用於抑制環加氧酶和/或5-脂氧化酶的組合物的製作方法

2023-06-01 10:41:11 1

專利名稱：：用於抑制環加氧酶和/或5-脂氧化酶的組合物的製作方法
技術領域：
：本發明涉及用於預防或治療由環加氧酶(以下簡稱'COX，')和/或5-脂氧化酶(以下簡稱'5-L0，')介導的生理性或病理性病症的組合物，所述組合物包含鉤藤屬(Unicariage皿s)植物或其提取物，特別是單獨的鉤藤屬植物和另外還包含黃芩(Scutellariabaicalensis)禾口/或茶樹(Camelliasinensis)提取物。背景領域由於社會經濟的發展導致的生活水平的提高和生活方式的改變，以及平均壽命的增加，隨著老齡化人口的增加，已給疾病的方面帶來巨大的變化，慢性疾病在死亡的病因中的份量已超過流行病。現在，慢性病在醫療花費上的增加、所需的醫療標準的增加、尋找降低其的方法等方面吸引了更多的社會經濟關注。最具代表性的慢性病包括關節炎、認知功能的降低、皮炎、胃炎、高血壓、糖尿病、牙周炎等。關節炎是限制人類的日常生活活動的最重要的病因，且在女性和老人中發病頻率特別高。可將關節炎分成骨關節炎(退行性關節炎)和類風溼性關節炎。由於身體關節的退化導致產生骨關節炎，其伴隨著源於骨之間的連接區域(臀部、膝蓋、頸、腰、手指、足趾指節等)的關節軟骨的磨損或破壞的疼痛和炎症。一般地，關節軟骨被破壞並可再生，但如果被破壞的量超過再生軟骨的量，那麼關節軟骨吸收碰撞的量將減少或被磨破。從而，關節之間的骨相互之間會撞在一起，然後產生巨痛。這樣的關節軟骨的破壞是骨關節炎的開始，如果不進行治療將導致巨痛。類風溼性關節炎是以多種方式在許多關節中發生的炎性自身免疫疾病。在關節炎患者的情況下，在關節的滑膜組織開始超常增生的同時，巨噬細胞、樹突狀細胞和激活的T淋巴細胞和B淋巴細胞遷移入滑膜組織，且多形核細胞在滑膜液中和軟骨的表面上積累以誘導炎症。推斷滑膜組織的這種炎症是由T淋巴細胞和不再被識別的自身抗原的反應誘導的。在該反應中，浸潤入大部分組織的T淋巴細胞不在細胞表面顯示激活標記，且細胞因子也幾乎不表達。然而，在具有類風溼性關節炎症狀的滑膜組織和滑液中觀察到大量來源於巨噬細胞的細胞因子。代表性的細胞因子包括已知剌激滑膜成纖維細胞生長的白細胞介素-1(IL-1)和腫瘤壞死因子_a(TNF-a)。這些實驗結果支持這樣的理論，即T細胞在誘導滑膜組織的炎症中起著非常重要的作用，此後由源於激活的滑膜細胞的細胞因子保持炎症症狀[CarsonD.A.等人，J.Clin.Invest.，87，pp379-383，1991:TigheH.等人，J.Exp.Med.，177，ppl0-118，1993:BurmesterG.R.等人，ArthritisRhe咖，40，pp5_18，1997:PanayiG.S.，Curr.Opin.Rheumatol.，9，pp236_240，1997]。為了減輕疼痛(包括關節炎)通常使用止痛藥或抗炎藥，代表性的藥物是具有COX抑制性效應的NSAID(非類固醇類抗炎藥)[UK-1，RBraham，BDawson，CGoodman,Theeffectofglucosaminesupplementationonpeopleexperiencingregularkneepain，Br.J.Sports.Med.2003;37:45-49]。NSAID例如阿斯匹林是最好出售的處方藥物，且用於治療退行性關節炎、類風溼性關節炎、頭痛，因為其對消炎、減輕發燒和緩和疼痛是有效的。在這些NASID用於關節炎的情況下，其輕微地改善了症狀，但不能阻止關節區域的軟骨損失也不能阻止疾病的進展。此外，其具有嚴重的副作用如引起胃腸疾病，從而大約一半採用NASID的患者在一年內停止使用它們。因此，存在對新的治療劑的需要。已開發了選擇性抑制C0X-2的藥物或同時抑制C0X-2和5-L0的治療劑。當來自細胞膜的花生四烯酸的分離和代謝在許多途徑中產生促炎症反應代謝產物時，引起炎症反應。導致炎症的兩個重要途徑，C0X-2和5-L0，是在花生四烯酸(AA)級聯反應中起著重要作用的酶，且這些途徑和產生分別在引發和促進炎症反應中起著重要作用的白細胞三烯和前列腺素E的途徑同時發生。COX是在細胞膜的磷脂轉變成花生四烯酸後在花生四烯酸轉變成前列腺素(以下簡稱'PGs')的過程中起著催化劑作用的酶。依賴於其種類，該產生的PG可剌激平滑肌收縮，和根據動物的不同而減少或增加血壓或血液粘聚力。此外，其起著加速膜中的離子運輸、剌激炎症和阻止脂質組織中的脂質降解的作用。因此，作為產生這些炎症介質的原因的酶已成為針對炎症治療的許多新藥的靶，所述炎症是類風溼性關節炎、骨關節炎、皮炎、認知功能相關性疾病和癌症或退行性疾病的病因。在本領域內已知兩類C0X，C0X-1和C0X-2。C0X-1如終如一地在大多數組織中表達，且起著"管家基因"的作用。