一種冰緣植物蛋白及其編碼序列與應用的製作方法

2023-06-01 11:44:46 2

專利名稱：一種冰緣植物蛋白及其編碼序列與應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，特別涉及一種冰緣植物冷誘導蛋白及其編碼序列在提高擬南芥抗凍性中的應用。
背景技術：
低溫是影響植物地理分布和生長季節的最主要的環境因素之一，低溫凍害嚴重地影響著農作物的生長狀況和產量(Thomashow 1999)。大量的研究表明，冷響應基因的表達對植物的抗凍有著至關重要的作用(Gong et al. 2002; Hsieh et al. 2002 ；Knight etal. 1999; Thomashow 1999; Tahtiharju and Palva 2001)。冷響應基因編碼種類繁多的蛋白，如植物呼吸、碳循環、脂類、苯丙素和抗氧化代謝過程相關的酶，還有調控基因表達的轉錄因子，抗凍蛋白等(Guy 1990;Thomashow 1999; Mohapatra et al. 1989)。 研究表明，低溫脅迫可以誘導CBFs(C_repeat binding factors,尚無規範的中文術語)的表達，在CBF的過表達轉基因植物如擬南芥，番茄，水稻等，CK/ (Cold responsive,尚無規範的中文術語)基因被大量誘導，抗凍性大大增加(Stockinger et al. 1997; Liuet al. 1998;Hsieh et al. 2002 ；0h et al. 2005)。在擬南芥中，ICEl (Inducer of cbfexpression 1，尚無規範的中文術語)的過表達誘使CBF3、CBF2和COR基因的表達量升高，該轉基因植株的耐凍性也得到了極大的增強(Chinnusamy, V. et al. 2003)。在豌豆中，DNA helicase 45 (簡稱H)H，尚無規範的中文術語)和TOH47的過表達可以增加轉基因豌豆的抗凍性(Vashisht，A. A. et al. 2005)，同樣，PDH45過表達的轉基因菸草也可以耐受更低的溫度(Sanan-Mishra, N. et al. 2005)。CbCINPl {Chorispora bungeana cold induced novel protein ム尚無規範的中文術語)基因編碼冰緣植物離子芥bungeana，又名Chorispora exscapa ) 一個新的受低溫誘導而產生的蛋白CbCINPl。目前，對於此類蛋白國內外還沒有相關的研究報導，與其同源性較高的是擬南芥的ー個功能未知的蛋白DUF677(尚無規範的中文術語)，目前仍未有人掲示其功能。高山離子芥/Wflgeafla)是十字花科離子芥屬多年生植物,分布在高海拔亞高山草甸和礫石質山坡上。其環境條件的特點是氣候寒冷、空氣稀薄、輻射強、勁風。高山離子芥在我國主要分布於烏魯木齊河源區流石碓，該地區海抜3600 3900m。年平均氣溫在_5 _7°C之間，6 8月平均氣溫為3. 6°C，氣溫日差較大，是ー種伴隨反覆凍融的冰凍環境。並且處於迎風坡，流石碓中礫石保水性差，時常造成乾旱脅迫。高山離子芥在外部形態結構和生態策略上沒有顯著的抗性特徵，為了耐受長期低溫、強紫外、大風和生理乾旱，適應這些不利的環境條件，勢必通過表達抗性基因來維持自身的生理代謝和生長發育，以避免或減輕嚴酷的環境脅迫的危害。高山離子芥與擬南芥同屬於十字花科，兩者的基因組具有較高的保守性。由於高山離子芥處於冰緣環境，積累了適應低溫的有益突變，所以克隆高山離子芥的冷誘導基因CbCINPl並應用到轉基因作物中提高其抗凍性具有廣闊的應用前景。

發明內容
本發明的目的是提供一種新的高山離子芥冷誘導基因CbCINPl。本發明的另ー個目的在於提供ー種培育耐低溫的轉基因植物的方法，是將所述的編碼基因轉入植物中，得到耐低溫的轉基因植物。本發明的又ー個目的在於提供ー種由所述冷誘導基因ぬ用於轉化植物以產生轉基因植物的用途。為解決上述技術問題，本發明採用如下技術方案
