來自金黃色葡萄球菌的多肽和使用方法

2023-06-02 02:47:06 1

專利名稱：來自金黃色葡萄球菌的多肽和使用方法
技術領域：
本發明涉及來自金黃色葡萄球菌的多肽和使用方法。本申請要求享受於2005年2月14日提交的美國臨時申請序列號60/652,843的權益，其內容全部引入本文作為參考。
背景技術：
革蘭氏陽性細菌是顯著多樣化的一類生物，可導致人類和動物多種疾病。一些病原體被公認對人類和/或動物健康是重要的，包括屬於棒狀桿菌科、腸球菌科、微球菌科、分支桿菌科、諾卡菌科和消化球菌科家族的細菌，包括這樣的細菌種類:放線菌屬物種、雙岐桿菌屬物種、棒狀桿菌屬物種、腸球菌屬物種、丹毒絲菌屬物種、真細菌屬物種、皮球菌屬屬物種、乳酸桿菌屬物種、微球菌屬物種、動彎桿菌屬物種、分枝細菌屬物種、消化鏈球菌屬物種、丙酸桿菌屬物種和葡萄球菌屬物種。這些病原體在許多不同的動某種類中導致多種臨床症狀。這樣感染的治療在歷史上是攻擊革蘭氏陽性生物體共同結構和功能的抗生素。但是，許多更加普遍存在的革蘭氏陽性生物體發展了對幾類抗生素的抗性，使感染的治療困難。對人類和食物生產動物廣泛使用抗生素治療細菌疾病，可能是許多對抗生素有抗性的革蘭氏陽性生物體菌株種類增生的主要原因。因此，對發現不同的預防或消除動物和人類革蘭氏陽性生物體感染的治療方法有巨大的需求。在農業動物中的葡萄球菌感染在農業產業中許多重要的疾病是革蘭氏陽性生物體導致的。革蘭氏陽性細菌感染導致的臨床病症實例包括乳房炎、敗血病、肺炎、骨髓炎、腦膜腦炎、淋巴管炎、皮炎、生殖道感染、子宮炎、圍產期疾病、垂體膿腫、關節炎、粘液囊炎、睪丸炎、膀胱炎和腎盂腎炎、乾酪性壞死淋巴腺炎、肺結核，潰瘍性淋巴管炎、丹毒、蹄葉炎、tyzzer疾病、破傷風、波特淋菌中毒、腸炎、惡性腫脹、羊炭疽、桿菌性血紅蛋白尿、腸原性毒血症。葡萄球菌屬物種特別能夠感染許多不同種類的農業動物，並能導致大量經濟損失。例如，美國牛奶產業估計每頭奶牛每年由於乳房炎損失約185美元，乳房炎經常是金黃色葡萄球菌導致的疾病。因為在美國有9百50萬頭產奶奶牛，乳房炎每年的代價大約為約18億美元。這大約是農場牛奶銷售額總價值的10%，這個損失的三分之二是由於減少了亞臨床感染奶牛的牛奶產量而引起的。其它損失是由於棄去異常牛奶和用抗生素治療的奶牛產奶受到抑制所致，感染奶牛被提早更換的費用，精選奶牛減少銷售價值，藥物和獸醫服務費用，和增加的勞動力費用。除了在牛奶產業盛行以外，革蘭氏陽性球菌導致的乳房炎在山羊和綿羊中也常見。金黃色葡萄球菌導致的另外的動物疾病包括馬的葡萄狀菌病，家禽的化膿性滑膜炎和骨髓炎，兔子的鼻塞，豬的流產，和羊羔的扁蝨膿毒症。葡萄球菌的其它種類是犬(S.1ntermedius)和豬(S.hycius)的主要皮膚病原體。在家禽種類中，葡萄球菌病原體導致心內膜炎和敗血病。
人類葡萄球菌感染葡萄球菌屬也是人類的病原體，導致各種各樣的感染。種類金黃色葡萄球菌是人類黏膜和皮膚的常見建群者，是能夠導致多種人類感染的條件性病原體。例如，金黃色葡萄球菌是幾種皮膚感染的病因性媒介，包括膿皰病、癤病、蜂窩織炎(cellulitis)、和燙傷皮膚症候群以及潛在致命的手術後傷口感染。此外，免疫減弱的個體在醫院環境下暴露於金黃色葡萄球菌可導致器官感染例如肺炎、尿路感染、骨髓炎、關節炎、菌血症和心內膜炎。金黃色葡萄球菌還是中毒症、最著名的中毒休克症候群和食物中毒的病因性媒介。葡萄球菌腸毒素B導致的食物中毒是食物致疾病的最常見原因，甚至超過沙門氏菌病、彎曲菌病和利斯特菌病。其它種類的葡萄球菌也導致人類疾病；表皮葡萄球菌、凝固酶陰性葡萄球菌和人肉孢子蟲通常感染建群醫療器械，腐生葡萄球菌與婦女尿路感染有關。葡萄球菌的毒性機制葡萄球菌感染多種宿主組織，通過以下方式躲避免疫系統:產生幾種類型分泌蛋白、表面表達毒性因子，和代謝系統被設計為在有限資源中生存，和宿主環境相關的活性防禦。建群是建立感染的必需的第一個步驟；許多因子包括被膜、脂磷壁質酸和磷壁酸是幫助建群的常見結構的成分。此外，表面蛋白例如葡萄球菌纖維連接蛋白結合蛋白和骨唾液酸糖蛋白結合蛋白特異性與宿 主組織成分結合。葡萄球菌病原體通常產生毒素，並是高度破壞性的；幾種人類疾病包括食物中毒、中毒休克症候群和表皮脫落皮膚病症是細胞外分泌毒素蛋白的直接結果。單個分離菌可以編碼20-30個不同的分泌毒素的基因。一些分泌的蛋白產物是超級抗原，能非特異性地與抗原-產生細胞的MHC類II分子結合，同時與T細胞的T-細胞受體結合。