極端嗜鹽菌的培養配方及工藝的製作方法

2023-06-01 11:44:51 2

極端嗜鹽菌的培養配方及工藝的製作方法
【專利摘要】本發明為極端嗜鹽菌的培養配方及工藝，極端嗜鹽菌是提取「紫膜」的原料，從鹽湖中提取似大海撈針，用蛋白腖、牛肉膏培養，成本價高，極端嗜鹽菌生長需要營養複雜，本發現提供了廉價的風化煤、褐煤、泥碳為主料的培養配方，可以快速高效繁殖極端嗜鹽菌，為提取紫膜提供了方便快捷廉價的原料，降低紫膜成本，讓紫膜能走出試驗室，為修復DNA做貢獻。
【專利說明】極端嗜鹽菌的培養配方及工藝
[0001]所屬領域:生物技術【背景技術】
[0002]嗜鹽菌、Halophiles)是生活在高鹽環境中的古細菌，他生長在鹽湖(中國青海湖、新疆死海、美國大鹽湖)鹽場的濃縮的海水中，一般生活在含鹽10-30%的鹽液中。
[0003]嗜鹽菌可分為三類:一類是提能耐受一定鹽濃度的鹽溶液，但在無鹽環境中生長最佳的一類微生物，稱為耐鹽菌:二類是指在鹽濃度從零點到飽和的環境中均能生長，但其最佳生長需要一定鹽濃度的特殊微生物，稱為廣域嗜鹽菌；三類是指菌體生長需要一定的鹽濃度，且在一定的鹽濃度生長最佳的微生物，這類微生物稱為嗜鹽菌。根據對鹽的不同需要，嗜鹽菌可以分為弱嗜鹽菌、中度嗜鹽菌和極端嗜鹽菌。
[0004]Na+對維持細胞膜，細跑壁的構造有特別重要怍用。阻止嗜鹽菌的溶菌和維持細胞完整性的重要作用。嗜鹽菌的細胞壁以糖蛋白代替傳統的肽聚糖，這種糖蛋白含有天門冬氨酸和穀氨酸，這些酸性胺基酸在蛋白表面形成負電屏蔽，捉進蛋白在高鹽環境中的穩定，當極端嗜鹽菌限制通氣，即低氧壓和厭氧情況下光照培養，極端嗜鹽菌產生紅紫色菌體，這種菌體的細跑膜 上，有紫膜片組織，約佔全膜50%，由25%的脂類和75%的蛋白質組成。由三個BR分子構成的三聚體可在細胞膜上形成一個剛性的二維六邊形的穩定，特徵結構，即紫膜。紫膜中含有菌視蛋白與類胡蘿蔔素類的色素，以1:1結合組成。
[0005]嗜鹽菌的生長需要離鈉環境，但細胞內的鈉濃度並不高，因為它們的光介導的H+質子泵具有Na-K-反向轉運功能，即具有吸收和濃縮鉀向胞外排放Na+的功能。嗜鹽菌是採用細胞膜內積累高濃度的K+對抗胞外高滲環境。隨著培養及食鹽的增加，胺基酸濃度有規律的增加，其中主要為穀氨酸、脯氨酸及甘氨酸，它們具有滲透保護作用。
[0006]極端嗜鹽菌廣泛存在於海水中的曬鹽場，鹽湖，古海洋沉積物等高濃度鹽環境中的一大類極端微生物，其中蘊藏著豐富的極端嗜鹽酶類，特殊脂類，生物表面活性物質，蛋白抗生素(嗜鹽菌紫)生物鈉米材料「紫膜」，和生物可講解塑料前期物PHA等。
[0007]以上這些物質被發現，但由於嗜鹽古細菌獲得是從鹽湖死海中近乎大海撈針，分離和繁殖不是易事，原料的供應，設備的精良、工藝的複雜，紫膜的秘訣，在世界上把紫膜的價格變成「天價」，雖然用途廣泛，但價格昂貴，擋住了研究試驗和使用的去路。
[0008]要生產「紫膜」第一步首先要解決大量的極端嗜鹽菌，不能靠大海撈針的方法，或用蛋白陳、牛肉膏等貴重原料在試驗室去培養繁殖，因為極端嗜鹽菌生長需要營養極複雜，給生產帶來困難。經過反覆試驗發現一種高效繁殖極端嗜鹽菌的配方，可以在短時間內把極端嗜鹽菌繁殖到430億/克的含菌量。(其中一部分是嗜鹽桿菌，不屬於極端嗜鹽菌，但不影響提取紫膜)主要內容，
[0009]極端嗜鹽菌的培養配方及工藝
[0010]1、將300克湖鹽、3克K2O, 30克黃豆粉，100克極端嗜鹽菌〈用常規方法從含30%的鹽湖水中分離出來的極端嗜鹽菌濃度0.2億/克以上)，放入600克無菌水中溶器中攪勻；[0011]2、將1000克荷選粉碎過100目過篩的風化煤粉放入配好的1033克物料的溶器中攪勻；
