用於生物酶固定化的醛基介孔分子篩及其製備方法

2023-06-01 11:59:01

專利名稱：用於生物酶固定化的醛基介孔分子篩及其製備方法
技術領域：
本發明涉及一種用於生物酶固定化的醛基介孔分子篩及其製備方法，具體地說， 用6°Co-Y射線預輻照接枝丙烯醛技術或醛丙基三甲氧基矽烷對介孔分子篩表面的功 能化修飾，在介孔分子篩表面引入鏈長較短的醛丙基官能團(-CH2-CH2-cho)，然後使生物酶 以共價結合方式固定在介孔分子篩表面，提高固定化酶的性能。
背景技術：
將游離酶直接用於催化過程存在許多不足，如在高溫、強酸、強鹼和有機溶劑中不 穩定，容易喪失催化活性；游離酶回收困難，經濟上不合理，還造成產物難以分離提純，嚴重 影響產品質量；生產過程難以實現連續操作，只能一次性間歇操作等。固定化酶克服了遊 離酶的上述不足，不僅保持了游離酶特有的催化特性，還提高了操作穩定性，生產過程易於 實現連續操作，反應完成後易於與產物分離且可以重複使用，所得的產品純度高，生產成本 低。因此，酶的固定化一直是催化化學、生物化學和材料化學等領域的研究熱點。固定化酶的常用製備方法可以分為四種包埋法、交聯法、吸附法和共價結合法。 包埋法分為網格型和微囊型兩類，可獲得較高的酶活力回收，但必須巧妙設計反應條件，制 得的固定化酶不適用於大分子底物，一般用於製備固定化細胞。交聯法是指先將酶吸附於 不溶性載體上，然後使用雙官能團或多功能團交聯劑使酶分子之間進行交聯，形成網狀結 構，可得到酶蛋白單位濃度較高的固定化酶，但存在著反應條件劇烈、酶活損失等不足。吸 附法包括物理吸附和離子吸附法，具有酶活性中心不易被破壞和酶高級結構變化較少等優 點，但由於酶與載體之間是以離子鍵、範德華力和氫鍵等較弱的作用力相連接，酶容易流 失。共價結合法是藉助共價鍵將酶的活性非必需側鏈基團和載體的功能性基團進行偶聯制 備固定化酶的方法，因酶與載體之間以共價鍵相結合，呈現良好的操作穩定性，是目前工業 上廣泛使用的酶固定化方法。由上述固定化酶的製備方法可知，要想得到性能優異的固定化酶，載體必須滿足 以下要求載體表面具有可與酶分子發生相互作用的功能性基團，或可以通過表面改性進 行功能化；載體表面的功能性基團數量及其分布適當，而且容易接近；載體必須是多孔物 質，具有較高的比表面積；載體具有較大的孔徑，以降低酶催化反應過程中存在的擴散阻 力；載體具有足夠的機械強度和化學穩定性。生物酶固定化載體可分為兩類無機載體和有機載體。與廣泛使用的有機載體相 比較，無機載體具有更高的機械強度和較好的化學穩定性，其結構和表面性質容易控制，其 突出優勢是負載的酶經焙燒等簡單處理就可以除去，載體可以重複使用，這就大大降低了 固定化酶的成本，也避免了已失活的固定化酶的後處理問題，減輕了對環境的壓力。新型介 孔分子篩具有較大連續可調的孔徑、高的比表面積、較大的吸附容量和孔道內富含弱酸性 羥基，可以使體積較大的酶分子固定於分子篩介孔中和反應產物及時擴散出孔道，保持固 定化酶適宜的微環境，因而製得的固定化酶具有較高的催化活性，同時固定化酶的使用溫 度較低，可以避免介孔分子篩普遍存在的水熱穩定性差的問題，因此，介孔分子篩是一類很有發展前途的酶固定化新型無機載體。固定化酶的性能與介孔分子篩的結構(晶型、孔徑、孔容和比表面積)密切相關。 介孔分子篩的孔徑是影響固定化酶活性的關鍵因素，當介孔分子篩的孔徑大於生物酶的分 子尺寸時，在酶的固定化過程中，酶分子就容易進入介孔分子篩孔道內與表面的功能性基 團相結合，充分利用介孔分子篩的孔容，得到的固定化酶具有較高活性。介孔分子篩的晶 型、孔容和比表面積對固定化酶活性都有較大影響。由於生物酶分子與介孔分子篩表面弱 酸性羥基之間通常是以較弱的氫鍵作用力相結合，在使用過程中一部分酶會發生脫落，操 作穩定性有待進一步提高，如何在基本保持固定化酶活性的前提下，提高固定化酶的操作 穩定性，仍需要做進一步的研究。固定化青黴素醯化酶(EC 3.5. 1. 11，酶分子尺寸70ax50ax55a )是半合成