結合誘導T細胞信號，導致高水平前炎症因子的釋放，最終誘導宿主由於不可抵抗的免疫響應的損傷。另一類在表面表達的毒性因子偽裝來自宿主免疫系統的細菌。例如，金黃色葡萄球菌表面-表達的蛋白A通過與宿主抗體Fe成分結合抑制調理素作用和噬菌作用。許多蛋白酶、溶血素(α、β、Υ和δ)、核酸酶、脂肪酶、透明質酸酶和膠原質還幫助細菌從環境細胞提取營養素，保護它們對抗宿主的防禦。在葡萄球菌中抗生素抗性⑶C估計在美國每年有接近二百萬人受到醫院源性感染，每年導致90，000例死亡。在這些致命感染中70%是由抗生素-抗性細菌導致的。在微生某種類中抗生素-抗性的增加在皮膚和黏膜建群者例如金黃色葡萄球菌中特別明顯。例如，絕大部分從醫院環境分離的金黃色葡萄球菌是對青黴素抗性的，50%還對半合成青黴素類例如二甲氧基苯青黴素、萘夫西林和苯唑西林有抗性。這些分離菌，被稱作MRSA (二甲氧基苯青黴素抗性金黃色葡萄球菌)在1970年代第一次被發現，現在在醫院環境中已經明確地確立。最近出現幾例在社區的MRSA感染，其中被感染的個體以前沒有暴露於醫院或健康護理工作者。這個令人擔憂的趨勢通過MRSA分離菌的分離被強化，該分離菌對用於治療MRSA的糖肽萬古黴素敏感性差。按照CDC對萬古黴素抗性的定義非常少的菌株曾表現出對萬古黴素真正的抗性，但是幾種MRSA菌株曾被鑑定為包含對萬古黴素敏感性降低的亞群落，或VISA (萬古黴素中間體金黃色葡萄球菌)。因為將萬古黴素抗性菌株和萬古黴素中間體菌株分離是相對新的進展，只有很少關於它們在醫院和/或社區流行性的數據。偶爾地，對萬古黴素具有完全抗性的和帶有可能從腸球菌某種獲得的抗性質粒的VRSA (萬古黴素抗性金黃色葡萄球菌)也曾從人體中找到。
預防和治療葡萄球菌屬感染的策略許多對多種抗生素抗性的革蘭氏陽性病原體的出現激發了旨在發展預防性疫苗以對抗疾病研究的努力。設計施用給患者的疫苗是為了引起免疫系統長期記憶效應，以致在未來時間遭遇到該病原體時，免疫系統能更快速和更有效地清除該病原體。目前，對抗革蘭氏陽性病原體的具有廣泛保護作用的疫苗還沒有得到，所述革蘭氏陽性病原體是與許多嚴重的人類疾病相關的，特別是與葡萄球菌感染的那些疾病相關的。發展預防葡萄球菌感染疫苗的方法包括報導使用微生物表面成分識別粘連基質分子的那些:[MSCRAMMS(Nilsson 等 1998.JClin InvestlOl:2640-9 ；Menzies 等 2002.J InfectDisl85:937-43 ；Fattom 等 2004.Vaccine22:880-7]，表面多糖類(McKenney 等 2000 ；McKenney 等 1999.Science284: 1523-7 ；Maira-Litran 等 2002.1nfect Tmmun70:4433-40 ；Maira-Litran 等 2004.Vaccine22:872-9 ；Maira-Litran 等 2005.1nfect Immun73:6752-62)和突變的外蛋白(Lowerell 等 1996.1nfect Tmmun64:4686-93 ；Stiles 等 2001.1nfect TmmunBQ:2031-6 ;Gampfer 等 2002.Vaccine20:3675-84),在亞單位疫苗組合物中作為抗原，以及活的無毒菌株(Reinoso等2002.Can J Vet Res66:285-8)，和幾種DNA疫苗方法(Ohwada 等 1999.J Antimicrob Chemother44:767-74) ；Brouillette 等 2002.Vaccine20:2348-57 ；Senna 等 2003.Vaccine21:2661-6)。儘管這些組合物中許多表現出一些程度保護作用，它們對抗不同葡萄球菌菌株的交叉-保護作用很小，在免疫減弱患者中不會引起另外的實質性免疫響應，這對於處於醫院源性感染危險的人群是重要的。最嚴重的葡萄球菌疾病是通過前述超級抗原致熱外毒素(SPE)介導的那些，其不依賴抗原表達非特異性地刺激T-細胞。這樣的疾病包括中毒休克症候群、表皮脫落性皮膚疾病和可能的Kawasaki症候群。對於這些SPE-介導的疾病，在活性感染期間促進免疫系統的免疫治療劑通常比疫苗更有效，而疫苗典型地在感染之前施用。對SPE免疫響應的不可抵抗性質使得將快速減小毒素活性作為第一治療目標成為必要。