本發明克隆了高山離子芥的冷誘導基因ひCVMV，所述冷誘導基因CbCINPl具有SEQID NO: I所示的核苷酸序列，其中，列表中的SEQ ID NO 1由1176個鹼基組成。該冷誘導基因的編碼基因能夠編碼CbCINPl蛋白，此種蛋白具有SEQ ID NO: 2所示的氨基 酸序列，其中，列表中的SEQ ID NO 2由391個胺基酸組成。本發明中的CbCINPl基因和同源性關係最近的基因AT1G18740 (擬南芥的未知功能的基因)只有87%的同源性(如圖1)，其編碼的蛋白質與同源性關係最近的蛋白質(擬南芥未知功能蛋白DUF677)只有90%的同源性(如圖2)。擬南芥AT1G18740基因及其編碼的蛋白質DUF677功能未知。本發明對冷誘導ひ基因進行了鑑定。將高山離子芥的愈傷組織在零下4度處理不同時間，收集材料，並提取RNA。之後將RNA反轉錄成cDNA，進行RT-PCR，根據得到的Ct值，利用Pfaffl method (Pfaff 1，2001)來計算在零下4度不同的處理時間CbCINPl基因表達量的變化，結果見圖3，由圖可知，在低溫下ぬ基因被大量誘導，在6小時達到高峰，為對照的7倍之多，在48小時後恢復到接近正常水平。證明了該基因能快速響應低溫脅迫，是ー種冷誘導的基因。含有本發明基因的表達載體、細胞系及宿主菌均屬於本發明的保護範圍。可用現有的植物表達載體構建含有基因的重組表達載體。所述植物表達載體包括雙元農桿菌載體和可用於植物微彈轟擊的載體等，如PMDC32、pCAMBIA3301、PCAMBIA1300或其它衍生植物表達載體。攜帯有本發明與植物耐缺鐵相關蛋白編碼基因
的植物表達載體可通過Ti質粒、Ri質粒、植物病毒載體、直接DNA轉化、顯微注射、電導、農桿菌介導等常規生物學方法轉化到植物細胞或組織中。被轉化的宿主植物可以是擬南芥等雙子葉植物。為了便於對轉基因植物細胞或植物進行鑑定及篩選，可對所用植物表達載體進行加エ，如加入可在植物中表達可產生顏色變化的酶或發光化合物的基因(GFP基因、GUS基因等)、具有抗性的抗生素標記物(慶大黴素標記物、卡那黴素標記物等)或是抗化學試劑標記基因(如抗除芳劑基因)等。從轉基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標記基因，直接以逆境篩選轉化植株。本發明所提供的耐低溫的轉基因植物的方法，是將上述與植物冷誘導相關蛋白的編碼基因CbCINPl導入植物中，得到耐低溫的轉基因植物。本發明將CbCINPl基因的cDNA構建在CaMV35s啟動子下遊，得到表達載體(其圖譜如圖4所示)，利用電擊轉化的方法即得到含有該表達載體的農桿菌菌株，利用花序浸染的方法轉染野生型擬南芥得到過表達的轉基因植株。所述植物可為雙子葉植物，如擬南芥。
本發明驗證了轉基因植株的耐低溫，結果顯示(圖5)，CbCINPl過表達的轉基因擬南芥(撕-ひ67}^7)在零下4度的離子滲透率遠低於野生型，說明由於CbCINPl蛋白的過表達降低了植物細胞受到低溫的損傷，即CbCINPl蛋白的過表達可以增強植物的抗凍性。這對於培養優良的作物品種特別是抗凍的作物品種具有重要的理論及實踐意義。本發明還通過基因改造技術研究了轉基因植株中冷誘導蛋白CbCINPl的亞細胞定位。'塔CbCINPl基因的cDNA構建在CaMV35s啟動子和綠色螢光蛋白GFP的下遊，得融合GFP的表達載體(其圖譜如圖6所示)，通過PEG轉化擬南芥原生質體，在雷射共聚焦顯微 鏡下觀察CbCINPl蛋白的亞細胞定位。結果顯示(圖7)，發現該基因所編碼的蛋白主要定位於細胞核和細胞質膜上。


圖I高山離子芥基因核苷酸序列在NCBI同源性比對，利用MEGA軟體分析的進化關係。圖2高山離子芥CbCINPl蛋白的胺基酸序列在NCBI同源性比對，利用MEGA軟體分析的進化關係。圖3高山離子芥在零下4度不同低溫處理時間的表達量變化。圖4構建的過表達載體圖譜，圖5對照和轉基因植株抗凍性的比較。圖6構建的融合GFP的表達載體， WCA3-CbCINPl。圖7 CbCINPl蛋白的亞細胞定位。
