司；

cdna逆轉錄試劑盒primescripttmrtmastermix(cat.rr036a)、螢光定量pcr檢測試劑盒sybrpremixextaq(perfectrealtime,cat.drr041a)購自takara公司；lipofectamine3000轉染試劑盒(cat.l3000008)購自invitrogen公司；

真核表達載體選擇rnai載體plko.1puro，源於全球科學家質粒共享非盈利組織addgene；

限制性內切酶agei(cat.r0552s)、ecori(cat.r0101s)、kpni(cat.r0142s)購自neb公司；t4連接酶(cat.2011a)、dna片段純化試劑盒(cat.9761)、dna凝膠回收試劑盒(cat.9762)、質粒dna小量純化試劑盒(cat.9760)均購自takara公司；

sirna由takara公司合成；pcr引物及克隆用dna由上海生工生物工程公司合成；

預染蛋白marker(cat.26616)購自fermentas公司；

溴標法細胞增殖檢測試劑盒cellproliferationelisa,brdu(colorimetric,cat.11647229001)購自roche公司；

caspaceassaysystem(colorimetric，cat.g7351)購自promega公司；

細胞遷移、侵襲模型transwellpermeablesupports(cat.3428)購自corning公司；

lab-tekiichamberslidesystem—lab-tek腔室玻片系統購自nunc公司(cat.154526)；

bdmatrigeltmbasementmembranematirx基質膜(cat.356234)購自bd公司；

sirna陰性對照allstarsnegativecontrolsirna(cat.1027281)購自qiagen公司；

sds-page凝膠配置試劑盒(cat.cw0022m)購自康為世紀公司；

0.45umpvdf膜(cat.ipvh00010)購自millipore公司；

紫杉醇(cat.p106868)購自aladdin公司。

實施例1.卵巢癌細胞株a2780及其紫杉醇耐藥細胞株a2780/taxol中padi2表達差異的研究

一、實時螢光定量rt-pcr(qrt-pcr)檢測padi2基因mrna表達

培養48h後吸棄6孔板中的培養基，用pbs洗滌兩次後用trizol抽提總rna，thermonanodrop2000分光光度儀測定rna濃度，並按sybrpremixextaq(perfectrealtime)試劑盒說明書操作。第一步rna變性。反應體系：rna0.5ug，去rna酶depc水補足至6.8ul；反應條件：70℃孵育10min後置於冰上。第二步逆轉錄。反應體系：按照primescriptrtmastermix試劑盒說明書進行逆轉錄；反應條件：42℃孵育60min，85℃滅活5min後，-20℃保存。

取1ul逆轉錄產物進行螢光定量pcr反應。pcr引物序列：

5』-gtggaggcggtgtacgtg-3』；

5』-ggaatgctcccttcctcgtc-3』，產物長度：272bp；

反應條件：95℃10s，95℃5s，6℃30s，共40個循環。

採用2-△ct法計算各組樣本中padi2mrna的表達量。

結果：如圖1所示，a2780/taxol細胞和它的親本細胞a2780相比，padi2mrna表達增高了78.17％(p＜0.05)，表明在紫杉醇耐藥細胞株中padi2mrna表達顯著增高。

二、westernblotting檢測padi2蛋白表達

培養72h後吸棄6孔板中的培養基，pbs洗滌3次，加入ripa蛋白裂解液(100ul/孔)，吹打數次，冰上孵育5min，使之充分裂解，4℃，12000轉離心5分鐘，收集上清，分裝-20℃貯存；每個樣品95℃變性5min後取10ul上樣，8％sds-page電泳，200v，10min；100v，100min；轉至pvdf膜：110v，120min；用含5％脫脂奶粉的tbs封閉液封閉60min；一抗孵育：padi2一抗(1：2000)、gapdh一抗(1：5000)室溫下孵育2h；tbs洗膜10min×3次；二抗孵育：辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠igg(h+l)二抗(1：10000)孵育1h；tbst洗膜10min×3次，tbs洗膜10min×1次；ecl顯影后，用imagequantlas4000mini(gehealthcare)對圖象掃描處理。

結果：如圖2所示，a2780/taxol細胞和它的親本細胞a2780相比，padi2蛋白表達也顯著增高(p＜0.05)。

實施例2.padi2sirna設計合成

在genebank中查獲padi2基因mrna序列(nm_007365.2)，用sidirectver2.0軟體(http://sidirect2.rnai.jp/)在線設計獲得3對sirna序列(如seqidno.1-seqidno.6)所示。設計過程中選擇同時滿足文獻報導的三種算法(ui-tei×reynolds×amarzguioui)的序列，並選擇sirna作用特異性最高的23nt長度片段，該設計可避免將來體內實驗時發生幹擾素樣免疫反應，選擇起始密碼子後100nt，避開5』和3』端utr區，gc含量控制在30-70％。共選擇3對23nt長度的sirna作為實驗篩選幹擾片段，結構特徵表現為正義鏈和反義鏈3』端各有兩個鹼基外掛，結構特點如下