[0012]3、將2033克配好的物料放入培養箱中，加溫25° -35° °C，溼度75° -85° °C，用日光燈波長550-600nm，照射(時間和牆養時間相同)；
[0013]4、培養箱自然供氧培養七天後，用低氧壓或厭氧環境培養14天，待極端嗜鹽菌發紫紅色時培養即可結束(經檢測極端嗜鹽菌在430億/克以上)；
[0014]荻得的極端嗜鹽菌因為含量極高，可以用來提取紫膜，可以降低紫膜培養料成本；
[0015]5、風化煤、褐煤含腐植酸40%以上，泥碳含腐植酸21%以上為宜。
實施例:
[0016]極端嗜鹽菌的培養配方及工藝
[0017]1、將300克湖鹽、3克K2O, 30克黃豆粉，100克極端嗜鹽菌(用常規方法從含30%的鹽湖水中分離出來的極端嗜鹽菌濃度0.2億/克以上)，放入600克無菌水中溶器中攪勻:
[0018]2、將1000克精選粉碎過100目過篩的風化煤粉放入配好的1033克物料的溶器中攪勻；
[0019]3、將2033克配好的物料放入培養箱中，加溫25° -35° °C，溼度75° -85° °C，用日光燈波長550-600nm,照射(時間和培養時間相同)；
[0020]4、培養箱自然供氧培養七天後，用低氧壓或厭氧環境培養14天，待極端嗜鹽菌發紫紅色時培養即可結束(經檢測極端嗜鹽菌在430億/克以上)；
[0021]獲得的極端嗜鹽菌因為含量極高，可以用來提取紫膜，可以降低紫膜培養料成本；
[0022]5、風化煤、褐煤含腐植酸40%以上，泥碳含腐植酸21%以上為宜。
[0023]嗜鹽菌的分離
[0024]了解嗜鹽菌在實驗室中的培養方法和高產細菌視紫質(Bacteriorhodopsin, BR)的培養條件以及菌種保藏等常規工作。
[0025]二、原理
[0026]嗜鹽菌在系統發生上與甲燒細菌(methanobacteria)、熱酸菌(thermoacidophilic bacteria)均屬於古細菌類(archaebaeteria),這種只有在極高鹽濃度介質中才能生長的細菌在分類學上屬於鹽桿菌科(Halobacteriaceae)。已經知道，此科下有兩個屬:一個屬為鹽桿菌屬(Halobacterium),如鹽製品鹽桿菌(H.salinarium)鹽生鹽桿菌(H.ha1bium);另一個屬為鹽球菌屬(Halococcus),如鰭鹽球菌(H.morrhuae)。鹽桿菌科的細菌有機體具有古細菌類特徵的核糖體(如16SrRNA);不具有一般細菌所具有的那種細胞壁(如細胞壁上不含有一般細菌細胞壁所具有的肽聚糖等典型組分，而是由糖蛋白組成)；有極端嗜鹽的原核細胞，僅能在大於2mol/L的NaCl中才能正常生長；它們的酵系也僅在高鹽的介質中才具有正常活性；它們的蛋白質含有較多的酸性胺基酸殘基等。
[0027]這一科的生物大都是蛋白水解型的，屬於異養成的需氧呼吸代謝類型。當它們從自然界中分離出來時，都包含有C-50類胡蘿蔔素，但在自然界中以及在人工培養條件下，均會遇到無色素的菌體。另外，有許多菌株還含有視黃醛(Retinal)類色素，即細菌視紫質。但BR是否存在以及它在細胞中的含量，在任何一個菌株中均與生長條件有關，因此它不是分類學上的特徵。