3 _內醯胺類抗生素生產中最關鍵的酶，它既能催化青黴素及其擴環酸水解去側鏈，生產半 合成內醯胺類抗生素的重要中間體6-氨基青黴烷酸(6-APA)和7-氨基-3-脫乙醯氧 基頭孢烷酸(7-ADCA)，又能催化6-APA和7-ADCA與側鏈縮合，生產多種半合成0 -內醯胺 類抗生素(如 Ampicillin, Amoxicillin, Cephalexin 禾口 Cefadroxil 等)。我國人口眾多，對半合成內醯胺類抗生素的需求很大，用固定化青黴素醯化 酶工藝生產半合成青黴素是一條低成本的綠色生產工藝，已被列為我國今後生物醫藥發展 的六大重點方向之一。由於基因工程的迅猛發展，重組青黴素醯化酶已能高效表達和大量 生產，中科院上海生命科學院用DNA操作技術獲得了高產的青黴素醯化酶基因工程菌株， 大大降低了游離酶的生產成本。但我國目前工業上所用載體全部依賴進口，固定化酶的生 產成本還太高。因此，性能優異的固定化載體的合成技術已成為我國青黴素醯化酶固定化 技術發展的技術瓶頸，發展具有我國自主智慧財產權的固定化載體合成路線，從根本上擺脫 我國長期依賴進口載體生產固定化酶的被動局面，開發有自主智慧財產權的半合成內醯 胺類抗生素酶法工藝，以滿足日益增長的國內需求和增強產品的國際競爭力，從而為我國 固定化酶技術的進步和抗生素產業的可持續發展做出積極貢獻。中國專利CN1320688A公開了一種用於青黴素醯化酶固定化的介孔材料。該介孔 材料的最大孔徑為3. 3nm,固定化酶的最高酶活為511U/g，但由於該介孔材料的孔徑比青 黴素醯化酶的分子尺寸小得多，而且通過利用載體表面的弱酸性羥基與酶分子之間的較弱 氫鍵作用力實現酶的固定化，因此，得到的固定化酶性能較差。中國專利CN1935994A公開了一種有機基團功能化介孔分子篩酶固定化載體及其 製備方法。通過用3-含氧縮水甘油基丙基三甲氧基矽烷或氨丙基三乙氧基矽烷和戊 二醛對介孔分子篩表面的功能化修飾，引入環氧基或醛基等有機官能團(佔載體總質量的 2 9% )，然後在溫和條件下以共價結合方式固定生物酶分子，獲得的固定化青黴素醯化 酶具有高的催化活性和使用穩定性，固定化酶的表觀活性為1000 2000IU/g，重複使用10 次後，固定化酶保留90%以上的初始表觀活性。但由於上述兩種方法引入的有機官能團的 鏈長比較長，經過表面功能化後，介孔分子篩的孔徑、比表面積及孔容均明顯變小，大大降 低了固定化酶的活性。中國專利CN1580233A公開了一種用於酶固定化的介孔反應器及其製備方法。這 種介孔反應器通過介孔材料表面的羥基基團與酶分子羧基氧原子相互作用，將酶分子固定 在介孔材料孔道內，再利用接枝技術將矽烷偶聯劑接枝在介孔材料的孔口處，最後利用聚合矽烷偶聯劑末端的雙鍵聚合，在孔口處形成網狀結構。通過這種方法製備的介孔反應器 可以有效地將載體的孔口縮小，在抑制酶分子流失的同時還不會對底物和產物造成傳質阻 力，因而得到具有高催化活性和高操作穩定性的固定化酶。介孔材料選用SBA-15、MCM-41、 MCM-48和FSM中的一種，酶選用豬胰脂肪酶、辣根過氧化物酶、球蛋白酶、胰島素中的一種。 但該方法在製備固定化酶過程中使用了大量有機溶劑，容易使游離酶喪失催化活性。