目前，在金黃色葡萄球菌-介導的疾病中毒素中和是通過靜脈內施用人類免疫球蛋白(IVIG)來最有效完成的，其是來源於幾千人類提供者的純化濃縮的人類抗體製劑(Takei等1993.J Clin Invest91:602-7 ；Stohl 和 Elliot.1996.Clin Tmmunol Immunopatho179:122-33)。金黃色葡萄球菌分布廣泛，健康人類成人 約30 %有建群，與大多數人群高暴露率是一致的，所以在IVIG中抗-葡萄球菌抗-毒素抗體水平常常足以中和毒素足夠的長時間以穩定免疫響應，直至細菌負載用抗生素減小(Schlievert, 2001.J Allergy Clin Immunol 108 (4Sup P I):S107-110)。來自多個生產者的IVIG製劑已經表明用人類外周血單核細胞在增生分析中中和毒素，體外抑制毒素-誘導的人類T細胞-驅動的B細胞分化(Stohl和Elliot.1996.Clin Tmmunol Immunopathol79:122-33 ;Stohl 和 Elliott.1995.J Immunol 155:1838-50 ;Stohl等1994.J Immunol 153:117-27)，和在用葡萄球菌腸毒素B刺激的PBMC中減小IL-4和 IL-2 分泌(Takei 等 1993.J Clin Invest91:602-7 ；Darenberg 等 2004.Clin InfectDis38:836-42)。證明中和SPE能力的IVIG治療現在是Kawasaki症候群的推薦療法，作為葡萄球菌中毒休克症候群治療方法越來越受到歡迎(Schlievert2001.JAllergy ClinImmunoll08(4Suppl):S107_110)。使用IVIG作為外科手術期間免疫保護的傷口灌洗已經在小鼠中進行了研究(Poelstra等2000.Tissue Eng6 (4) =401-411) 儘管標準IVIG已經用於限制一些葡萄球菌SPE-介導疾病的發展，從成千上萬未經選擇的人類給體中得到的IVIG製劑的安全性、效力和一致性還存在爭議(Baker等1992.N Engl J Med327:213-9 ;Miller 等 2001.J Allergy Clin Tmmunol 108:S91-4 ；Sacher, 2001.J Allergy ClinImmunol 108:S139_46 ；Darenberg 等 2004.Clin Infect Dis38:836-42)。而且，IVIG 在預防一些葡萄球菌感染中的益處是可疑的(Baker等1992.N Engl J Med327:213-9 ；Hill,H.R.2000.J Pediatrl37:595-7 ；Darenberg 等 2004.Clin Infect Dis38:836-42)。為了提高IVIG在某些危險人群中治療葡萄球菌感染的效果，製備了來源於血漿的給體選擇的多克隆抗-葡萄球菌人類IgG，具有指向葡萄球菌MSCRAMMS聚集因子A(ClfA)和纖維蛋白原-結合蛋白G(SdrG)的高抗體滴定度，在非常低出生體重的嬰兒中成功實驗預防葡萄球菌胺毒症(Vernachio 等 2003.Antimicrob Agents Chemother47:3400-6 ；Bloom等 2005.Pediatr Infect Dis J24:858-866 ；Capparelli 等 2005.Antimicrob AgentsChemother49:4121-7)。也開發了指向金黃色葡萄球菌MSCRAMM聚集因子A的特異性人化單克隆抗體。該抗體選自成千上萬鼠科動物具有與ClfA結合能力的抗-ClfA抗體，其結合方式廢除了金黃色葡萄球菌與人纖連蛋白的結合，隨後通過突變特定的靶標殘基人化以模擬同源人類幼體亞組抗體(Hall 等 2003.1nfect Tmmun71:6864-70 ；Domanski 等 2005.1nfect Immun73:5229-32)。特定抗體被設計用於與抗生素結合以治療嚴重的致命性金黃色葡萄球菌感染，儘管動物研究還證明有預防性保護作用。

發明內容
