抗肺癌的燈臺葉中藥組合物、其製備方法及其在製備抗肺癌藥物中的應用的製作方法
2023-06-01 13:07:31
專利名稱：抗肺癌的燈臺葉中藥組合物、其製備方法及其在製備抗肺癌藥物中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種中藥組合物，具體涉及一種抗肺癌的燈臺葉中藥組合物、其製備方法及其在製備抗肺癌藥物中的應用
背景技術：
在環境汙染、職業暴露等因素的多方面影響下，世界範圍內肺癌發病率持續上升，已成為對人類健康危害最大的惡性腫瘤。在我國城市中肺癌佔所有腫瘤死亡的17.8%，在惡性腫瘤發病率排序中已經上升為第一位。根據2010年中國衛生統計年鑑結果顯示2009年中國城市肺癌死亡率為49. 6/10萬人,農村肺癌死亡率為39. 64/10萬人,分別佔腫瘤死亡人數的29. 2%和24. 7%ο在城鎮地區,每死亡4人，即有I人死於癌症,而在因癌症死去的每3-4人中，即有I人是肺癌。目前肺癌仍缺乏安全高效的治療藥物，肺癌患者預後和存活率都較差。因此研發新型抗肺癌藥物是十分迫切與必要的。天然植物來源的長春鹼、喜數鹼等已經被開發為有效的抗腫瘤藥物，繼續從中藥和天然藥物中尋找和開發抗肺癌藥物是當前的研究熱點。燈臺樹scholaris(L.) R. Sr.，為夾竹桃科雞骨常山屬的喬木，主要含有生物鹼、黃酮、三萜類等成分，性味甘、淡、平，具有清熱解毒、消腫止痛、平喘止咳、截瘧、發汗、健胃等作用。燈臺樹根、莖、皮、葉均可入藥，以皮和葉用藥為主。近年來，隨著對其化學成分、藥理活性等方面研究的逐步展開，發現其活性成分豐富，在抗腫瘤、抗炎、抗菌、抗糖尿病和降血脂等方面顯示出重要的潛在藥用價值。燈臺葉是燈臺樹的乾燥葉，傳統常用於治療肺熱、咳嗽、痰多等症。燈臺葉主要含有生物鹼類、黃酮類、三萜類等成分。專利已有報導燈臺葉治療咳嗽哮喘、咽炎的製劑(200710063724. O公開了一種治療咳嗽哮喘的中藥組合物；201010171142. 6公開了一種治療咽炎的藥物)，關於燈臺葉抗肺癌的專利未有報導。據文獻報導，燈臺樹皮85%乙醇提取物具有很好的抗腫瘤活性，從其分離得到的不同極性溶劑部位，對HeLa細胞的細胞毒作用以甲醇溶解後的不溶部位、總提取物和氯仿部位最好，而這些部位生物鹼含量豐富。(參見Jagetia GC, Baliga MS. The effectof seasonal variation on the antineoplastic activity of Alstonia scholarisR. Br, in HeLa cells [J]. J Ethnopharmaco1. 2005, 96(1-2) :37-42.)從燈臺樹中分離得到的燈臺鹼(echitamine)是燈臺樹的主要生物鹼成分之一,它在體外對HeLa、HepG2、HL60、KB、MCF-7、Vero、纖維肉瘤和艾氏腹水癌細胞都具有細胞毒作用，體內對大鼠纖維肉瘤，S180肉瘤和小鼠艾氏腹水瘤有抑制生長的作用(參見Jagetia GC, Baliga MS, VenkateshP, et al. Evaluation of the cytotoxic effect of the monoterpene indole alkaloidechitamine in-vitro and in tumour-bearing mice[J]. J Pharm Pharmacol. 2005, 57(9)1213-1219.)。燈臺葉和燈臺樹皮、根類似，也含有大量類似的生物鹼等成分，因此從燈臺葉中提取具有抗腫瘤活性的有效組分並開發抗肺癌藥物是一條可行的途徑，且有利於燈臺樹資源的充分利用和可持續發展。但是現有技術對從燈臺葉中提取抗腫瘤藥物的研究還是初步的，尚未有能夠實現產業化的具體藥物的報導，更未見從燈臺葉中提取的具體用於抗肺癌藥物的報導。