隨後用blastn(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)在線進行同源性搜索，排除有同源性的序列，儘可能避免非特異性片段對sirna特異性作用效應的影響。

最後在化學合成時對正義鏈和反義鏈的5』和3』端連續3個嘌呤(嘧啶)鹼基進行2』-ome(2』-甲氧基)修飾，增加sirna分子在細胞內的化學穩定性，延長sirna幹擾基因表達下調的時間和效應。最終的序列和修飾如表1和式(ⅰ)如下：

表1

實施例3.三對padi2sirna在卵巢癌紫杉醇耐藥株a2780/taxol中對padi2基因幹擾效果的檢測和篩選

一、實驗分組：

1.a2780/taxol正常組(不轉染sirna)，以下稱作ar；

2.a2780/taxol陰性對照組(轉染陰性對照sirna)，以下稱作ar-n；

3.a2780/taxol實驗組(轉染s1)，以下稱作ar-s1；

4.a2780/taxol實驗組(轉染s2)，以下稱作ar-s2；

5.a2780/taxol實驗組(轉染s3)，以下稱作ar-s3。

二、分組轉染

為確保轉染效率，降低細胞毒性，我們採用lipofectamine3000轉染試劑進行sirna轉染。轉染前一天，胰酶消化細胞並計數，細胞鋪板在六孔板中，使其在轉染日密度0.5×106/ml，細胞融合至70-90％。每孔用125μl無血清opti-mem培養基稀釋5ullipofectamine3000試劑並充分混勻；製備sirna預混液，用125μl無血清opti-mem培養基稀釋sirna至終濃度為50nm，並充分混勻；在已稀釋的lipofectamine3000試劑中加入sirna預混液(1:1)，室溫孵育5min；最後將sirna-脂質體複合物加入細胞中，37℃，5％的co2中繼續培養。48h後檢測padi2mrna表達，72h後檢測padi2蛋白表達。

三、實時螢光定量rt-pcr(qrt-pcr)檢測padi2基因mrna表達

檢測步驟同前，採用2-△ct法計算各組樣本中padi2mrna的表達量。

結果：如圖3所示，a2780/taxol細胞分別轉染s1、s2、s3後，padi2mrna的表達均有明顯下降，其中s1幹擾效果與陰性對照組比較，padi2mrna下調了79.46％，與s2(40.84％)和s3(54.73％)相比，有顯著差異(p＜0.05)。結果表明，s1對padi2有最好的幹擾效果。

四、westernblotting檢測padi2蛋白表達

檢測步驟同前，ecl顯影后，用imagequantlas4000mini(gehealthcare)對圖象掃描處理。

結果：如圖4所示，與陰性對照相比，s1轉染後，a2780/taxol細胞中padi2蛋白表達顯著下降(p﹤0.05)，且與s2和s3相比有顯著差異(p﹤0.05)。結果表明，在紫杉醇耐藥株a2780/taxol中，s1對padi2的蛋白表達具有最好的幹擾效果。故經過篩選，s1被選擇作為後續研究的sirna。

實施例4.真核載體plko.1-padi2-sh1的構建及對padi2基因表達的幹擾效果檢測

一、實驗分組：

1.a2780/taxol正常組(不轉染任何載體)，以下稱作ar；

2.a2780/taxol陰性對照組(轉染plko.1puro空載體)，以下稱作ar-n；

3.a2780/taxol實驗組1(轉染plko.1-padi2-sh1)，以下稱作ar-sh1；

二、合成padi2-s1片段

選擇agei和ecori兩個酶切位點，根據s1的序列，設計其shrna序列並構建到真核表達載體plko.1puro中。序列如下：

正義鏈：

5』-ccgggtaatgtacagaactatctcgtattcaagagatacgagatagttctgtacatttcttttttggtacc-3』(seqidno.7)；

反義鏈：

5』-aattggtaccaaaaaagaaatgtacagaactatctcgtatctcttgaatacgagatagttctgtacattac-3』(seqidno.8)；