本發明提供包括兩個或多個分離多肽的組合物。兩個分離的多肽可以具有88kDa、55kDa、38kDa、37kDa、36kDa、35kDa、33kDa或其組合的分子量。例如，組合物可以包括88kDa和55kDa的分離蛋白。在一些方面組合物可以包括具有分子量88kDa、55kDa、38kDa、37kDa、36kDa、35kDa和33kDa的分離多肽。分子量通過在十二烷基硫酸鈉_聚丙烯基醯胺凝膠上的電泳確定。多肽是可從當在包含鐵螯合劑介質中培養時的金黃色葡萄球菌中分離出來的，並且不能從當在不含鐵螯合劑的介質中生長時的金黃色葡萄球菌中分離出來。組合物保護動物，例如小鼠或奶牛或人類，對抗用金黃色葡萄球菌菌株例如ATCC菌株19636的激發。組合物可以進一步包括可藥用載體，和可以進一步包括具有150kDa、132kDa、120kDa、75kDa、58kDa、50kDa、 44kDa、43kDa、41kDa、40kDa或其組合的分子量的分離多肽，並且可從當在不含鐵螯合劑的介質中生長時的金黃色葡萄球菌中分離出來的。在一些方面，組合物的多肽可以從金黃色葡萄球菌ATCC菌株19636中分離。本發明還提供使用組合物的方法。在一方面該方法用於治療患者的感染，包括施用有效量的本發明組合物給患有或處於患有葡萄球菌屬物種導致的感染危險的患者。在另一方面，該方法用於治療患者的症狀，包括施用有效量的本發明組合物給患有葡萄球菌屬導致的感染的患者。患者可以為哺乳動物，例如人類、馬或奶牛。葡萄球菌屬物種可以為金黃色葡萄球菌。本發明進一步提供使用抗體例如多克隆抗體的方法，其特異性地與本發明多肽結合。在一方面，該方法用於治療患者的感染，包括給患有或有危險患有葡萄球菌屬物種導致感染的患者施用有效量的組合物，其中組合物包括特異性地與本發明兩個分離的多肽結合的抗體。在另一方面，該方法用於治療患者的症狀，包括給患有由葡萄球菌屬導致的感染的患者施用有效量的組合物，其中組合物包括特異性地與本發明兩個分離的多肽結合的抗體。患者可以為哺乳動物，例如人類、馬或奶牛。葡萄球菌屬物種可以為金黃色葡萄球菌。本發明還提供在患者中減少建群的方法。在一方面，該方法包括施用有效量的本發明組合物給被葡萄球菌屬物種建群的患者。在另一方面，該方法包括施用有效量的組合物給被葡萄球菌屬物種建群的患者。其中組合物包括與本發明兩個分離的多肽特異性結合的抗體。本發明提供檢測與多肽特異性結合的抗體的試劑盒。該試劑盒包括在分離的容器中本發明的分離多肽，和檢測與多肽特異性結合抗體的試劑。本發明進一步提供組合物，包括具有分子量選自88kDa、55kDa、38kDa、37kDa、36kDa、35kDa和33kDa的兩個分離的多肽，其中分子量通過在十二烷硫酸鈉-聚丙烯基醯胺凝膠上的電泳確定。組合物的每個多肽具有的質量指紋圖譜至少80%類似於金黃色葡萄球菌ATCC菌株19636表達的相同分子量多肽的多肽質量指紋圖譜，其中多肽是從當在包含鐵螯合劑介質中培養時的金黃色葡萄球菌中可分離出來的，並且當在不含鐵螯合劑的介質生長時不可分離出來的。例如，分子量88kDa分離多肽的質量指紋圖譜有至少80%與金黃色葡萄球菌ATCC菌株19636表達的88kDa多肽質量指紋圖譜類似，分子量55kDa分離多肽的質量指紋圖譜有至少80%與金黃色葡萄球菌ATCC菌株19636表達的55kDa多肽質量指紋圖譜類似。


圖1.從在有鐵和沒有鐵下生長的不同種類得到的不同菌株金黃色葡萄球菌的蛋白的毛細管電泳譜(泳道分別表示Fe++和DP)。圖2.在用金黃色葡萄球菌同源和異源激發後免疫接種小鼠和未免疫接種小鼠之間死亡率的差異。圖3.在接種疫苗和用金黃色葡萄球菌ATCC19636同源激發後表現百分生存率的Kaplan-Meier 生存曲線。圖4.在接種疫苗和用金黃色葡萄球菌ATCC19636異源激發後表現百分生存率的Kaplan-Meier 生存曲線。圖5.在被動免疫和用金黃色葡萄球菌ATCC19636同源激發後表現百分生存率的Kaplan-Meier 生存曲線。圖6.在被動免疫和用金黃色葡萄球菌菌株1477異源激發後表現百分生存率的Kaplan-Meier 生存曲線。
具體實施例方式本發明提供多肽和包含多肽的組合物。本文中所用的「多肽」意指通過肽鍵連接的胺基酸聚合物。因此例如術 語肽、寡肽、蛋白和酶包括多肽定義之內。該術語還包括多肽表達後的修飾，例如糖基化、乙醯化、磷酸化等等。術語多肽不意味著特定長度的胺基酸聚合物。多肽可以直接從天然來源分離出來，或可以用重組、酶或化學技術製備。在天然出現的多肽的情況下，這樣的多肽典型地是分離的。「分離的」多肽是指將其從天然環境中移出。例如，分離的多肽是指從細胞質或從細胞膜中移出的多肽，許多在其天然環境中的多肽、核酸和其它細胞材料不再存在。「可分離出來的」多肽是指能從特定來源中分離的多肽。「純化的」多肽是指從其天然相關的其它成分中至少60%游離，優選至少75%游離，最優選至少90 %游離的多肽。