發明內容
本發明的目的是提供一種抗肺癌的燈臺葉中藥組合物、其製備方法及其在製備抗肺癌藥物中的應用，以實現抗肺癌 藥物的產業化。完成上述第一個發明任務的方案是一種抗肺癌的燈臺葉中藥組合物，其特徵在於，該組合物的原料藥為中藥燈臺葉。進一步優化，上述抗肺癌的燈臺葉中藥組合物是由燈臺葉提取物中的總生物鹼組分和總三萜組分組成，所述的總生物鹼組分和總三萜組分，是按其原料生藥量的質量比1:0. I 1:10 組合；
較好的組合為兩種組分按其原料生藥量質量比1:0. 5 1:5組合；
最理想的組合為兩種組分按其原料生藥量質量比1:1組合。其中所述的總生物鹼組分以鴨腳樹葉鹼為代表性成分；所述的總三萜組分以齊墩果酸和熊果酸為代表性成分。HPLC圖譜見
。其中燈臺葉，性味苦，涼，具有止咳、祛痰、消炎的功效。更具體地說，本發明的抗肺癌中藥組合物，是指按照以下製備方法得到的組合物
步驟(I):燈臺葉用乙醇回流提取，回收溶劑，得到提取濃縮液；
步驟(2):將提取濃縮液上於大孔樹脂上，先用水、低濃度乙醇洗去雜質，再用中濃度乙醇洗脫，收集洗脫液，回收乙醇，得到總生物鹼組分，最後用高濃度乙醇洗脫，收集洗脫液，回收乙醇，得到總三萜組分，分別真空乾燥，即得總生物鹼組分和總三萜組分；
步驟⑶將步驟⑵中的總生物鹼組分和總三萜組分組合在一起(混合均勻)，得本發明的藥物組合物。步驟(3)中，總生物鹼組分和總三萜組分是其原料生藥量的質量比1:0. f 1:10組合；較好的組合比例為按其原料生藥量質量比1:0.5 1:5組合；最理想的組合比例為按其原料生藥量質量比1:1組合。兩種組分的組合比例超出1:1時，可以用另外的原料藥，提取總生物鹼組分或者總三職組分補充到組合物中。本發明採用大孔樹脂把燈臺葉的乙醇提取物分離成不同的組分，通過體內外實驗對其抗肺癌活性組分進行篩選，得到燈臺葉抗肺癌活性組分為總生物鹼和總三萜組分，並將兩個組分進行組合，得到燈臺葉的抗肺癌組合物。這樣的研究未經報導，而且能進行大規模生產，適宜開發成抗肺癌中藥新藥。完成本發明第二個發明任務的方案是，上述燈臺葉的抗肺癌中藥組合物的製備方法，包括如下步驟
步驟(I):燈臺葉用乙醇回流提取，回收溶劑，得到提取濃縮液；
步驟(2):將提取濃縮液上於大孔樹脂上，先用水、乙醇洗去雜質，再用中濃度乙醇洗脫，收集洗脫液，回收乙醇，得到總生物鹼組分，最後用高濃度乙醇洗脫，收集洗脫液，回收乙醇，得到總三萜組分，分別真空乾燥，即得總生物鹼組分和總三萜組分；步驟⑶將步驟⑵中的總生物鹼組分和總三萜組分組合在一起(混合均勻)，得本發明的藥物組合物。步驟(3)中，總生物鹼組分和總三萜組分是其原料生藥量的質量比1:0. f 1:10組合；較好的組合比例為按其原料生藥量質量比1:0. 5 1:5組合；最理想的組合比例為按其原料生藥量質量比1:1組合。兩種組分的組合比例超出1:1時，可以用另外的原料藥，提取總生物鹼組分或者總三職組分補充到組合物中以上製備方法的進一步優化，具體操作步驟是
步驟⑴燈臺葉用6 15倍量的體積百分比709Γ95%乙醇回流提取廣4次，每次f4h，回收溶劑，得到提取濃縮液；
步驟(2):將提取濃縮液上於HPD400A、NKA-9、DlOl、DA201、AB-8型大孔樹脂上，先用2 6BV的水及2 6BV的體積百分比20% 40%乙醇洗去雜質，再用4 10BV的體積百分比50%飛5%乙醇洗脫，收集洗脫液，回收乙醇，得到總生物鹼組分，最後用Γ ΟΒν的體積百分比709Γ95%乙醇洗脫，收集洗脫液，回收乙醇，得到總三萜組分，分別真空乾燥，即得總生物鹼組分和總三萜組分；
步驟(3):將步驟(2)中的總生物鹼組分和總三萜組分混合均勻，得本發明的抗肺癌中藥組合物。本發明中藥組合物製備方法的優化方案是