S卩，其參與PG的產生和擴張血管以維持腎功能和血小板血栓烷的產生，所述PG存在於胃黏膜中。C0X-2不在大多數正常的組織中表達，且在疾病或生理性病症下由以前表達的生長因子誘導。特別地，已知其由導致促炎症的細胞因子廣泛誘導。已沿用至今的用於治療炎症的NSAID甚至抑制在正常組織中一貫表達的C0X-1，從而導致副作用例如胃黏膜侵蝕、潰瘍等。最近，已發展了作為改善該狀況的新藥物的C0X-2選擇性抑制劑。塞來考昔是現在在臨床上用作抗炎劑和抗癌劑的代表性C0X-2選擇性抑制劑。其對於骨關節炎和類風溼性關節炎的治療和存在於具有家族性腺瘤性息肉病(FAP)的患者的結腸中的息肉的數目的減少是有效的。參與在炎症反應中將花生四烯酸代謝成化學遞質的代謝過程的另一種酶是脂氧化酶。存在三種脂氧化酶，5-、12-和15-脂氧化酶，其中5-脂氧化酶參與通過5-HPETE從花生四烯酸合成白細胞三烯A4、B4、C4、D4、E4(LTA4、LTB4、LTC4、LTD4、LTE4)等的合成過程。Samuelsson等人公開了在這些白細胞三烯中，LTB4是在炎症反應的第二階段中起作用的白細胞中的一種產物，且主要在多形核白細胞(P麗U中生物合成，且已知顯示功能例如白細胞凝集、浸潤、趨化性和溶酶體酶的分離等。且，許多科學家已進行了5-L0激活相關性因子和用於抑制這些激活作用的藥物開發的研究，但收效甚微，只有ETYA和BW755C已被發展為藥物[Kyung_rakMIN等人，Activationof5-lipoxygenaseandleukotrieneB4biosynthesisinhibitingmaterial,Pharmacology,第33(6)巻，319-323(1989)]。COX抑制劑的反應機制和大多數常規的NSAID相同，因此將COX用於治療許多病症例如由短暫病症和慢性病症(其中炎症起著重要作用)中的炎症產生的疼痛和腫脹。短暫病症是指輕微擦傷、曬傷、接觸傳染性皮炎、頭痛、月經痛等。慢性疾病是指認識機能的疾病、類風溼性關節炎、骨關節炎等。COX抑制劑也用於皮膚病症如皮膚硬結(skinscleroma)和系統性紅斑狼瘡4(SLE)[Goebel等人，Chem.Res.Tox.，12:488-500，1999，Patrono等人，J.Clin.Invest.，76:1011-1018，1985]。此外，COX抑制劑也用於減輕炎症性但非風溼樣皮膚病症例如牛皮癬，其中其通過減少因前列腺素的過度產生而導致的炎症來顯示直接的效應[Fogh等人，ActaDermVenerologica，73:191-193，1993]。除了其用作抗炎藥的用途外，COX抑制劑在癌症治療中起著潛在的作用。在許多人類惡性腫瘤中已觀察到COX的過度表達，且COX抑制劑顯示對於遭受皮膚癌、乳腺癌和膀胱癌的動物的治療是有效的。儘管未完全鑑定反應機制，但已顯示COX的過度表達抑制細胞死亡和增加致瘤細胞類型的侵襲性[D卿ke等人，J.Can.Res.Clin.Oncol.，127:411-417，2001，Moore禾口Simmons,CurrentMed.Chem.，7:1131-44，2000]。此外，由於近年來科技術進步的原因，已確定了C0X表達、全身性炎症和老年痴呆症的發病機理之間的相互關係[Ho等人，Arch.Neurol.，58:487_92，2001]。在動物模型中，過度表達COX酶的轉基因小鼠具有更易受傷害的神經元。NIA(美國國家老人學研究院NationalInstituteonAging)開始了驗證NSAID是否可延遲老年痴呆症的進展的臨床試驗，且許多報導顯示炎症反應中產生的COX的抑制有助於認知功能的改善[CernakI.，ExpBrainRes.，147(2):193-9,2002，CasoliniP.，JNeurosciRes.，68(3):337-43，2002，AndreassonKI.，JNeurosci.，21(20):8198-209，2001]。此外，證明了COX抑制劑對於精神病是有效的[MullerN.，Expert0pinI読stigDrugs,13(8):1033-44，2004]。此外，有報導顯示抑制C0X-2和5-L0兩者的抑制劑在小鼠模型中抑制年老心臟的動脈管收縮[Gok等人，Pharmacology,60:4146,2000].黑兒茶(Uncariagambir)是屬於茜草家族的植物。其自然地生長於整個東印度群島，且在馬來西亞、中國、印度、蘇門答臘島和汶萊被栽培。白色的花開於葉腋處。當花凋落時，花柄彎曲成鉤狀以纏繞其他植物。在播種黑兒茶種子一年後，每隔4至8個月，可通過切割和提取葉莖的末端獲得所謂的水提取物。主要可從6年生的樹獲得該水提取物。當樹長至大約15年時，應當耕犁土壤以分離根部。該水提取物包含d-和dl-兒茶素(兒茶酚)、鞣酸、槲皮素、和生物鹼黑兒茶鹼。