發明內容
本發明目的就是為了克服上述現有技術存在的缺陷而提供一種可提高固定化酶 的活性和操作穩定性的用於生物酶固定化的醛基介孔分子篩的製備方法。本發明的目的可以通過以下技術方案來實現一種用於生物酶固定化的醛基介孔 分子篩的製備方法，其特徵在於，該方法是用6°Co-Y射線預輻照接枝丙烯醛技術或醛 丙基三甲氧基矽烷對介孔分子篩表面的功能化修飾，在介孔分子篩表面引入鏈長較短的醛 丙基官能團(-ch2-ch2-cho)。所述的6°Co- y射線預輻照接枝丙烯醛技術是將介孔分子篩置於6°Co- y射線中預 輻照，輻照劑量為24 120kGy，樣品經預輻照後轉移至體積百分含量為10 90%的丙烯 醛水溶液中，在30 80°C水浴中反應10 30小時，然後將介孔分子篩過濾後，在索氏提取 器中用乙醇抽提除去丙烯醛聚合物，再在50 100°C真空烘箱中乾燥12 24小時得到醛 基介孔分子篩。所述的丙烯醛水溶液的體積和介孔分子篩的質量比為50 200 1。所述的醛丙基三甲氧基矽烷對介孔分子篩表面的功能化修飾是將介孔分子 篩和醛丙基三甲氧基矽烷加入甲苯溶液中，在100 120°C加熱回流5 15小時，然 後將介孔分子篩過濾後，在索氏提取器中用乙醇抽提除去未反應的醛丙基三甲氧基矽 烷，再在50 100°C真空烘箱中乾燥12 24小時得到醛基介孔分子篩。所述的醛丙基三甲氧基矽烷和介孔分子篩的質量比為0.3 2 1，所述的甲 苯的體積和介孔分子篩的質量比為20 100 1。所述的醛基介孔分子篩可用於青黴素醯化酶、葡萄糖異構酶、葡萄糖轉苷酶、胰蛋 白酶和澱粉酶等水溶性生物酶的固定化，特別適用於青黴素醯化酶的固定化。用上述方法製備的醛基介孔分子篩的平均孔徑為10 35nm，比表面積為300 600m2/g,孔容在1. 0 2. 5cm7g之間，醛丙基官能團佔介孔分子篩總質量的9. 0 15. 0%， 可用於青黴素醯化酶、葡萄糖異構酶、葡萄糖轉苷酶、胰蛋白酶和澱粉酶等水溶性生物酶的 固定化，特別適用於青黴素醯化酶的固定化。與現有技術相比，本發明所述的醛基介孔分子篩的製備方法的顯著優點在於，通 過用6°Co-Y射線預輻照接枝丙烯醛技術或醛丙基三甲氧基矽烷對介孔分子篩表面的 功能化修飾，在介孔分子篩表面引入鏈長較短的醛丙基官能團，儘量減少表面功能化過程 對於介孔分子篩的孔徑、比表面積和孔容的影響，不需要進一步活化就可以直接使生物酶 以共價結合方式固定在介孔分子篩表面，提高固定化酶的性能。本發明所述的醛基介孔分子篩的顯著優點之一在於，該醛基介孔分子篩的孔徑比 青黴素醯化酶的分子尺寸大得多，有利於更多的酶分子進入介孔分子篩孔道內被固定化， 提高固定化酶的活性。
本發明所述的醛基介孔分子篩的顯著優點之二在於，該醛基介孔分子篩通過表面 的醛丙基與酶分子中氨基之間形成的共價鍵來實現酶的固定化，提高固定化酶的操作穩定 性。