具體實施例方式在本發明的下述實施例中，所用的實驗材料為高山離子芥(Chrispora bungeana)(西部地區特色植物種質資源數據平臺)和擬南芥(Arabidopsis thaliana, Col-O)(Arabidopsis Biological Resource Center, Stock No. CS28166)。實施例I
高山離子芥冷誘導蛋白編碼基因CbCINPl序列的克隆
利用RNA提取分離試劑(Trizol, Invitrogen)分離高山離子芥愈傷組織總RNA,其具體方法是收集高山離子芥愈傷組織lOOmg，立即置於液氮中研磨成粉末，之後加入ImlTrizol試劑,充分混勻，吸入到ー個I. 5ml的離心管中；室溫放置5min ;加入0. 2ml新鮮氯仿，劇烈振搖15s，室溫靜置3min ;4°C，12000g離心15min ;上清水相轉移到一個新的I. 5ml離心管中，加入0. 5ml異丙醇混勻，40C，12000g離心IOmin沉澱RNA ；RNA沉澱用Iml 75%こ醇洗滌後溶於適量DEPC處理過的水中，_70°C保存備用。根據抑制性消減雜交技術、基因晶片技木、Race技術獲取該基因全長序列，然後利用生物信息學技術，設計以下引物
5』端引物GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGCCAGCAACGGATTTTCAG,(其中劃線序列為Invitrogen Gateway 系統 attBl 序列)；
3』端引物
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTTAAAGAGAATCAAGACTCTCTG,(其中劃線序列Invitrogen Gateway 系統 attB2 序列)。通過RT-PCR擴增得到CbCINPl的cDNA序列，具體方法是依據市售試劑盒PlantRT-PCR Kit 2. 01 ( TaKaRa, Japan)的用戶手冊進行。1-2 u g 總 RNA(大約 1-2 U I)和Kit 的各種反轉錄試劑混合(MgCl2 4u I ；10XRNA PCR Buffer 2u I ；RNase Inhibitor 0. 5 u I ；RNase free Water 8. 5 U I ； dNTP Mixture 2 U I ； Reverse Transcriptase Iul ；01igodT-Adaptor I u I)。混勻後，42 °C 30 min ；99°C 5min ；5°C 5min,完成反轉錄反應。吸取2 ill反轉錄產物，作為模板進行PCR反應94°C 2min後進入擴增程序94°C lmin、57°C30min、72°C I. 5min, 30個循環後，72°C 7min。擴增得到的cDNA序列自起始密 碼子到終止密碼子總長1176個鹼基，編碼391個胺基酸，根據the 1997 IUPAC standardatomic weights, assuming pH = 7. 0 計算分子量為 44. 567kD,根據 ExPASy's ComputePI/Mw program計算等電點為7. 73。本發明中的CbCINPl基因和同源性關係最近的基因AT1G18740 (擬南芥的未知功能的基因)具有87%的同源性(如圖1)，其編碼的蛋白質與同源性關係最近的蛋白質(擬南芥未知功能蛋白DUF677)具有90%的同源性(如圖2)。實施例2