黑兒茶的提取物用於藥用目的，也主要用於棕色染料或皮革製革。特別地，東南亞的一些人通過將和水混合的黑兒茶塗抹在Bin-ran-za上來食用該混合物。作為收斂劑的水提取物廣泛地用於生產嚼服藥物例如In-dan。按照Dong-Eui治療法，將所述水提取物作為用於傷口、口中的瘡、血便、血尿、咯血、白帶和其他皮膚病的收斂劑或凝血劑[韓國食品與藥品管理局(KoreaFoodandDrugAdministration)]。此夕卜，Dong-Eui-Bo-Gam教導可將黑兒茶作為"s3engbomy皿gdMi、yMigm3echMig、ch皿pochMig、whMichMig禾口gy皿gb皿dok.，，用於因腫脹的腱和骨引起的疼痛的治療。黃吝(ScutellariaeRadix)是指屬於唇形科屬的黃吝(Scutellariabaicalensis)(多年生草本植物)的根。該植物是多年生的且在2年後的7月至9月開花。莖生長得直且粗，但在肥沃的土壤中，其生長歪斜或甚至倒伏。莖的高度在40至60cm範圍內，葉是對稱的且呈避雷針形狀，無葉柄。花是總狀花序，且在枝的末端聚集和開花，花的形狀是唇形的和開放的。在種植3至4年後的秋季或春季採集根，然後在除去周皮後，將其風乾並用於藥物目的。此時，根的顏色是黃色。一般地，該藥草的木質部和薄壁組織都很大，從而髓大部分是空的，因此一般稱為腐朽髓。然而，在日本，其具有充實的髓的鮮根被稱為Cha-geum，具有空髓的根稱為Sook-ge咖、粉碎的根稱為Pyun-geum等。在韓國，其也被稱為Ko-Geum、Won-geum、Ky皿g-geum，、Kong-jang等。黃芩，中國藥用植物，包含大量的無B環類黃酮，所述無B環類黃酮包括黃芩黃素(baicalein)、黃吝苷(baicalin)、漢黃吝黃素(wogonin)禾口baicalenoside。常規地，黃吝用於病症的治療，所述治療包括排除、清瀉火氣、溼溫、夏季發熱綜合症、煩渴、癰、猩紅熱、痢疾、嘔血和鼻衄。此外，其還用於預防流產。現在黃芩在臨床上用於治療病症，包括兒科細菌性腹瀉、高血壓、支氣管哮喘和上呼吸道感染。報導顯示黃芩根的治療支氣管哮喘的藥理作用和無B環類黃酮的存在以及嗜酸性粒細胞浸潤相關性嗜酸性粒細胞活化趨化因子的抑制相關聯[Nakajima等人，(2001)PlantaMed.67(2):132-135]。近年來作為健康食物吸引關注的茶樹(Camelliasinensis)包含許多有用的組分。在所述組分中，兒茶素化合物具有相對高的抗氧化作用，且很多關於其的研究在進行中。茶樹中的兒茶素化合物包括表沒食子兒茶素(EGC)、表兒茶素(EC)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、表兒茶素沒食子酸酯(ECG)等。除了優秀的抗氧化作用外，兒茶素化合物具有這樣的作用如抗癌作用、免疫系統增強、皮膚癌預防、抗血栓作用、心臟病預防、膽固醇預防等作用。因此，一直在飲料和製藥領域內對茶樹中的該兒茶素化合物進行研究。所述研究一直在中國活躍地進行著，且在中國，茶樹的許多產品已被商品化。SimingshannaturalbiologicalproductCo.，Ltd.，Chinatianbaobiochemicalplant禾卩HealthLandSuppliesLtd.，等是已進行茶樹提取物的銷售和研究的龍頭公司。在日本，作為對兒茶素化合物研究的結果，由DaedongpharmaceuticalsCo.，Ltd生產的'P_兒茶素'和由SamjungagricultureandforestryCo.，Ltd生產的'兒茶素化合物粉劑'已被商品化，且已傾注持續的研究和投資以發展具有更高產量和經濟的方法。茶樹的另一種有效成分，多酚黃酮，抑制由於一定量的C0X-2、NFkB(核因子kB)和bcl-X(L)基因的mRNA而變成癌性的結腸細胞的生長。如可從下面舉例說明的基本結構中所看到的，無B環黃酮和無B環黃酮醇是芳香化合物中取代基不存在於B環結構中的類黃酮化合物的特定種類[KoreanPatentLaid-openPublicationNo.10-2004-0025884].已有報導顯示鉤藤屬植物(包括黑兒茶)可用作抗炎藥物。特別地，還不清楚黑兒茶和黃芩和/或茶樹的組合是否可用作抗炎藥，特別是預防或治療由COX途徑和/或5-L0途徑介導的疾病和病症包括骨關節炎或類風溼性關節炎的抗炎藥。本發明的公開內容和西方先進國家中的發展策略截然不同，本發明者已持續地研究天然產品以發展新的C0X和/或5-L0抑制性藥物。作為結果，其發現鉤藤屬植物(包括黑兒茶)具有C0X和/或5-L0抑制作用。此外，為發現和所述提取物一起顯示協同效應的天然藥物，其已使用體外試驗(C0X-1和2，5-L0)和體內試驗[腫脹，CIA(CollagenaseInducedArthritis)模型]以及GAG分析進行了許多實驗，以確定關節保護效應。