在其天然發生的生物體外邊產生的多肽，例如，通過化學的或重組方法，考慮被分離和按照定義被純化，因為它們從來不存在於天然環境中。本文中所用的「多肽片段」意指部分多肽，用蛋白酶消化多肽而得到。除非另外指明，「一種」、和「至少一種」可以交換使用，含義為一種或超過一種。當這些術語出現在說明書和權利要求中時，術語「包含」和其變種沒有限制的含義。本發明的多肽可以通過分子量、質量指紋圖譜或其組合表徵。多肽的分子量典型地以千道爾頓(kDa)表示，可以使用常規方法確定，包括例如凝膠過濾、包括十二烷基硫酸鈉(SDS)聚丙烯基醯胺凝膠電泳(PAGE)的凝膠電泳、毛細管電泳、質譜和液相色譜法，包括HPLC。優選通過使用具有約4%積層凝膠和約10%分離凝膠的SDS聚丙烯基醯胺凝膠在還原和變性的條件下分離多肽來測定分子量。除非另外指明，分子量意指通過SDS-PAGE確定的分子量。本文中所用的「質量指紋圖譜」意指在用蛋白酶消化後，從多肽獲得的多肽片段的種群。典型地，使用質譜方法分析從消化得到的多肽片段。每個多肽片段通過質量表徵，或通過質量(m)與電荷(ζ)的比率表徵，其被稱為「m/z比」或「m/z值」。產生多肽質量指紋圖譜的方法是常規的。這樣方法的實例在實施例13公開。本發明多肽可以為金屬調節的多肽。本文中所用的「金屬調節多肽」是指微生物當在低金屬的條件下生長時與在高金屬的條件下相同微生物的生長比較，通過微生物表達更高水平的多肽。低金屬和高金屬的條件在本文描述。例如，葡萄球菌屬物種產生的一類金屬調節多肽在高金屬的條件下微生物生長期間不以可檢測水平表達，但是在低金屬的條件下生長期間以可檢測水平表達。在低鐵條件下生長後，可從金黃色葡萄球菌分離出來這樣的金屬調節多肽的實例具有分子量88kDa、55kDa、38kDa、37kDa、36kDa、35kDa和33kDa。在低鋅或低銅條件下生長後，可從金黃色葡萄球菌分離出來這樣的金屬調節多肽的實例具有分子量 115kDa、88kDa、80kDa、71kDa、69kDa、35kDa、30kDa、29kDa 和 27kD。本發明還包括不是金屬調節的多肽。這樣的多肽在金屬離子例如氯化鐵存在下表達，也在低鐵的條件下生 長時表達。可從金黃色葡萄球菌分離出來的這樣多肽的實例具有分子量 150kDa、132WDa、120kDa、75kDa、58kDa、50kDa、44kDa、43kDa、41kDa 和 40kDa。多肽是金屬調節的多肽或不是能通過用於比較多肽存在的方法確定，包括例如凝膠過濾、包括十二烷基硫酸鈉-聚丙烯基醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)的凝膠電泳、毛細管電泳、質譜和液相色譜法，包括HPLC。分離在高金屬的條件下和在低金屬的條件下生長的微生物培養物，按照本文描述的分離本發明的多肽，將存在於每種培養物中的多肽分離並比較。典型地，來自每種培養物中的多肽等量使用。優選，使用具有約4%積層凝膠和約10%分離凝膠的SDS聚丙烯基醯胺凝膠在還原和變性的條件下分離多肽。例如，可以使用來自每種培養物的30微克(Ug)總多肽，並負載到凝膠孔中。在運行完凝膠後，用Coomasie亮藍染色，可比較二條泳道。當確定了多肽是否在可檢測水平表達時，將來自培養物的30 yg總多肽在SDS-PAGE凝膠上分離,使用本領域已知方法用Coomasie亮藍染色。可以通過眼睛可視化的多肽被認為是在可檢測水平表達的，同時不能被眼睛可視化的多肽則被認為不是以可檢測水平表達的。本發明多肽可以具有免疫原活性。「免疫原活性」意指多肽引起動物免疫響應的能力。對多肽的免疫響應是在動物中發展的對多肽的細胞和/或抗體-介導的免疫響應。通常，免疫響應包括但是不限於一種或多種下列作用:指向多肽一種或多種抗原決定部位的抗體、B細胞、輔助T細胞、抑制T細胞和/或細胞毒T細胞的產生。「抗原決定部位」意指在B細胞和/或T細胞特異性地響應以致產生抗體的抗原上的位點。免疫原活性可以為保護作用。「保護性免疫原活性」意指多肽在動物中引起免疫響應以預防或抑制葡萄球菌屬物種例如金黃色葡萄球菌感染的能力。多肽是否具有保護性免疫原活性可以通過本領域已知方法確定，例如在實施例5，9或12中描述的方法。例如，本發明多肽或本發明多肽的組合保護齧齒動物例如小鼠對抗用葡萄球菌屬物種的激發。本發明多肽可以具有血清激活活性。「血清激活活性」意指侯選多肽與來自感染葡萄球菌屬物種例如金黃色葡萄球菌的動物的康復期血清中存在的抗體反應的能力。在一些方面，康復期血清可以來自ATCC分離菌19636、菌株SAAV1、菌株2176或菌株1477感染的動物。本發明多肽可以具有免疫調節活性。「免疫調節活性」意指多肽以非特異性方式作用以增強對特定抗原免疫響應的能力。確定多肽是否具有免疫調節活性的方法是本領域已知的。本發明多肽可以具有參考微生物表達多肽的特徵。特徵可包括分子量和質量指紋圖譜兩者。參考微生物可以 是革蘭氏陽性的，優選是微球菌科家族的成員，優選葡萄球菌屬物種，更優選金黃色葡萄球菌。優選的菌株實例在表I中詳細描述。表1.細菌菌株