[0028]在20世紀60年代，發現了嗜鹽菌中含BR的膜，即紫膜(為細胞膜的一部分)具有光碟機動的質子泵功能，並導致產生光合磷酸化。此後對這一細菌的研究有了更加廣泛的興趣，相繼開展了有關光能轉換、紫膜結構和功能、對極端環境的調節適應以及探討古細菌進化途徑的因子等等多方面的研究。嗜鹽菌中細菌的細胞壁由糖蛋白組成，在2mol/L NaCl中會完全失去其堅硬性，在低於lmol/L NaCl的介質中，細胞壁破碎並發生溶胞。在經受中等強度的機械壓力時，也能引起溶胞。這些特點是與另一屬鹽球菌屬不同的。它們的細胞壁由堅固的硫酸鹽雜多糖組成，在水中其結構也不會破壞，細胞也不呈通常的棒形。
[0029]鹽桿菌的細胞所要求的生長環境，如介質中離子組分、鹽濃度和PH等，常反映了它們的生態特點，如從高鹼性、高鹽分的沙漠湖中分離到種類都要求高PH、低鎂和高NaCl濃度的介質，而從曬鹽場中分離的則要求中性PH、一般鎂離子濃度和高NaCl濃度的介質。
[0030]嗜鹽菌生長的條件除了 NaCl鹽濃度要大於2mol/L以外，還要求Na+、Mg2+為細胞外介質中的主要陽離子，而在細胞內部這類離子也保持著同樣的強度，但K則是細胞內的主要陽離子。
[0031]本實驗介紹的培養方法主要是以鹽生鹽桿菌作為對象，這是一種從鹽場中分離出來的，目前世界上各實驗室使用最廣泛的嗜鹽菌。
[0032]三、實驗材料
[0033]培養鹽生鹽桿菌最好選用Oxoid或Inolex蛋白腖。有些蛋白腖如美國Bacto-Tryptone (Difco0123_01)或 Bacto-peptone (Difco0118_01)因含有一種能使嗜鹽菌細胞溶胞的物質，故不能使用，有一些蛋白腖在準備培養基過程中會產生少量沉澱，可以在培養基未加熱前用6000g離心30min(20°C )除去，或用0.45um過濾器去除。
[0034]液體培養基由蛋白腖加鹽基介質(即為保持細菌正常生長所要求的離子組分和高滲濃度的介質，常簡稱為BS)組成，這樣的培養基常簡寫為RM。鹽生鹽桿菌RM的化學配方如下:Nacl233.76g/L，MgSO4.7H209.4g/L，NasC6H5O7.2H20 (檸檬酸鈉)3.0g/L, kcl2.0g/L，Oxoid L-37蛋白腖10g/L，調節PH為7.2左右。
[0035]BS即是指上面配方中不含蛋白腖和檸檬酸鈉的溶液。在上述培養基中加入1.5%(質量體積分數)瓊脂後即成固體培養基。121°C，滅菌15~20min。
[0036]四、方法與步驟
[0037]1.液體通氣培養
[0038]細菌可在大體積、透明的玻璃瓶中培養，如20L體積的玻璃瓶，內盛4L培養液，將瓶水平放置，這樣可使培養液有較大的表面接受光照。為了給以充分的光照條件，可以在瓶子的上、下兩個方向各放置。
[0039]4隻20W的日光燈管。雖然照明對色素形成不一定是必需的，但在照明條件下(IO6~106crg/s.cm2)可以使細菌合成最大產率的紫膜。
[0040]用I %處於穩定生長期的菌液來接種。細菌可在高達57°C下生長，但為了防止水分過分蒸發，通常調節生長溫度為38~40°C，為了保證良好的有氧生長條件，瓶中必須通氣，空氣在未進入培養液前先流過蒸餾水，以防止培養液的過分蒸發。培養液中可用噴霧微量抗泡劑以防止泡沫大量形成。在開始生長的36h裡，介質的通氣量可以保持為250L/h，這樣的通氣量在開始生長的6h裡，使4L的培養液達到氧的飽和狀態，然後氧濃度迅速下降到10%的飽和水平。故在36h後，通氣速率可調節到160L/h，這樣的速率使得氧濃度在其後的生長期間保持為低於5%的飽和狀態。在這樣的氧濃度下，細菌能以最高速率合成紫膜。在IlOh生長後，此時細菌已處於穩定生長期約30h，可以收穫。