作為結果，其還發現組合黃芩提取物和/或茶樹提取物的混合物顯示對COX和/或5-LO抑制活性的極大提高的協同效應，且使用CCOY公式(CCOYS.R.，Calculatingsynergisticandantagonisticresponseofherbicidecombinations，Weeds15，20-22，1967)測量協同效應以完成本發明。因此，本發明的目的是提供組合物，所述組合物用於預防或治療由C0X和/或5-L0介導的生理性和病理性病症，其包含顯示COX和/或5-L0抑制作用的新的植物(即，鉤藤屬植物)提取物或另外還包含黃芩提取物和/或茶樹提取物。本發明的另一個目的是提供用於預防或治療由COX和/或5-L0介導的生理性和病理性病症的組合物，所述組合物包含黃芩提取物和/或茶樹提取物。本發明的另一個目的是提供預防或治療由COX和/或5-L0介導的生理性和病理性病症的上述組合物的用途。本發明的另一個目的是提供通過給哺乳動物施用治療有效量的上述組合物來預防或治療由COX和/或5-L0介導的生理性和病理性病症的方法。本發明的另一個目的是提供製備用於預防或治療由COX和/或5-L0介導的生理性和病理性病症的試劑的方法，通過將鉤藤屬植物和黃芩提取物和/或茶樹提取物混合，或將黃芩提取物和茶樹提取物混合來製備所述試劑。附圖概述圖1是顯示實施例1和2的消炎活性的圖。圖2是顯示實施例5至8的消炎活性的圖。圖3是顯示實施例5和實施例1和3的消炎活性的圖。圖4是顯示實施例6和實施例1和4的消炎活性的圖。圖5是顯示實施例7的消炎活性的圖。圖6是顯示實施例8和實施例3和4的消炎活性的圖。圖7是顯示在施用實施例5後顯示小鼠的爪的腫脹隨時間變化的圖。圖8是顯示在施用實施例5後顯示關節炎指數隨時間變化的圖。圖9是顯示在施用實施例5後顯示CIA小鼠關節的軟骨組織的圖。圖10是顯示實驗例1至4的關節保護效應的圖。圖11是實驗例5至8的關節保護效應的圖。進行本發明的最佳模型為實現上述目的，本發明提供了用於預防或治療由C0X和/或5-L0介導的生理性和病理性病症的、包含鉤藤屬植物或其提取物的組合物。本發明也提供了用於預防或治療由COX和/或5-L0介導的生理性和病理性病症的、包含所述鉤藤屬植物和額外地黃芩提取物和/或茶樹提取物的組合物。本發明也提供了用於預防或治療由COX和/或5-L0介導的生理性和病理性病症的、包含黃芩提取物和/或茶樹提取物的組合物。本發明也提供了使用包含鉤藤屬和其提取物的組合物、包含黃芩提取物和茶樹提取物的組合物和包含鉤藤屬植物或其提取物和黃芩提取物和/或茶樹提取物的組合物預防或治療由COX和/或5-L0介導的生理性和病理性病症的用途。本發明也提供了通過給哺乳動物施用治療有效量的包含鉤藤屬植物或其提取物的組合物、或包含黃芩提取物和茶樹提取物的組合物來預防或治療由COX和/或5-L0介導的生理性和病理性病症的方法。本發明也提供了通過以0.110:0.110的重量比將鉤藤屬植物或其提取物和黃芩提取物和/或茶樹提取物混合或以o.iio:o.iio的重量比將黃芩提取物和茶樹提取物混合來製備用於預防或治療由COX和/或5-LO介導的生理性和病理性病症的試劑的方法。優選地選擇一種或多種鉤藤屬植物，所述植物選自黑兒茶、U.atte皿ataKorth.、U.borneensisHavil.、U.callophyllaKorth.、U.ellipticaR.Br.、U.guianensis(Aubl.)Gmel.、U.homomallaMiq.、U.lanosavar.glabrata(Bl.)Ridsd.、U.macrophyllaWall.、U.rhynchophyllaMiq.、U.sinensis(Oliv.)Havil.、U.tomentosa(Wi1Id.)DC.、U.yu皿anensisHsiaK.C.、U.hirsutaHavil.禾口U.lanosavar.appendiculataf.setiloba(Benth.)Ridsd.，特別優選地使用黑兒茶。在本發明組合物中，可以可商購獲得的常規藥草材料的形式使用鉤藤屬植物、黃芩和茶樹，且也可通過藥草、枝、殼、葉、芽、根、內皮等形式，優選地以粉末或提取物的形式使用黃芩和茶樹。可通過用水、有機溶劑或其混合溶劑提取鉤藤屬植物、黃芩和茶樹來使用本發明的鉤藤屬植物、黃芩和茶樹提取物。所有常規溶劑可用作上述有機溶劑，優選地極性溶劑例如水、C卜4醇等，或非極性溶劑例如正_己烷、二氯甲烷等或其混合溶劑。本發明的非極性溶劑提取物包括用選自正-己烷、二氯甲烷、氯仿或乙酸乙酯的非極性溶劑，優選地正-己烷、二氯甲烷、或乙酸乙酯萃取的提取物。此外，本發明的極性溶劑提取物包括用選自丙酮、水、4醇例如甲醇、乙醇、丙醇、丁醇等或異丙醇的極性溶劑萃取的提取物。