細菌細胞I實驗室名稱
金黃色葡萄球菌 ATCC分離菌19636金黃色葡萄球菌菌株SAAVl金黃色葡萄球菌菌株1477金黃色葡萄球菌菌株2176當參考微生物是金黃色葡萄球菌ATCC分離菌19636時，如果侯選多肽具有分子量88kDa、55kDa、38kDa、37kDa、36kDa35kDa或33kDa和與參考微生物表達的以及分別具有分子量88kDa、55kDa、38kDa、37kDa、36kDa35kDa或33kDa的金屬調節多肽的質量指紋圖譜類似的質量指紋圖譜，則侯選多肽被考慮為本發明的多肽。優選，這樣的多肽為金屬調節的。例如，如果侯選多肽具有88kDa的分子量，並且具有參考菌株金黃色葡萄球菌ATCC分離菌19636產生的88kDa金屬調節多肽的質量指紋圖譜類似的質量指紋圖譜，則侯選多肽被考慮為本發明的多肽。當參考微生物是金黃色葡萄球菌分離菌SAAVl，如果侯選多肽具有88kDa、55kDa、38kDa、37kDa、36kDa、35kDa或33kDa分子量(通過SDS-PAGE確定的)，且具有參考微生物表達的以及分別具有88kDa、55kDa、38kDa、37kDa、36kDa、35kDa或33kDa的分子量(通過SDS-PAGE確定的)的多肽的質量指紋圖譜類似的質量指紋圖譜，則候選多肽被考慮為本發明的多肽。優選，這樣的多肽為金屬調節的。例如，如果侯選多肽具有88kDa的分子量，和與參考菌株金黃色葡萄球菌分離菌SAAVl產生的88kDa金屬調節多肽的質量指紋圖譜類似的質量指紋圖譜，則侯選多肽為本發明的多肽。
當參考微生物是金黃色葡萄球菌菌株2176時，如果侯選多肽具有88kDa、80kDa、65kDa、55kDa、37kDa、36kDa、35kDa、33kDa 或 32kDa 分子量(通過 SDS-PAGE 確定的)，且具有與參考微生物表達的以及具有 88kDa、80kDa、65kDa、55kDa、37kDa、36kDa、35kDa、33kDa 或32kDa的分子量(通過SDS-PAGE確定的)的多肽的質量指紋圖譜類似的質量指紋圖譜，則侯選多肽被考慮為本發明的多肽。優選這樣的多肽為金屬調節的。例如，如果侯選多肽具有88kDa的分子量，和與參考菌株金黃色葡萄球菌分離菌2176產生的88kDa金屬調節多肽的質量指紋圖譜類似的質量指紋圖譜，則侯選多肽被考慮為本發明的多肽。當參考微生物是金黃色葡萄球菌菌株1477時，如果侯選多肽具有88kDa、80kDa、65kDa、55kDa、37kDa、36kDa、35kDa、33kDa 或 32kDa 的分子量(通過 SDS-PAGE 確定的)，且具有與參考微生物表達的以及分別具有88kDa、80kDa、65kDa、55kDa、37kDa、36kDa、35kDa、33kDa或32kDa的分子量(通過SDS-PAGE確定的)的多肽質量指紋圖譜類似的質量指紋圖譜，則候選多肽被考慮為本發明的多肽。優選這樣的多肽為金屬調節的。例如，如果侯選多肽具有88kDa的分子量，和與參考菌株金黃色葡萄球菌分離菌1477產生的88kDa金屬調節多肽的質量指紋圖譜類似的質量指紋圖譜，則侯選多肽被考慮為本發明的多肽。被參考微生物所表達的和以上分子量指代的多肽，可以通過參考微生物在低金屬的條件下生長，並隨後通過本文公開的方法分離多肽得到。侯選多肽是從微生物中可分離出來的，優選革蘭氏陽性微生物，更優選微球菌科家族成員，優選葡萄球菌屬物種，更優選金黃色葡萄球菌。來自多肽可以被分離的其它革蘭氏陽性微生物，包括棒狀桿菌屬物種、腸球菌某種、丹毒絲菌屬物種、皮球菌屬物種，和微球菌屬物種、分支桿菌屬物種和丹毒絲菌屬物種。侯選多肽還可以使用重組、酶或化學的技術生產。侯選多肽可以通過質譜評價分析以確定侯選多肽是否具有與參考微生物表達的並參考上述分子量的多肽之一類似的質量指紋圖譜。典型地將侯選多肽分離，例如通過凝膠電泳分離侯選多肽，並切除含有侯選多肽的凝膠部分。可以使用基於不同特徵分離多肽分任何凝膠電泳方法，包括I維或2維凝膠電泳，以及基於例如疏水性、pi或大小的液相色譜法分離法。