圖1為用6°Co_ Y射線預輻照接枝技術對介孔分子篩表面的醛基功能化及酶的固 定化示意圖；圖2為用Y _醛丙基三甲氧基矽烷對介孔分子篩表面的醛基功能化及酶的固定化 示意圖。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明進行詳細說明。在以下實施例中，採用下述方法進行青黴素醯化酶的固定化，以及測定固定化酶 的活性和操作穩定性青黴素醯化酶的固定化稱取0. lg載體與6. OmL經pH = 7. 8的磷酸鹽緩衝溶液 稀釋的青黴素醯化酶溶液(VbuffCT/VmzyM = 2 1)混合，放入30°C的水浴搖床中固定化18 小時後進行離心分離，所得固體用pH = 7. 8的磷酸鹽緩衝溶液多次洗滌後進行活性測定。固定化酶的活性測定(青黴素G鉀鹽水解製備6-APA)在37°C的溫度下，將上述 固定化酶與lOOmL 4襯％的青黴素G鉀鹽水溶液(用0. lmol/L pH = 7. 8磷酸鹽緩衝溶液稀 釋)均勻混合，然後用濃度為0. lmol/L的NaOH溶液滴定，使混合溶液的pH值保持在7. 8， 記錄10分鐘內NaOH的消耗量。然後用以下公式來計算固定化酶的活性A (IU/g) = VNa0HXCNa0HX 103/ (mXt)其中A代表固定化酶的活性;VNa0H代表NaOH消耗量(ml) ；C,^代表NaOH濃度 (mol/L) ；m代表載體乾重(g) ；t代表測試所用時間(min)。固定化酶的操作穩定性測定將已使用過的固定化酶溶液進行離心分離，然後將 固定化酶轉移到反應器中，採用上述活性測定方法測定使用過的固定化酶的活性。經過10 次循環使用後，固定化酶的活性與初始活性的百分比越高，則說明固定化酶的操作穩定性 越好。對比例在室溫條件下，將2. 0g Pluronic P123 (E020P070E020, Mav = 5800)溶於 75mL 1.6mol/L的HC1溶液中；待P123完全溶解後加入0.023g氟化銨和3.0g 1，3，5-三甲苯，然 後將溶液升溫至35°C並持續攪拌45min後，加入4. 4g正矽酸乙酯，並在35°C下持續攪拌20 小時；將溶液轉入帶有聚四氟乙烯內襯的水熱晶化釜中，於100°C水熱晶化24小時；待溶液 冷卻至室溫後過濾得到白色固體，在100°C的烘箱中乾燥過夜，然後在馬弗爐中程序升溫至 550°C焙燒8小時得到介孔分子篩。將上述介孔分子篩用於青黴素醯化酶的固定化，得到的 固定化酶活性為10465U/g，經過10次循環使用後，固定化酶保留了 77%的初始活性。實施例1在室溫條件下，將2. 0g Pluronic P123 (E020P070E020, Mav = 5800)溶於 75mL 1. 6mol/L的HC1溶液中；待P123完全溶解後加入0. 023g氟化銨和3. 0g 1，3，5-三甲苯，然後將溶液升溫至35°C並持續攪拌45min後，加入4. 4g正矽酸乙酯，並在35°C下持續攪拌 20小時；將溶液轉入帶有聚四氟乙烯內襯的水熱晶化釜中，於100°C水熱晶化24小時；待 溶液冷卻至室溫後過濾得到白色固體，在100°c的烘箱中乾燥過夜，然後在馬弗爐中程序升 溫至550°C焙燒8小時得到介孔分子篩。用6°Co_ Y射線預輻照接枝技術對介孔分子篩表面的醛基功能化及酶的固定化的 示意圖如圖1所示，將l.Og上述介孔分子篩置於6°Co-y射線中預輻照，輻照劑量為72kGy， 樣品經預輻照後轉移至160mL 50%的丙烯醛水溶液中，置於冰水浴中，抽真空，充氮氣，然 後在60°C水浴中反應20小時；將介孔分子篩過濾後，在索氏提取器中用乙醇抽提以除去丙 烯醛聚合物，然後在50°C真空烘箱中乾燥24小時得到醛基介孔分子篩。將上述醛基介孔分 子篩用於青黴素醯化酶的固定化，得到的固定化酶活性為8580U/g，經過10次循環使用後， 固定化酶保留了 83%的初始活性。