可通過常規的方法例如熱水提取、超聲降解法等進行上述提取，且可將提取物的凍幹製品用於本發明組合物。此外，可通過常規的分級分離法或層析進一步純化所述提取物，且這些分級分離的材料或純化的材料也在本發明的範圍之內。本發明的組合物顯示優良的C0X和/或5-L0抑制效應，且通過使用天然的草藥可用於預防或治療由不同的C0X途徑和/或5-L0途徑介導的疾病和病症(特別地包括骨關節炎和類風溼性關節炎)而無任何副作用。在本說明書中，術語，"由C0X和/或5-L0途徑介導的生理性和病理性病症"包括，例如，選自炎性疾病、月經痛、動脈硬化、心臟病發作、肥胖症、糖尿病、X症候群、認知功能下降的疾病、老年痴呆症、呼吸系統變應性反應、慢性靜脈功能不全、痔瘡、系統性紅斑狼瘡、牛皮癬、慢性緊張性頭痛、偏頭痛、炎性腸病、由病毒、細菌和孢子引起的局部感染、曬傷、燒傷、接觸傳染性皮炎、黑色素瘤和癌症的疾病和病症。在本發明的組合物中，可單獨地使用鉤藤屬植物，特別是黑兒茶，但優選地使用組合的組合物，即將鉤藤屬植物或其提取物額外地和黃芩提取物、茶樹提取物、或黃芩和茶樹的提取物混合以顯示協同效應。特別地，如下列實驗性實施例中所顯示的，單獨的黃吝不顯示C0X和/或5-L0抑制效應。然而，令人驚奇的是，當將鉤藤屬植物，特別是黑兒茶提取物和黃芩和/或茶樹提取物一起施用時，和當施用黃芩和茶樹提取物的組合物時，觀察到協同效應。在本發明的組合物中，使用COLBY公式(COLBYS.R.，Calculatingsynergisticandantagonisticresponseofherbicidecombinations,Weeds15，20-22，1967)測量和確認在施用所述組合物時，和提取物的單獨施用相比的協同效應。如上所述，當將鉤藤屬植物，特別是黑兒茶和黃芩和/或茶樹提取物一起使用時，其黑兒茶黃芩茶樹的重量比可為o.iio:o.i10:o.iio，優選地iio:iio:110，優選地i7:i7:i7。且，當將黃吝和茶樹組合時，其可以o.iio:o.i10、優選地iio:i10、更優選地i7:i7的重量比混合。可按照製藥領域內的方法，通過將本發明的組合物和藥物可接受的媒介物、賦形劑等混合來將其配製成常規的藥劑，例如，溶液例如飲料、糖漿劑、膠囊劑、顆粒、片劑、粉劑、丸劑、軟膏劑和乳劑、皮膚外用製劑例如凝膠劑等；且所述組合物可通過口服或胃腸外施用。優選地，可在飲食之前或之後以膠囊劑、片劑和飲料的形式施用本發明的組合物以獲得快速效應。包含本發明的組合物的膠囊劑、片劑、粉劑、顆粒劑、溶液、丸劑等優選地用作藥物或保健品。在本發明中，"保健品"是指通過使用具有對人體有用的功能的物質或成分，以片劑、膠囊劑、粉劑、顆粒劑、溶液、丸劑等形式製備和加工的食物產品。依賴於活性成分至身體的吸收程度、排洩率、年齡、體重、性別和患者的身體狀況、治療疾病的嚴重度等適當地施用本發明的組合物。然而，一般地，優選地以每天0.01500mg/kg，優選地0.1200mg/kg，每天1至3次給成人施用溶液形式的本發明組合物。在其他製劑中，可口服施用基於上述的溶液劑量的合適的量。在下文中，將參考下列實施例更詳細地描述本發明，但本發明的範圍不應當被解釋為以任何方式受其限制。實施例1)黑兒茶、黃芩和茶樹提取物的製備實施例l.黑兒茶熱水提取物的製備用熱蒸氣蒸黑兒茶的嫩葉(50g)。然後，通過加入純化水並擠出汁液來提取它們，緩慢地冷卻和重結晶收集的汁液溶液以產生7.87g黑兒茶提取物粉劑(產率15.74%)。實施例2.黑兒茶乙醇提取物的製備通過加入乙醇並擠出汁液來提取黑兒茶的嫩葉(50g)，緩慢地冷卻和再結晶收集的汁液溶液以產生7.65g黑兒茶提取物粉劑(產率15.3%)。實施例3.黃芩提取物的製備將黃芩(50g)置於1L圓底燒瓶中，然後加入純化水(350ml)，在8(TC於回流條件下提取2小時。冷卻、過濾和濃縮提取物，產生16.5g黃芩提取物粉劑(產率32.95%).實施例4.茶樹提取物的製備將茶樹(50g)置於1L圓底燒瓶中，然後加入含水乙醇(500ml)，在85t:於回流條件下提取3小時。冷卻、過濾和濃縮提取物，產生13.5g茶樹提取物粉劑(產率27%)。實施例9.其他鉤藤屬植物的提取將Uncariasinensis(Olv.)Havil.(50g)置於1L圓底燒瓶中，然後加入純化水(500ml)，在回流條件下提取5小時。冷卻、過濾和濃縮提取物，產生7gUncariasinensi提取物粉劑(產率14%)。2)混合物的製備輔你l5.lUI茶禾瞎緣混，白儘ll如下製備黑兒茶和黃芩的混合物。組分加入量(g)加入比例(％)實施例12.610.20實施例318.472.16糊精_麥芽糖複合劑4.517.65合計25.5跳0輔艇IUI茶織扭鍾始麵燃如下製備黑兒茶和茶樹的混合物。