三、真核載體plko.1-padi2-sh1的構建

用真核表達載體plko.1puro構建plko.1-padi2-sh1重組表達載體(圖5和6)，具體方法參見美國冷泉港出版社《分子克隆實驗指南》。

將padi2-s1正義鏈和反義鏈經退火程序(95℃變性2min；緩慢冷卻退火至25℃)，4℃保存。agei和ecori完全酶切載體plko.1puro，37℃過夜；酶切產物用dna凝膠回收試劑盒回收dna。退火產物與載體酶切回收片段進行連接反應，反應體系(10ul)：t4連接酶1ul，t4連接酶緩衝液1ul，退火產物與載體酶切回收片段混合物(摩爾比3:1)；去離子水補至10ul，16℃連接過夜；取5ul連接產物置於100uljm109感受態細菌中，冰浴30min，42℃熱休克90s，冰浴5min，加lb培養基1000ul，37℃搖床培養30min，5000rpm離心5min，棄上清，將細菌均勻塗布於lb平板上(含50ug/ml氨苄青黴素)，37℃倒置培養過夜；挑選若干獨立菌落接種於含相應抗性的lb培養基中，37℃震蕩過夜擴菌；收集細菌，用質粒dna純化試劑盒抽提獲得質粒dna，kpni酶切鑑定，獲得plko.1-padi2-sh1重組質粒。

四、plko.1-padi2-sh1重組質粒轉染細胞後觀察幹擾效果

將plko.1-padi2-sh1轉染入對數生長期的a2780/taxol細胞中。轉染參照lipofectamine3000操作說明書，每孔用125μl無血清opti-mem培養基稀釋5ullipofectamine3000試劑並充分混勻；在125μl無血清opti-mem培養基中加入5ug重組質粒dna，加入p3000試劑10ul，充分混勻，製備重組質粒預混液；在已稀釋的lipofectamine3000試劑中加入重組質粒預混液(1:1)，室溫孵育5mim；最後將重組質粒-脂質體複合物250ul加入細胞中，37℃，5％的co2中繼續培養。72h後檢測padi2蛋白表達。

如圖7所示，轉染plko.1-padi2-sh1重組質粒後，與陰性對照(轉染空質粒)相比，a2780/taxol細胞中padi2蛋白表達顯著下降(p﹤0.05)，結果表明，轉染plko.1-padi2-sh1重組質粒能有效幹擾padi2的蛋白表達。

實施例5.轉染plko.1-padi2-sh1特異性阻斷padi2表達後對腫瘤細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響

一、實驗分組：

1.a2780/taxol正常組(不轉染任何載體)，以下稱作ar；

2.a2780/taxol陰性對照組(轉染plko.1puro空載體)，以下稱作ar-n；

3.a2780/taxol實驗組(轉染plko.1-padi2-sh1)，以下稱作ar-sh1。

二、分組轉染

轉染步驟同前，轉染後繼續培養細胞，用於檢測細胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲。

三、細胞增殖試驗

細胞在96孔板中轉染plko.1-padi2-sh1後繼續培養72h，每孔加入10ulbrdu標記液至brdu終濃度為10um，37℃孵育2h；吸除brdu標記液，每孔加入200ulfixdenat，20℃孵育30min；吸除fixdenat，每孔加入100ulanti-brdu-pod，20℃孵育90min；每孔200ulwashingsolution洗滌3次；加入100ul/孔底物溶液，20℃孵育20min，檢測波長370nm(參考波長492nm)測吸光度(a)，細胞增殖的能力用a實驗組/a對照組表示。

結果如圖8和圖9所示，在a2780/taxol細胞中，轉染plko.1-padi2-sh1後，相差顯微鏡下觀察可見，實驗組細胞數量明顯減少，懸浮細胞數量增加，細胞碎片增多；溴標法測試細胞增殖結果顯示：與陰性對照相比，實驗組細胞增殖能力下降了61.73％，有顯著性差異(p＜0.05)。說明特異性阻斷padi2的表達後，能抑制腫瘤細胞增殖。

四、caspase3活性檢測細胞凋亡

轉染72h後收集細胞，裂解液調整細胞密度為1×108/ml，冰上裂解15min，15000g×20min，收集上清。按照caspaceassaysystem(colorimetric)說明書同時製備陽性和陰性對照樣品，測定並調整各組蛋白濃度相同。96孔板中每孔加入caspaceassaybuffer32ul，dmso2ul，100nmdtt10ul，去離子水調整體積為98ul，加入2uldevd-pna底物，37℃孵育4h，檢測波長405nm測吸光度，用δa法計算每組樣品caspase3活性。

結果如圖10所示，a2780/taxol細胞轉染plko.1-padi2-sh1後，caspase3活性增加了3.23倍，與陰性對照比較，有顯著性差異(p＜0.05)，說明特異性阻斷padi2的表達後，能促進腫瘤細胞凋亡。

五、細胞劃痕試驗檢測細胞遷移能力

在六孔板背後用直尺均勻劃橫線，約0.5cm劃一道，橫穿過孔，每孔至少有6條橫線。細胞轉染plko.1-padi2-sh1後，繼續培養24h細胞融合成單層狀態時，在選定區域用200ul的槍頭在六孔板中垂直劃痕，pbs洗3次去除劃下的細胞，加入無血清培養基繼續培養。0h，24h，48h時間點拍照，隨機選取6條水平線，計算細胞間距離均值。