例如通過用蛋白酶消化，侯選多肽被分段。優選蛋白酶在胺基酸賴氨酸的羧基端和胺基酸精氨酸之間裂解肽鍵，在賴氨酸或精氨酸之後的胺基酸是脯氨酸的除外。這樣蛋白酶的實例是胰島素。用胰島素消化多肽的方法是常規的，並本領域是已知的。這樣方法的實例在實施例13中公開。多肽的質譜分析方法是常規的，本領域是已知的，包括但不限於基質輔助雷射解吸/離子化飛行時間質譜(MALD1-TOF MS)。典型地，將含有從侯選多肽獲得的多肽片段混合物與發揮將雷射能量轉移給樣品功能的基質混合，產生離子化，優選單同位素的多肽片段。可以使用的基質的實例包括例如芥子酸或氰基-4-羥基肉桂酸。通過MALD1-TOF MS分析多肽方法的實例在實施例13中描述。離子化的多肽片段根據它們的m/z比分離，檢測生成m/z比對於強度的光譜。光譜包括表示從侯選多肽得到多肽片段的m/z值。對於任何給定的多肽，從胰島素消化得到的每個多肽片段的量應當是等摩爾的。但是，已知胰島素消化不總是100%有效，例如，一些位點被更有效地裂解。因此，當MALD1-TOF MS用於確定m/ζ值時，每個m/z值的強度典型地是不相同的。一般說來，光譜具有在絕大部分X-軸(即軸具有m/z比率的值)存在噪音的背景水平。這種噪音的背景水平依據運行條件和使用的儀器而變化，容易通過光譜視覺分析鑑定。當強度比噪音背景水平高至少2倍，至少3倍，至少4倍時，一個m/z值一般說來被認為代表一個多肽片段。光譜通常包括其它m/z值，其是假象，例如由以下原因導致:不完全的消化、過分消化、在混合物中存在的其它多肽，或用於消化多肽的蛋白酶，包括從蛋白酶自水解得到的m/z值。這種用蛋白酶消化多肽的方法在本領域被認為是可得到高度專一性的質量指紋圖譜，能被用於準確鑑定多肽和將其與其它多肽區分的方法。在本發明的這方面，當侯選多肽通過質譜法分析時，優選將侯選多肽和來自參考微生物的多肽兩者共同製備和分析，因此可減少在樣品處理和操作條件上差異導致的任何潛在的假象，優選，用於製備和分析兩種多肽的所有試劑都是相同的。例如，將來自參考微生物的多肽和侯選多肽在基本上相同的條件下分離，在基本上相同的條件下破碎，在相同的儀器和基本上相同的條件下通過MALD1-TOF MS分析。當侯選多肽的質量指紋圖譜有至少80%，至少90%，至少95%或基本上所有的m/z值出現在參考微生物多肽的光譜中時，侯選多肽的質量指紋圖譜被認為與來自參考微生物的多肽質量指紋圖譜是類似的，上述噪音的背景水平也出現在侯選多肽的光譜中。在另一方面，如果多肽具有在表2，3，4或5中描述的參考多肽的分子量，且質量指紋圖譜包括如表2，3，4或5所列參考多肽的多肽片段的種群，則考慮該多肽是本發明的多肽。例如本發明多肽包括88kDa的多肽，包括具有質量HVDVR，YSYER，II⑶YRR，IFTDYRK，ELKELGQK, YAQVKPIR, QMQFFGAR, SMQPFGGIR, VSGYAVNFIK, NHATAffQGFK, LffEQVMQLSK,SLGKEPEDQNR,DGISNTFSIVPK,AGVITGLPDAYGR, TSTFLDIYAER,SMQPFGGIRMAK, THNQGVFDAYSR,KAGVITGLPDAYGR， TLLYAINGGKDEK, IEMALHDTEIVR, AGEPFAPGANPMHGR, VALYGVDFLMEEK,KTHNQGVFDAYSR, YGFDLSRPAENFK, TSSIQYENDDIMR, KAGEPFAPGANPMHGR, RVALYGVDFLMEEK,LWEQVMQLSKEER, MLETNKNHATAffQGFK, MHDFNTMSTEMSEDVIR, YGNNDDRVDDIAVDLVER,ETLIDAMEHPEEYPQLTIR，YAQVKPIRNEEGLVVDFEIE⑶FPK的多肽片段的質量指紋圖譜。可以通過質譜方法確定侯選多肽的質量指紋圖譜，例如通過MALD1-T0FMS。侯選多肽的質量指紋圖譜一般具有另外的多肽片段，因此有不同於表2，3，4或5所列那些多肽的另外的m/z值。優選，當將候選多肽與在表2，3，4或5的多肽比較時，侯選多肽是從微生物中可分離出來的，優選革蘭氏陽性微生物， 更優選微球菌科家族成員，優選葡萄球菌屬物種，更優選金黃色葡萄球菌。其它革蘭氏陽性生物體包括棒狀桿菌屬物種、腸球菌某種、丹毒絲菌屬物種、皮球菌屬物種、李斯特菌屬物種、微球菌屬物種、分支桿菌屬物種和丹毒絲菌屬物種。侯選多肽可以通過在低金屬的條件下生長微生物，隨後通過本文描述的方法分離多肽獲得。在本領域眾所周知在樣品處理期間，例如氧化和形成甲醯胺甲基衍生物，胺基酸的修飾可以意外引入。進一步地，這些類型的修飾改變多肽片段的m/z值。例如，如果多肽片段含有氧化的甲硫氨酸，其m/z值相對於不含氧化甲硫氨酸的相同片段將增加16。因此，在表2，3，4或5中有符號「氧化(M) 」的那些多肽片段的m/z值相對於不含氧化的甲硫氨酸的相同片段增加16。應當理解表2，3，4或5中多肽片段可以在樣品處理期間被修飾。