組分加入量(g)加入比例(％)實施例12.6010.20實施例415.3060.0糊精_麥芽糖複合劑7.6029.8合計25.50100.00實施例7.黑；l,茶、昔芩和茶樹的混合物的製備如下製備黑兒茶、黃芩和茶樹的混合物。組分加入量(g)加入比例(％)實施例12.6010.20實施例318.4072.16tableseeoriginaldocumentpage11輔數群織扭鍾始麵燃如下製備黃芩和茶樹的混合物。tableseeoriginaldocumentpage11實驗件實施例1)COX和/或5-LO抑制活性的檢測(l)COX抑制活性的檢測①試驗材料-材料C0X分析試劑盒(Cayman,Cat#760111)、噴哚美辛(Cayman,Cat#70270)、AA-861(Biomol，Cat能I—216)、H202(Aldrich，Cat#216763)-樣品實施例1至8-f農度10、50、500、1000iig/ml②檢測方法將分析緩衝液(160ill)和血紅素(10Pi)置於背景小孔(BackgroundWells)中。將分析緩衝液(150ii1)、血紅素(10ii1)和酶(C0X-1或C0X-2，lOiil)置於100%的起始活性小孔(InitialActivityWell)中。將分析緩衝液(150iU)、血紅素(lOiil)和酶(C0X-1或C0X-2，lOiil)置於抑制劑小孔(InhibitorWell)中。將溶解在匿S0中的樣品(lOiU)置於抑制劑小孔中。將用於溶解樣品的溶劑匿S0(10iil)，而非樣品，置於100%的起始活性小孔和背景小孔中。在緩慢地搖動後，將其在25t:下反應5分鐘。將20iU比色底物加入每個小孔。然後，將20iU花生四烯酸加入每個小孔(終濃度100iiM)。在緩慢搖動後，讓其在25t:下反應5分鐘。停止反應，測量590nm(590611nm)處的吸光率，然後通過下列計算公式以百分比計算試驗組和對照組比較的相對活性。-計算公式formulaseeoriginaldocumentpage12③試驗結果單一提取物和混合物的對C0X-1、2的50%抵制活性(單位iig/ml)tableseeoriginaldocumentpage12結論在單一提取物中，根據實施例1=實施例2口實施例3的結果，黑兒茶提取物顯示優良的COX抑制活性。且，其中所述單一提取物以適當的比例混合的混合組合物顯示以實施例6>實施例7>實施例8>實施例5的順序排列的C0X抑制活性。如從上述試驗所知的，黑兒茶粗提取物(實施例1和實施例2)顯示優良的C0X抑制活性，而黃芩的5-L0抑制活性不顯著。然而，令人驚奇的是，所述提取物的混合物顯示協同作用的COX抑制活性。(2)5-L0(LTB4產品抑制)①試驗材料RPMI1640培養基sigmaCet#R8758T75瓶Corning(430641)抗生素Gibco(15240-062)FBS:biowhittaker(14-471QM)微量管sarstedt(72.690)PBS:biowhittaker(17-512F)離心機Hanil(micro-12)-樣品實施例1至8-濃度:0.025、0.05、l、20iig/ml(實施例1至3)0.005、0.05、0.5、5iig/ml(實施例4至7)②試驗方法在5XC02和37t:的條件下，將HT-29細胞系(韓國細胞系文庫KoreaCellLineBank)在T15培養瓶中培養於20mLRPMI1640培養基(10X的FBS)中，且將所述細胞系每周傳代2-3次。將HT-29細胞系以1.5-2.0X105/小孔/2ml播種於6孔培養板中，然後在5%C02和37°C的條件下培養直至其顯示大約60-70%的融合。在除去培養基後，用PBS(biowhittaker，17-512F)洗滌細胞2-3次，然後向其中加入2mL新培養基(5%FBS，biowhittaker，14-471QM)。處理樣品使其終濃度為0、0.005、0.05、0.5和5iig/ml。此夕卜，處理LPS以達到1iig/ml的終濃度。以用於溶解樣品的溶劑(低於O.1%匿S0)，而非樣品，處理未處理的N-對照。P-對照只用LPS處理。將每個樣品在5%C02和37°C的條件下反應24小時。在反應停止後，用PBS洗滌細胞兩次，用刮器刮取細胞，將其置於微量管中，然後在超過10，000rpm下離心5分鐘，之後收集細胞。在棄去上清液後，向其中只保留沉澱的管中加入裂解緩衝液並在冰中處理5分鐘，然後細胞被破壞。將其在超過10，000rpm下離心5分鐘後，留下細胞碎片且只將上清液收集入新的管中。將該樣品在-701:下貯存直至用於LTB4ELISA分析。用試劑盒中的EIA緩衝液以1/20稀釋細胞裂解物。將LTB4標準製備為0、0.04、0.1、0.2、0.4、1.0、2.0和4.Oiig/ml。通過用EA緩衝液以1/50將其稀釋來製備白細胞三烯C4酶綴合物。