結果如圖11所示，plko.1-padi2-sh1轉染細胞24h和48h後，a2780/taxol細胞間距離顯著大於陰性對照組，細胞劃痕後癒合能力顯著下降，說明特異性阻斷padi2的表達後，能抑制腫瘤細胞的遷移。

六、transwell試驗檢測細胞遷移能力

細胞轉染48h後，用胰酶消化收集，用無血清培養基重懸，調整細胞密度為5×105/ml，上室加2ml細胞懸液，下室加10％fbs完全培養基2ml，繼續培養24h，取出小室，pbs洗3次，用棉籤小心去除上室上層表面的細胞，倒置晾乾，95％乙醇固定25min，蘇木素染色，顯微鏡下觀察、計數、拍照。每個小室計數10個視野，取平均值統計並分析細胞遷移能力的改變。

細胞遷移實驗結果如圖12a所示，轉染plko.1-padi2-sh1後，a2780/taxol實驗組與陰性對照組穿透小室的細胞數量分別是74±19與293±33，兩者有統計學差異(p＜0.05)；該結果表明，特異性阻斷padi2的表達後，能抑制腫瘤細胞的遷移。

七、transwell試驗檢測細胞侵襲能力

將-20℃保存的基質膠先在4℃復溫液化，取基質膠與opti-mem以1:6冰上混勻稀釋，包被小室底部膜的上室面，37℃固化30min，吸除小室內析出的液體。基質膠包被後其餘步驟同上，每個小室計數10個視野，取平均值統計並分析細胞侵襲能力的改變。

細胞侵襲實驗結果如圖12b所示，a2780/taxol實驗組與陰性對照組穿透小室的細胞數量分別是54±13與192±31，兩者有統計學差異(p＜0.05)；該結果表明，特異性阻斷padi2的表達後，能抑制腫瘤細胞浸潤。

實施例6.plko.1-padi2-sh1特異性阻斷padi2表達後對卵巢癌耐藥的逆轉作用

一、實驗分組：

1.a2780正常組(不轉染任何載體)，以下稱作a；

2.a2780/taxol正常組(不轉染任何載體)，以下稱作ar；

3.a2780/taxol陰性對照組(轉染plko.1puro空載體)，以下稱作ar-n；

4.a2780/taxol實驗組(轉染plko.1-padi2-sh1)，以下稱作ar-sh1。

二、分組轉染

轉染步驟同前，轉染後繼續培養細胞24h。

三、轉染plko.1-padi2-sh1後細胞對紫杉醇敏感性的檢測

各組取對數生長期細胞，胰酶消化後細胞重懸，細胞計數並調整細胞懸液的密度為1×105/ml，接種到96孔板繼續培養24h。次日，各組中加入紫杉醇，濃度梯度分別設200ug/ml，100ug/ml，50ug/ml，25ug/ml，12.5ug/ml，6.25ug/ml，3.125ug/ml，0ug/ml，作用24h後，用溴標法在波長370nm(參考波長492nm)測吸光度(a)，計算紫杉醇對每組細胞的抑制率，抑制率＝a實驗組/a陰性對照組。每個濃度設3個復孔，取平均值。

抑制率為50％時的藥物濃度為半數抑制濃度(ic50)；

耐藥株a2780/taxol的ic50與其親本細胞株a2780的ic50的比值為耐藥倍數(resistantfolder,rf)；

耐藥株a2780/taxol的ic50與其轉染plko.1-padi2-sh1(逆轉劑)後的ic50的比值為耐藥逆轉指數(reversalindex,ri)。

結果如表2、表3、圖13所示，a2780/taxol對紫杉醇的ic50(41.89±5.11ug/ml)顯著高於親本a2780對紫杉醇的ic50(1.48±0.33ug/ml)，耐藥倍數高達28.31，提示a2780/taxol對紫杉醇的敏感性顯著低於親本細胞a2780，高度耐藥。而當a2780/taxol轉染plko.1-padi2-sh1之後，對紫杉醇的敏感性明顯提高(3.05±0.89ug/ml)，轉染plko.1-padi2-sh1對a2780/taxol紫杉醇耐藥的逆轉效果非常明顯，逆轉指數為14.39。

表2.a2780及a2780/taxol對紫杉醇的藥物敏感性

表3.轉染plko.1-padi2-sh1後a2780/taxol對紫杉醇藥物敏感性的逆轉

sequencelisting

浙江大學

特異性抑制padi2基因表達的sirna及其重組載體和應用

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人工序列

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2

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