步驟⑴燈臺葉用8 12倍量的體積百分比809Γ90%乙醇回流提取廣3次，每次
I.5^3h,回收溶劑，得到提取濃縮液；
步驟(2):將提取濃縮液上於D101、DA201、AB-8型大孔樹脂上，先用3 5BV的水及3 5BV的體積百分比30% 40%乙醇洗去雜質，再用5 8BV的體積百分比55% 60%乙醇洗脫，收集洗脫液，回收乙醇，得到總生物鹼組分，最後用5 8BV的體積百分比759Γ85%乙醇洗脫，收集洗脫液，回收乙醇，得到總三萜組分，分別真空乾燥，即得總生物鹼組分和總三萜組分；
步驟(3):將步驟(2)中的總生物鹼組分和總三萜組分混合均勻，得本發明的抗肺癌中藥組合物。中藥組合物製備方法的優化方案中，本發明推薦的條件是
步驟(I):燈臺葉用10倍量的體積百分比85%乙醇回流提取2次，每次2h，回收溶劑，得到提取濃縮液；
步驟(2):將提取濃縮液上於AB-8型大孔樹脂上，先用4BV的水及4BV的體積百分比40%乙醇洗去雜質，再用6BV的體積百分比60%乙醇洗脫，收集體積百分比60%乙醇洗脫液，回收乙醇，得到總生物鹼組分，最後用6BV的體積百分比80%乙醇洗脫，收集體積百分比80%乙醇洗脫液，回收乙醇，得到總三萜組分，分別真空乾燥，即得總生物鹼組分和總三萜組分；
步驟(3):將步驟(2)中的總生物鹼組分和總三萜組分混合均勻，得本發明的抗肺癌中藥組合物。完成本發明第三個發明任務的方案是，上述燈臺葉的抗肺癌中藥組合物在製備抗肺癌藥物中的應用。本發明的組合物所製備抗肺癌藥物在使用時為口服給藥。
可通過混合，填充，壓片等常規的方法製備固體口服組合物。燈臺葉提取物藥理實驗的數據
1.不同溶劑提取物的製備 取200 g燈臺葉各5份，分別加10倍量85%乙醇、70%乙醇、50%乙醇、30%乙醇、水回流提取，(2次，2 h/次)，濾過，合併濾液，分別回收溶劑，濃縮至一定體積，60 °C減壓乾燥。五個溶劑部位分別記為DTY-85-T，DTY-70-T，DTY-50-T，DTY-30-T，DTY-W-T。取不同提取物乾燥粉末，稱重，計算提取得率，結果見表I。表I燈臺葉藥材提取物結果
2.體外細胞活性篩選
細胞株Α549和SPC-A-I肺癌細胞
取對數生長期Α549、SPC-A-I細胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液分別配成6Χ104、9X IO4的單細胞懸液接種於96孔板中，每孔100 μ L。實驗組加90 μ L不含牛血清的培養基，另加入燈臺葉藥液10 μ L，使其最終生藥濃度分別為10 mg/mL, 5 mg/mL,
2.5 mg/mL, I mg/mL,陽性對照組加順鉬(1:10) 10 μ L，空白對照組加100 μ L終濃度為
O.5%DMS0:乙醇(I: I)溶液。每組設6個平行孔，另設本底對照孔(等體積含相應濃度藥物的無細胞培養液)，置於37°C 5%C02培養箱中培養36 h，每孔加入MTT液10 4 1^，培養4 11，棄去每孔中的液體，每孔加DMSO 100 μ L，振蕩10 min後置於570 nm (檢測波長)和630nm (參比波長)酶聯免疫檢測儀測定OD值，計算細胞生長抑制率(按以下公式)，用SPSS
11.5軟體求其半數抑制濃度(IC5tl)。以上實驗重複3次。細胞生長抑制率=(對照組OD均值-實驗組OD均值)/對照組OD均值 X 100%
表2 A549和SPC-A-I細胞藥效評價結果
_A549 細胞__SPC-A-I 細胞_
提取物IC50IC50IC50IC50
(mg生藥/mL)(呢提取物/mL) (mg生藥/mL) (_提取物/mL) DTY-85-T2M275.483.17297.03