[0041]細胞的生長情況可用測定在660nm處的濁度米檢查，也可以進行細胞計數。紫膜生長通常在細菌生長的對數期快結束時出現，而且在氧的供應降低時有最大產率。隨著培養條件的變化，紫膜的產率也會有很大差別。某些條件下可以完全不產紫膜。故在實驗室中的不同條件下，需要掌握生長期間的一些參數，如對數生長期的延續時間、穩定生長期的開始時間、介質中氧的接受情況等。
[0042]2.搖瓶培養
[0043]搖瓶培養既可為較大量的液體培養準備接種液，也可用來收集紫膜。搖瓶所盛的液體通常為瓶體積的1/4~1/3。搖床振蕩速率的大小控制著搖瓶內的氧氣飽和程度，從而控制著紫膜的合成速率。如振蕩頻率為100r/min，生長6d，39°C，可以達到最大紫膜產率。而當提高至180r/min時，則菌體有較快的增長速度，但紫膜產率較低。 [0044]3.菌種保藏
[0045]菌種可以在RM固體培養基的瓊脂平板上於4°C下保存6個月至I年。平板必須用石蠟嚴密封好後，在4°C下可保存I~2年。處於對數生長期的液體培養液(在RM基質中)在-10°C下可以保存更長時間。
[0046]4.色素突變菌株的分離
[0047]嗜鹽菌細胞在RM-瓊脂上形成很清晰的菌落，瓊脂平板上可見有大數量的細胞，由它們形成的群體可通過雙簡顯微鏡(4X25)放大進行觀察。根據不同的顏色可以很容易地識別突變菌落。特別是在反射光下，當它們與大量相鄰親緣群體進行互相對照比較時，更易區別。
[0048]在分離時，首先將在RM液體培養中所得到的菌體液在顯微鏡下進行計數，並用BS稀釋成IO4個mL，取0.05~0.1mL均勻塗布於瓊脂平板上，著平板能得到500~1000個群體，則表明這些細胞的接種效率為100%。必須嚴防乾燥，為此可將瓊脂平板保存在密封的塑膠袋中，於39°C下培養。第一次觀察可在培養15d以後，第二次觀察在總共培養了 25d後，空泡的存在將嚴重影響顏色，因為它能將入射光反射回來。在相差顯微鏡下觀察，帶有空泡的單個細胞由於有很強的反射，對比細胞的暗背景顯得很亮。
[0049]突變菌株用在RM-瓊脂平板上反覆劃線的辦法來純化。突變菌株的表現型應加以記錄，並在重新劃線後再觀察檢查。
[0050]色素突變菌株的分離對於選育BR高產菌株是非常重要的。在連續做液體培養的進程中，由於菌種變異等多種原因，BR產率將逐漸減少，因此至少每隔一年需要進行一次高產菌株的分離篩選工作。此外，菌株分離工作還應用於選育除含BR外的其它色素系統的菌體。
【權利要求】
1.將300克湖鹽、3克1(20，30克黃豆粉，100克極端嗜鹽菌(用常規方法從含30%的鹽湖水中分離出來的極端嗜鹽菌濃度0.2億/克以上)，放入600克無菌水中溶器中攪勻。
2.將1000克精選粉碎過100目過篩的風化煤粉放入配好的1033克物料的溶器中攪勻。
3.將2033克配好的物料放入培養箱中，加溫25°-35° °C，溼度75° -85° °C，用日光燈波長550-600nm，照射(時間和培養時間相同)。
4.培養箱自然供氧培養七天後，用低氧壓或厭氧環境培養14天，待極端嗜鹽菌發紫紅色時培養即可結束(經檢測極端嗜鹽菌在430億/克以上)，獲得的極端嗜鹽菌因為含量極高，可以用來提取紫膜，可以降低紫膜培養料成本。
5.風化煤、褐煤含腐植酸40%以上，泥碳含腐植酸21%以上為宜。
【文檔編號】C12R1/01GK104017743SQ201310063225
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2013年2月28日 優先權日:2013年2月28日
【發明者】魏明重 申請人:魏明重