實施例2介孔分子篩的製備方法與實施例1相同。將1. 0g上述介孔分子篩置於6°Co_ Y射 線中預輻照，輻照劑量為24kGy，樣品經預輻照後轉移至50mL 90 %的丙烯醛水溶液中，置 於冰水浴中，抽真空，充氮氣，然後在30°C水浴中反應30小時；將介孔分子篩過濾後，在索 氏提取器中用乙醇抽提以除去丙烯醛聚合物，然後在75°C真空烘箱中乾燥18小時得到醛 基介孔分子篩。將上述醛基介孔分子篩用於青黴素醯化酶的固定化，得到的固定化酶活性 為8760U/g，經過10次循環使用後，固定化酶保留了 81%的初始活性。實施例3介孔分子篩的製備方法與實施例1相同。將1. 0g上述介孔分子篩置於6°Co_ Y射 線中預輻照，輻照劑量為120kGy，樣品經預輻照後轉移至200mL 10%的丙烯醛水溶液中， 置於冰水浴中，抽真空，充氮氣，然後在80°C水浴中反應10小時；將介孔分子篩過濾後，在 索氏提取器中用乙醇抽提以除去丙烯醛聚合物，然後在100°C真空烘箱中乾燥12小時得到 醛基介孔分子篩。將上述醛基介孔分子篩用於青黴素醯化酶的固定化，得到的固定化酶活 性為8920U/g，經過10次循環使用後，固定化酶保留了 80%的初始活性。實施例4介孔分子篩的製備方法與實施例1相同。用醛丙基三甲氧基矽烷對介孔分子 篩表面的醛基功能化及酶的固定化示意圖如圖2所示，將1. 0g介孔分子篩和1. 78g 醛 丙基三甲氧基矽烷加入到50mL甲苯溶液中，在110°C加熱回流10小時；將介孔分子篩過濾 後，在索氏提取器中用乙醇抽提以除去未反應的醛丙基三甲氧基矽烷，然後在50°C真 空烘箱中乾燥12小時得到醛基介孔分子篩。將上述醛基介孔分子篩用於青黴素醯化酶的 固定化，得到的固定化酶活性為8895U/g，經過10次循環使用後，固定化酶保留了 92%的初 始活性。實施例5介孔分子篩的製備方法與實施例1相同。將1. 0g介孔分子篩和1. 07g Y -醛丙基 三甲氧基矽烷加入到50mL甲苯溶液中，在110°C加熱回流10小時；將介孔分子篩過濾後， 在索氏提取器中用乙醇抽提以除去未反應的醛丙基三甲氧基矽烷，然後在50°C真空烘 箱中乾燥12小時得到醛基介孔分子篩。將上述醛基介孔分子篩用於青黴素醯化酶的固定 化，得到的固定化酶活性為9240U/g，經過10次循環使用後，固定化酶保留了 89%的初始活性。實施例6介孔分子篩的製備方法與實施例1相同。將1. 0g介孔分子篩和0. 36g 醛丙基 三甲氧基矽烷加入到50mL甲苯溶液中，在110°C加熱回流10小時；將介孔分子篩過濾後， 在索氏提取器中用乙醇抽提以除去未反應的醛丙基三甲氧基矽烷，然後在50°C真空烘 箱中乾燥12小時得到醛基介孔分子篩。將上述醛基介孔分子篩用於青黴素醯化酶的固定 化，得到的固定化酶活性為9626U/g，經過10次循環使用後，固定化酶保留了 86%的初始活 性。實施例7介孔分子篩的製備方法與實施例1相同。將1. 0g介孔分子篩和0. 3g Y _醛丙基 三甲氧基矽烷加入到20mL甲苯溶液中，在100°C加熱回流5小時；將介孔分子篩過濾後，在 索氏提取器中用乙醇抽提以除去未反應的醛丙基三甲氧基矽烷，然後在50°C真空烘箱 中乾燥12小時得到醛基介孔分子篩。將上述醛基介孔分子篩用於青黴素醯化酶的固定化， 得到的固定化酶活性為9650U/g，經過10次循環使用後，固定化酶保留了 85%的初始活性。實施例8介孔分子篩的製備方法與實施例1相同。將l.Og介孔分子篩和2.0g 醛丙基 三甲氧基矽烷加入到100mL甲苯溶液中，在120°C加熱回流15小時；將介孔分子篩過濾後， 在索氏提取器中用乙醇抽提以除去未反應的醛丙基三甲氧基矽烷，然後在100°C真空 烘箱中乾燥24小時得到醛基介孔分子篩。將上述醛基介孔分子篩用於青黴素醯化酶的固 定化，得到的固定化酶活性為8775U/g，經過10次循環使用後，固定化酶保留了 93%的初始 活性。