DTY-70-T3.723 27.361 84340.56
DTY-50-T4.20__371.28__4J7__412.83
DTY-30-T7.13536.897.87592.61
DTY-W-T-
表示沒有活性
在給藥 36h 後，DTY-85-T、DTY-70-T、DTY-50-T 對 A549 細胞模型的 IC5tl 分別為 275. 48、327. 36,371. 28 μ g提取物/mL，對 SPC-A-1 細胞模型的 IC5tl 分別為 297. 03,340. 56,412. 83μ g提取物/mL，均 小於藥物抗腫瘤活性評價的國際標準500 μ g提取物/mL，其中以85%乙醇提取得到的燈臺葉提取物的體外抗肺癌的活性最好。本發明中的藥物組合物在抗肺癌方面的作用，以下為組合物藥理實驗的數據
I. 在細胞水平上篩選有效組分
細胞活性篩選組分的製備取燈臺葉藥材5 kg，加10倍量85%乙醇回流提取2次，每次2h，濾過，合併濾液，回收乙醇至浸膏。將浸膏上於AB-8大孔樹脂，依次用水、10%乙醇、20%乙醇、30%乙醇、40%乙醇、50%乙醇、60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、95%乙醇進行梯度洗脫，將這10個洗脫部位分別回收溶劑，60°C減壓乾燥，得10個洗脫組分。十個溶劑組分分別記為DTY-水組分、DTY-10%乙醇組分、DTY-20%乙醇組分、DTY-30%乙醇組分、DTY-40%乙醇組分、DTY-50%乙醇組分、DTY-60%乙醇組分、DTY-70%乙醇組分、DTY-80%乙醇組分、DTY-95%乙醇組分。細胞活性篩選
細胞株A549和SPC-A-I肺癌細胞
取對數生長期A549、SPC-A-I細胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液分別配成6X104、9 X IO4的單細胞懸液接種於96孔板中，每孔100 μ L。實驗組加90 μ L不含牛血清的培養基，另加入燈臺葉藥液10 μ L，使其最終生藥濃度分別為25 mg/mL, 12. 5 mg/mL,5 mg/mL, 2. 5 mg/mL，陽性對照組加順鉬(I: 10) 10 μ L，空白對照組加100 μ L終濃度為
O.5%DMS0:乙醇(I: I)溶液。每組設6個平行孔，另設本底對照孔(等體積含相應濃度藥物的無細胞培養液)，置於37°C 5%C02培養箱中培養36 h，每孔加入MTT液10 μ L，培養4h，棄去每孔中的液體，每孔加DMSO 100 μ L，振蕩10 min於570 nm (檢測波長)和630 nm(參比波長)波長酶聯免疫檢測儀測定OD值，計算細胞生長抑制率(按以下公式)，用SPSS
11.5軟體求其半數抑制濃度(IC5tl)。以上實驗重複3次。細胞生長抑制率=(對照組OD均值-實驗組OD均值)/對照組OD均值 X 100%
表3 A549和SPC-A-I細胞藥效評價結果
權利要求
1.一種抗肺癌的燈臺葉中藥組合物，其特徵在於，該組合物的原料藥為中藥燈臺葉。
2.根據權利要求I所述的抗肺癌的燈臺葉中藥組合物，其特徵在於，所述的抗肺癌的燈臺葉中藥組合物是由燈臺葉提取物中的總生物鹼組分和總三萜組分組成；所述的總生物鹼組分和總三萜組分按其原料生藥量的質量比1:0. f 1:10組合。
3.根據權利要求2所述的抗肺癌的燈臺葉中藥組合物，其特徵在於，所述的總生物鹼組分和總三萜組分按其原料生藥量的質量比1:0. 5 1:5組合。
4.根據權利要求3所述的抗肺癌的燈臺葉中藥組合物，其特徵在於，所述的總生物鹼組分和總三萜組分按其原料生藥量的質量比1:1組合。