將50標準或樣品和501稀釋的酶綴合物置於包被有抗體的96孔板中。在緩慢搖動後，讓其在室溫下加蓋反應l小時。在反應停止後，用3001洗滌緩衝液洗滌板3次。向板中加入1501底物，然後在緩慢搖動下反應30分鐘。測量650nm處的吸光率，通過下列計算公式以百分比計算和對照組相比的試驗組的相對活性。按照Bradford蛋白的量對各值進行標準化。-計算公式抑制的％=[(NC-PC)-(NC-S)/(NC-PC)]xlOO③試驗結果單一提取物和混合物的對5-LO的50%抑制活性(單位g/ml)5-LO實施例10.044實施例20.040實施例30.846實施例50.039實施例60.007實施例70.024實施例80.027結論單一提取物的5-LO抑制活性的順序是實施例1=實施例2口實施例3。且，其中以適當比例混合所述單一提取物的混合物以實施例6>實施例7^實施例8>實施例5的順序顯示5-LO抑制活性。和上述關於C0X-1、2的試驗相似，在本試驗中，黑兒茶粗提取物也顯示優良的5-L0抑制，而黃芩提取物的5-LO抑制活性不顯著。然而，令人驚奇的是，所述提取物的混合物顯示協同作用的5-LO抑制活性。(3)耳腫脹抑制試驗(腫脹抑制試驗)①試驗材料-試驗動物ICR小鼠(DaehanBioLink)-炎症誘導花生四烯酸(2mg/20y1)-樣品實施例1至8-陽性對照吲哚美辛(25，50mg/kg)-濃度50、75、100mg/kg②試驗方法在炎症產生之前24小時和1小時時，給試驗動物(ICR小鼠，DaehanBioLink)施用試驗材料。然後，以2mg/20iU的濃度給試驗動物的右耳施用花生四烯酸，給左耳施用作為對照溶劑的丙酮，然後用測徑器測量用於溶劑比較的耳的厚度。作為對照材料，在施用花生四烯酸之前24小時和1小時，口服施用吲哚美辛，其是NSAID的代表性消炎和消炎止痛藥。在第1、2和3小時時測量對其施用花生四烯酸和丙酮的試驗動物的耳的厚度。③結論實施例1和2的消炎活性顯示於圖1;實施例5和實施例1、3的消炎活性顯示於圖3;實施例6和實施例1、4的消炎活性顯示於圖4;實施例7和實施例1、3、4的消炎活性顯示於圖5;和實施例8和實施例1、4的消炎活性顯示於圖6^P<0.05，**P<0.01).如從上面圖1至圖6所知的，黑兒茶單一提取物和其混合物顯示消炎作用。特別地，實施例1顯示比實施例3更強的消炎作用，且其實施例5的混合物(100mg/kg)顯示來自單一提取物的混合的協同效應。且，為實施例1和3的混合物的實施例5顯示消炎活性的濃度依賴性增加的趨勢。如上所示，當將實施例1和實施例3或實施例4混合時，或將實施例3和實施例4混合時，和單獨的實施例1相比，組合物(實施例5至8)顯示改善的耳腫脹抑制作用。(4)通過CIA模型進行的消炎活性的驗證①試驗材料_試驗動物DBA/1小鼠(OrientalCo.，Ltd.)-陽性對照吲哚美辛(50mg/kg)-對照材料葡糖胺(250mg/kg)-樣品實施例5-濃度100、200mg/kg②試驗方法使用8周的DBA/1小鼠(OrientalCo.，Ltd)誘導關節炎。為免疫小鼠，給小鼠的尾部施用lOOyg懸浮CFA(完全弗氏佐劑)的膠原。21天後，100yg懸浮CFA(完全弗氏佐劑)的膠原誘導了關節炎。從第21天，將小鼠分為5組，每組5隻小鼠，且給小鼠施用製備的提取物直至第56天。每周一次，測量小鼠的重量、具有腫脹的爪的厚度和分數(0:正常，l:輕微發紅，2:足指腫脹，3:全面嚴重的腫脹，4:整個足趾和關節的最嚴重腫脹)。在第56天，收集其血液；對小鼠進行屍檢；在固定和脫鈣的過程後用HE(蘇木精和曙紅)對其腫脹的爪染色；然後通過顯微鏡觀察關節組織。③結論在施用膠原後，小鼠爪的腫脹隨時間流逝的改變和關節炎指數隨時間流逝的改變分別顯示於圖7和圖8(*P<0.05)。且，施用實施例5後的CIA小鼠關節的軟骨組織顯示於圖9。如從上面圖7至圖9中所知的，和對照組相比，實施例5施用組為大約20%的有效性。觀察到和對照組與葡糖胺施用組相比，關節組織的破壞和免疫細胞的浸潤顯著減少。(Corning3516)、Dulbecco，s改良Eagle，s培養基(DMEM，Biowhittaker)、加熱滅活的胎牛血清白蛋白(FBS)、青黴素-鏈黴素(Gibco)、IL_1a(R&D200LA-002)和BlyscanGlycosaminoglycan分析試劑盒(BiocolorB1000)-樣品實施例1至8-對照材料葡糖胺-濃度5、50、500iig/ml-試驗動物獲自Samtako(Ky皿ggi-provence，0san-si)的紐西蘭白兔(2.0kg，9周)②試驗方法-軟骨外植塊培養從9周的兔子收集膝關節軟骨。然後，將收集的軟骨置於DMEM(5XFBS、青黴素100U/ml、鏈黴素lOOiig/ml)中並在37。C下的C02培養基中穩定24小時。