高山離子芥冷誘導基因ぬ的鑑定。通過生物信息學的方法進行序列分析，設計Real-time PCR的引物序列。基因。上遊弓I 物AACCACAATAATCAGAATCAC。下遊引物CTAAGTTGCTCGCTAAGG。內參基因CbACTIN。上遊引物GGATGCTTACGITGGTGACGA。下遊引物TCTCCATGTCATCCCAGTTGC。在零下4度處理離子芥的愈傷組織，分別在0，1，3，6，12，24，48，72小時，收集材料，提取RNA進行反轉錄成cDNA (方法同實施例1)，按照市售iQ SYBR Green Supermix(Bio-Rad)試劑盒的說明預混反應試劑(I ii I cDNA模版，10 y I Supermix,濃度為10 y M的上、下遊引物各Iu 1，7 Ul去離子水)。PCR反應程序94°C預變性2min後進入擴增程序94 0C 30s, 57 0C 10s、72°C 20s 40個循環，後進入溶解程序由60°C升到95 °C，每個溫度保溫10s。根據得到的Ct值,利用Pfaffl method (Pfaffl, 2001)來計算在-4°C不同的處理時間CbCINPl基因表達量的變化，結果見圖5，由圖可知，在低溫下CbCINPl基因被大量誘導，在6小時達到高峰，為對照的7倍之多，在48小時後恢復到接近正常水平。證明了該基因能快速響應低溫脅迫，是ー種冷誘導的基因。實施例3
轉CbCINPl基因植株的培育及抗凍性的測定。離子芥CbCINPl基因植物過表達載體的構建將測序驗證過的實施例I得到的片段通過BP反應重組到pDONR/Zeocin載體，轉化大腸桿菌DH5a感受態細胞中，經20 mg /L的Zeocin篩選獲得入門克隆，之後提取質粒再通過LR反應將CbCINPl基因重組到PMDC32載體上，轉化大腸桿菌DH5 a感受態細胞中，經50 mg/L卡那黴素篩選得成功重組的過表達載體(如圖 3)。農桿菌介導的轉化將構建好的過表達質粒通過電擊的方式(電壓2400V，電容25 u F，阻抗200 Q，電擊杯Imm)轉化農桿菌GV3101，用10mg/l利福平+50mg/l卡那黴素的LB平板篩選陽性克隆，將擬南芥的花序浸染PMDC32-fi^7M^成功轉化的農桿菌，獲得轉基因CbCINPl的擬南芥備選植株。轉基因株系的篩選自轉基因擬南芥備選株系收穫的種子，經表面消毒後，種在含有50mg/l潮黴素的MS平板上進ー步篩選，經過傳代，半定量PCR驗證，最後得到純合的CbCINPl過表達的擬南芥T2代株系iOE-CbCINPl \細胞膜的選擇透性是維持細胞生理功能的最重要的條件之一，低溫凍害會造成細胞膜的機械損傷和膜脂過氧化作用，從而增大細胞膜的通透性。細胞質膜透性的測定常作為植物抗逆研究中的ー個重要生理指標。當質膜的選擇透性因逆境傷害而明顯改變或喪失時，細胞內的物質(尤其是電解質)大量外滲，從而引起組織浸泡液的電導率發生變化，通過測定外滲液電導率的變化，就可反映出質膜的傷害程度和所測材料抗逆性的大小。Dexter (1930)首先用電導法測定了植物的抗凍性，經過不斷地改進和完善，目前已得到廣泛應用。研究顯示，將基因轉入植株中，如果該植株細胞在低溫下的滲透性降低，說明該植株細胞受到的低溫損害小，其抗凍性得到增強，可以證明該基因與植物的抗凍性有關，是ー種冷誘導的抗凍基因。轉基因CbCINPl的擬南芥抗凍性測定將萌發之後14天的CbCINPl過表達轉基因擬南芥(OE-CbCINPl)和野生型擬南芥(WT )同時放入-4 V培養箱，分別在3，6，12，24，48小時取出轉基因和野生型擬南芥各5株(5個平行重複試驗)，4°C恢復6小時，之後各剪取6片葉子，去離子水衝洗乾淨，用潔淨濾紙將葉表面的水分輕輕吸乾，放入裝有25ml去離子水的試管中，室溫振蕩過夜(16小時)，測定電導率Cl，之後將含有葉片的試管高壓滅菌，冷卻到室溫之後再次測定溶液的電導率得C2。離子滲透率=C1/C2X 100%。由圖5可知，CbCINPl過表達的轉基因擬南芥(見-ひ67^2)在零下4度的離子滲透率遠低於野生型，說明由於CbCINPl蛋白的過表達降低了植物細胞受到低溫的損傷，即CbCINPl蛋白的過表達可以增強植物的抗凍性。這對於培養優良的作物品種特別是抗凍的作物品種具有重要的理論及實踐意義。實施例4
CbCINPl基因的亞細胞定位