權利要求
一種用於生物酶固定化的醛基介孔分子篩的製備方法，其特徵在於，該方法是用60Co-γ射線預輻照接枝丙烯醛技術或γ-醛丙基三甲氧基矽烷對介孔分子篩表面的功能化修飾，在介孔分子篩表面引入鏈長較短的醛丙基官能團(-CH2-CH2-CHO)。
2.根據權利要求1所述的用於生物酶固定化的醛基介孔分子篩的製備方法，其特徵在 於，所述的6tlCo-Y射線預輻照接枝丙烯醛技術是將介孔分子篩置於6tlCo-Y射線中預輻照， 輻照劑量為24 120kGy，樣品經預輻照後轉移至體積百分含量為10 90%的丙烯醛水溶 液中，在30 80°C水浴中反應10 30小時，然後將介孔分子篩過濾後，在索氏提取器中用 乙醇抽提除去丙烯醛聚合物，再在50 100°C真空烘箱中乾燥12 24小時得到醛基介孔 分子篩。
3.根據權利要求2所述的用於生物酶固定化的醛基介孔分子篩的製備方法，其特徵在 於，所述的丙烯醛水溶液的體積和介孔分子篩的質量比為50 200 1。
4.根據權利要求1所述的用於生物酶固定化的醛基介孔分子篩的製備方法，其特徵 在於，所述的Y-醛丙基三甲氧基矽烷對介孔分子篩表面的功能化修飾是將介孔分子篩和 Y-醛丙基三甲氧基矽烷加入甲苯溶液中，在100 120°C加熱回流5 15小時，然後將介 孔分子篩過濾後，在索氏提取器中用乙醇抽提除去未反應的Y -醛丙基三甲氧基矽烷，再 在50 100°C真空烘箱中乾燥12 24小時得到醛基介孔分子篩。
5.根據權利要求4所述的用於生物酶固定化的醛基介孔分子篩的製備方法，其特徵在 於，所述的Y-醛丙基三甲氧基矽烷和介孔分子篩的質量比為0.3 2 1，所述的甲苯的 體積和介孔分子篩的質量比為20 100 1。
6.根據權利要求1所述的用於生物酶固定化的醛基介孔分子篩的製備方法，其特徵在 於，所述的醛基介孔分子篩可用於青黴素醯化酶、葡萄糖異構酶、葡萄糖轉苷酶、胰蛋白酶 和澱粉酶等水溶性生物酶的固定化，特別適用於青黴素醯化酶的固定化。
全文摘要
本發明公開了用於生物酶固定化的醛基介孔分子篩及其製備方法。本發明用60Co-γ射線預輻照接枝丙烯醛技術或γ-醛丙基三甲氧基矽烷對介孔分子篩表面的功能化修飾，在介孔分子篩表面引入鏈長較短的醛丙基官能團，儘量減少表面功能化過程對於介孔分子篩的孔徑、比表面積和孔容的影響，不需要進一步活化就可以直接使生物酶以共價結合方式固定在介孔分子篩表面，提高固定化酶的性能。將上述醛基介孔分子篩可用於青黴素醯化酶、葡萄糖異構酶、葡萄糖轉苷酶、胰蛋白酶和澱粉酶等水溶性生物酶的固定化，特別適用於青黴素醯化酶的固定化，得到的固定化酶活性為8895U/g，經過10次循環使用後，固定化酶保留了92％的初始活性。
文檔編號C12N11/14GK101851616SQ20101014823
公開日2010年10月6日 申請日期2010年4月16日 優先權日2010年4月16日
發明者劉曉暉, 盧冠忠, 張志剛, 王筠松, 王豔芹, 田程程, 詹望成, 郭楊龍, 郭耘, 高振源 申請人:華東理工大學