在處理樣品前，將每一個軟骨切成一定大小的薄片並置於24孔中。處理製備的樣品和IL-1a(5ng/ml)。在37°C、5%C02培養基中將經處理的樣品反應60小時後，收集上清液並在-2(rC下貯存，且在下一次試驗中使用。-GAG分析為測量上清液的GAG分泌程度，使用Blyscan分析試劑盒。測量656nm處的吸光率，通過下列公式以百分比計算和對照組相比的試驗組的相對活性。-計算公式計算公式=[(PC-樣品)-(PC-NC)]x100NC:陰性對照，PC:陽性對照，S:樣品③試驗結果實施例1至4和5至8的關節保護作用分別顯示於圖10和圖11中。結論特別地，實施例1至4禾P5至8在《50iig/ml的濃度上顯示關節保護作用。配製的實施例1:溶液的製備:0167]實施例6的提取物20g:0168]糖10g:0169]異構化糖10g:0170]檸檬的味道適當的量:0171]加入純化水後的總量100ml:0172]按照溶液的常規製備方法混合上述組分，並將其滅菌以產生溶液。:0173]配製的實施例2:溶液的製備:0174]實施例的提取物130mg:0175]糖10mg:0176]異構化糖10mg15對羥基苯甲酸丙酯lg按照軟膏劑的常規製備方法混合上述組分以產生軟膏劑。工業適用性包含黑兒茶提取物的本發明組合物顯示優良的COX和/或5-LO抑制活性，另外還包含黃芩提取物和/或茶樹提取物的本發明組合物顯示協同效應，且黃芩和茶樹提取物的聯合組合物也顯示協同效應。從天然的材料獲得本發明的組合物，因而其顯示優良的COX和/或5-L0抑制活性而無副作用的危險，從而可用於預防或治療疾病，所述疾病包括炎性疾病、月經痛、動脈硬化、心臟病發作、肥胖症、糖尿病、X症候群、認知功能的疾病、老年痴呆症、呼吸系統變應性反應、慢性靜脈功能不全、痔瘡、系統性紅斑狼瘡、牛皮癬、慢性緊張性頭痛、偏頭痛、炎性腸病、由病毒、細菌和孢子引起的局部感染、曬傷、燒傷、接觸傳染性皮炎、黑色素瘤和癌症。此外，本發明組合物可用於預防或治療不同的炎性疾病，包括，特別是骨關節炎、類風溼性關節炎等。權利要求用於預防或治療由環加氧酶即COX和/或5-脂氧化合酶即5-LO介導的生理性和病理性病症的、包含黃芩和茶樹提取物的組合物，其中黃芩和茶樹的重量比為0.1～10∶0.1～10。2.權利要求1的組合物，其中由COX和/或5-LO介導的生理性和病理性病症選自炎性疾病、月經痛、動脈硬化、心臟病發作、肥胖症、糖尿病、X症候群、認知功能的疾病、老年痴呆症、呼吸系統變應性反應、慢性靜脈功能不全、痔瘡、系統性紅斑狼瘡、牛皮癬、慢性緊張性頭痛、偏頭痛、炎性腸病、由病毒、細菌和孢子引起的局部感染、曬傷、燒傷、接觸傳染性皮炎、黑色素瘤和癌症。3.權利要求2的組合物，其中由C0X和/或5-L0介導的生理性和病理性病症是炎性疾病。4.權利要求l的組合物，其中用一種或多種選自水、丙酮、或C卜4醇和異丙醇的極性溶劑提取所述提取物。5.權利要求3的組合物，其中所述炎性疾病是骨關節炎或類風溼性關節炎。6.黃芩提取物和茶樹提取物製備用於預防或治療由C0X和/或5-L0介導的生理性和病理性病症的用途。7.權利要求6的用途，其中所述由C0X和/或5-L0介導的生理性和病理性病症選自炎性疾病、月經痛、動脈硬化、心臟病發作、肥胖症、糖尿病、X症候群、認知功能的疾病、老年痴呆症、呼吸系統變應性反應、慢性靜脈功能不全、痔瘡、系統性紅斑狼瘡、牛皮癬、慢性緊張性頭痛、偏頭痛、炎性腸病、由病毒、細菌和孢子引起的局部感染、曬傷、燒傷、接觸傳染性皮炎、黑色素瘤和癌症。8.權利要求7的用途，其中所述由C0X和/或5-L0介導的生理性和病理性病症是炎性疾病。9.權利要求6的用途，其中用一種或多種選自水、丙酮、或C卜4醇和異丙醇的極性溶劑提取所述提取物。10.權利要求6的用途，其中黃芩茶樹的重量比是o.iio:o.iio。11.權利要求8的用途，其中所述炎性疾病是骨關節炎或類風溼性關節炎。12.製備用於預防或治療由C0X和/或5-L0介導的生理性和病理性病症的藥物的方法，通過將黃吝提取物和茶樹提取物以o.iio:o.iio的重量比混合來進行配製。全文摘要本發明涉及用於預防或治療由環加氧酶(COX)和/或5-脂氧化合酶(5-LO)介導的生理性和病理性病症的、包含鉤藤屬植物，特別是黑兒茶，或其提取物的組合物，和涉及所述鉤藤屬植物提取物和黃芩提取物和/或茶樹提取物的聯合組合物。本發明組合物顯示優良的COX和/或5-LO抑制作用，從而可用於預防或治療由不同的COX途徑和/或5-LO途徑介導的疾病和病症，包括骨關節炎和類風溼性關節炎。文檔編號A61P9/10GK101785803SQ201010115849公開日2010年7月28日申請日期2005年9月1日優先權日2004年9月1日發明者成喜善,李映澈,禹盛植,趙臺衡,車智敏,都善吉,金東善,金泰佑,金種漢申請人:株式會社優力竟