5.根據權利要求1-4之一所述的抗肺癌的燈臺葉中藥組合物，其特徵在於，所述的抗肺癌的燈臺葉中藥組合物是按照以下方法製備得到的組合物 步驟(I):燈臺葉用乙醇回流提取，回收溶劑，得到提取濃縮液； 步驟(2):將提取濃縮液上於大孔樹脂上，先用水、低濃度乙醇洗去雜質，再用中濃度乙醇洗脫，收集洗脫液，回收乙醇，得到總生物鹼組分，最後用高濃度乙醇洗脫，收集洗脫液，回收乙醇，得到總三萜組分，分別真空乾燥，即得總生物鹼組分和總三萜組分； 步驟(3):將步驟(2)中的總生物鹼組分和總三萜組分混合均勻，得本發明的藥物組合物。
6.權利要求I所述抗肺癌的燈臺葉中藥組合物的製備方法，其特徵在於，步驟如下 步驟(I):燈臺葉用乙醇回流提取，回收溶劑，得到提取濃縮液； 步驟(2):將提取濃縮液上於大孔樹脂上，先用水、低濃度乙醇洗去雜質，再用中濃度乙醇洗脫，收集洗脫液，回收乙醇，得到總生物鹼組分，最後用高濃度乙醇洗脫，收集洗脫液，回收乙醇，得到總三萜組分，分別真空乾燥，即得總生物鹼組分和總三萜組分； 步驟(3):將步驟(2)中的總生物鹼組分和總三萜組分混合均勻，得本發明的抗肺癌中藥組合物。
7.根據權利要求6所述抗肺癌的燈臺葉中藥組合物的製備方法，其特徵在於具體操作步驟是 步驟⑴燈臺葉用6 15倍量的體積百分比709Γ95%乙醇回流提取廣4次，每次f4h，回收溶劑，得到提取濃縮液； 步驟(2):將提取濃縮液上於HPD400A、NKA-9、DlOl、DA201、AB-8型大孔樹脂上，先用2 6BV的水及2 6BV的體積百分比20% 40%乙醇洗去雜質，再用4 10BV的體積百分比50%飛5%乙醇洗脫，收集洗脫液，回收乙醇，得到總生物鹼組分，最後用Γ ΟΒν的體積百分比709Γ95%乙醇洗脫，收集洗脫液，回收乙醇，得到總三萜組分，分別真空乾燥，即得總生物鹼組分和總三萜組分； 步驟(3):將步驟(2)中的總生物鹼組分和總三萜組分混合均勻，得本發明的抗肺癌中藥組合物。
8.根據權利要求7所述抗肺癌的燈臺葉中藥組合物的製備方法，其特徵在於步驟(I)、(2)的操作條件是 步驟(I):燈臺葉用10倍量的體積百分比85%的乙醇回流提取2次，每次2h，回收溶齊U，得到提取濃縮液； 步驟(2):將提取濃縮液上於AB-8型大孔樹脂上，先用4BV的水及4BV的體積百分比40%乙醇洗去雜質，再用6BV的體積百分比60%乙醇洗脫，收集體積百分比60%乙醇洗脫液，回收乙醇，得到總生物鹼組分，最後用6BV的體積百分比80%乙醇洗脫，收集體積百分比80%乙醇洗脫液，回收乙醇，得到總三萜組分，分別真空乾燥，即得總生物鹼組分和總三萜組分。
9.權利要求I所述的抗肺癌的燈臺葉中藥組合物在製備抗肺癌藥物中的應用。
10.根據權利要求9所述的抗肺癌的燈臺葉中藥組合物在製備抗肺癌藥物中的應用，其特徵在於，所述的組合物所製備的抗肺癌藥物在使用時為口服給藥。
全文摘要
抗肺癌的燈臺葉中藥組合物、其製備方法及其在製備抗肺癌藥物中的應用。該組合物的原料藥為中藥燈臺葉。該組合物是由燈臺葉提取物中的總生物鹼組分和總三萜組分組成；總生物鹼組分和總三萜組分分別按其原料生藥量的質量比1:0.1~1:10組合。本發明還提供了該組合物的製備方法，以及其在製備抗肺癌藥物中的應用。本發明對C57BL/6荷瘤小鼠有很好的抑瘤作用，能夠顯著提高小鼠的免疫力，與環磷醯胺組相比，燈臺葉組合物能夠顯著提高荷瘤小鼠的免疫指數(胸腺指數、脾指數和肝指數)及小鼠體內細胞因子(TNF-a和IL-6)，因此燈臺葉組合物具有較強的抗肺癌活性，較低的毒副作用，療效安全可靠，是有效的抗肺癌藥物。
文檔編號A61P35/00GK102631396SQ20121014175
公開日2012年8月15日 申請日期2012年5月7日 優先權日2012年5月7日
發明者劉璇, 張振海, 杜萌, 陳彥 申請人:江蘇省中醫藥研究院