離子芥CINPl基因融合綠色螢光蛋白GFP表達載體的構建將測序驗證過的實施例I得到的片段通過BP反應重組到pDONR/Zeocin載體，轉化大腸桿菌DH5 a感受態細胞中，經20 mg/1的Zeocin篩選獲得入門克隆，之後提取質粒再通過LR反應將CbCINPl基因重組到PMDC43載體上，轉化大腸桿菌DH5 a感受態細胞中，經50 mg/L卡那黴素篩選得成功重組的過表達載體(如圖6 )。 擬南芥原生質體的製備嚴格按照Yoo等2007年在Nature Protocal上報導的方法，簡要的說，即剪取萌發之後4周大的擬南芥葉片10-15片，切成寬度約為0. 5-lmm的條狀，至於 IOml 酶液[20 mM MES (pH 5.7) I. 5% (wt/vol)纖維素酶 RIO, 0. 4% (wt/vol)離析酶R10，0. 4M甘露醇，20mM氯化鉀，IOmM氯化鈣，0. 1% (wt/vol) BSA]裡消化5_12小時，加入等體積的 W5[2mM MES (pH 5. 7), 154mMNaCl, 125mM CaCl2, 5mM KCl.]，用 75 y m 的濾網過濾除去未被消化的葉片，室溫IOOg離心I分鐘，棄上清，加入W5使細胞濃度為2X105cell/ml，冰上沉降 30 分鐘，小心吸取上清，用 MMG[ 4 mM MES (pH 5.7),0.4 M mannitol,15mM MgCl2]溶液重懸使細胞濃度為2X IO5 cel 1/ml，備用。
原生質體的轉化取10 ill構建好的質粒(10_20 ii g )，加入到2ml離心管中，加入100 ill製備好的原生質體，輕柔混勻，然後加入110 ill 40%的PEG溶液[(40% (wt/vol) PEG4000,0. 2 M mannitol 和 100 mM CaCl2]，混勻，靜置 15 分鐘。加入440 u I溶液W5,混勻，IOOg離心2分鐘，棄上清，用Iml溶液WI [4 mM MES (pH 5. 7),0. 5 Mmannitol, 20 mM KCl.]重懸，20°C孵育16小時後用雷射共聚焦顯微鏡觀察。由圖7可知，CbCINPl蛋白定位在細胞核和細胞質膜上。推測其可能有助於增加質膜的穩定性，降低低溫對細胞的傷害。
權利要求
1.一種提高植物抗凍性的基因ぬCVM7ム其特徵在於其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所/Jn o
2.根據權利要求I所述的基因在用於轉基因植物育種中的用途。
3.含有權利要求I所述基因的表達載體、細胞系及宿主菌。
4.ー種培育耐低溫的轉基因植物的方法，是將權利要求I所述的編碼基因轉入植物中，得到耐低溫的轉基因植物。
5.根據權利要求4所述的方法，其特徵在於權利要求I所述的編碼基因是通過權利要求3所述的重組表達載體導入植物中。
6.根據權利要求5所述的方法，其特徵在於所述植物為雙子葉植物。
7.根據權利要求6所述的方法，其特徵在於所述植物為擬南芥。
8.一種由權利要求I所述的基因編碼的蛋白質CbCINPl，其特徵在於其核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示。
9.根據權利要求8所述的基因CbCINPl編碼的蛋白質，其特徵在於'CbCINPl基因轉入植物中，編碼出的CbCINPl蛋白定位在植物的細胞核和細胞質膜上。
10.根據權利要求9所述的基因ぬ編碼的蛋白質，其特徵在於所述植物為擬南芥。
全文摘要
本發明提供了一種冰緣植物冷誘導蛋白CbCINP1，它具有SEQIDNO:2所示的胺基酸序列。本發明還提供了一種編碼該冰緣植物冷誘導蛋白的基因CbCINP1，它具有SEQIDNO:1所示的鹼基序列。本發明的冰緣植物冷誘導蛋白的編碼基因可用於轉化植物以產生具有抗寒特性的轉基因植物。
文檔編號A01H5/00GK102643828SQ201210030208
公開日2012年8月22日 申請日期2012年2月10日 優先權日2012年2月10日
發明者安黎哲, 嶽修樂 申請人:蘭州大學