權利要求
1.組合物，所述組合物包含: 分離的全細胞，其包含分子量為88kDa、55kDa、38kDa、37kDa、36kDa、35kDa或33kDa的至少五種多肽，其中分子量通過在十二烷基硫酸鈉一聚丙烯基醯胺凝膠上的電泳測定，其中所述多肽由當在包含鐵螯合劑的介質中培養時的金黃色葡萄球菌ATCC菌株19636表達，並且不由當在不含鐵螯合劑的介質中生長時的金黃色葡萄球菌ATCC菌株19636表達，其中組合物保護動物對抗金黃色葡萄球菌ATCC菌株19636的激發。
2.權利要求1的組合物，其進一步包含可藥用載體。
3.權利要求1的組合物，其中所述分離的全細胞進一步表達具有分子量150kDa、132kDa、120kDa、75kDa、58kDa、50kDa、44kDa、43kDa、41kDa 或 40kDa 的至少一種多肽，所述多肽由當在不含鐵螯合劑的介質中生長時的金黃色葡萄球菌ATCC菌株19636表達。
4.組合物在製備用於治療患有由葡萄球菌屬物種導致的感染或有風險患有由葡萄球菌屬物種導致的感染的患者感染的藥物中的用途，其中該組合物包含: 分離的全細胞，其包含分子量為88kDa、55kDa、38kDa、37kDa、36kDa、35kDa或33kDa的至少五種多肽，其中分子量通過在十二烷基硫酸鈉一聚丙烯基醯胺凝膠上的電泳測定，其中所述多肽由當在包含鐵螯合劑的介質中培養時的金黃色葡萄球菌ATCC菌株19636表達，並且不由當在不含鐵螯合劑的介質中生長時的金黃色葡萄球菌ATCC菌株19636表達，其中組合物保護動物對抗金黃色葡萄球菌ATCC菌株19636的激發。
5.權利要求4的用途，其中患者是哺乳動物。
6.權利要求5的用途，其中哺乳動物是人類。
7.權利要求4的用途，其中葡萄球菌屬物種是金黃色葡萄球菌。
8.組合物在製備用於 治療患有由葡萄球菌屬物種導致的感染或有風險患有由葡萄球菌屬物種導致的感染的患者症狀的藥物中的用途，其中該組合物包含: 分離的全細胞，其包含分子量為88kDa、55kDa、38kDa、37kDa、36kDa、35kDa或33kDa的至少五種多肽，其中分子量通過在十二烷基硫酸鈉一聚丙烯基醯胺凝膠上的電泳測定，其中所述多肽由當在包含鐵螯合劑的介質中培養時的金黃色葡萄球菌ATCC菌株19636表達，並且不由當在不含鐵螯合劑的介質中生長時的金黃色葡萄球菌ATCC菌株19636表達，其中組合物保護動物對抗金黃色葡萄球菌ATCC菌株19636的激發。
9.權利要求8的用途，其中患者是哺乳動物。
10.權利要求9的用途，其中哺乳動物是人類。
11.權利要求8的用途，其中葡萄球菌屬物種是金黃色葡萄球菌。
12.組合物在製備用於減少在患有由葡萄球菌屬物種導致的感染或有風險患有由葡萄球菌屬物種導致的感染的患者中建群的藥物中的用途，其中組合物包含: 分離的全細胞，其包含分子量為88kDa、55kDa、38kDa、37kDa、36kDa、35kDa或33kDa的至少五種多肽，其中分子量通過在十二烷基硫酸鈉一聚丙烯基醯胺凝膠上的電泳測定，其中所述多肽由當在包含鐵螯合劑的介質中培養時的金黃色葡萄球菌ATCC菌株19636表達，並且不由當在不含鐵螯合劑的介質中生長時的金黃色葡萄球菌ATCC菌株19636表達，其中組合物保護動物對抗金黃色葡萄球菌ATCC菌株19636的激發。
13.權利要求12的用途，其中患者是哺乳動物。
14.權利要求13的用途，其中哺乳動物是人類。
15.權利 要求12的用途，其中葡萄球菌屬物種是金黃色葡萄球菌。
全文摘要
本發明提供可從葡萄球菌屬物種分離出來的分離的多肽。本發明還提供包括一種或多種該多肽的組合物，以及所述多肽的製備方法和使用方法。
文檔編號A61K39/085GK103143006SQ201310020750
公開日2013年6月12日 申請日期2006年2月14日 優先權日2005年2月14日
發明者D.A.艾默裡, D.E.斯特勞布, L.溫德林, L.L.合朗奧爾森 申請人:埃皮託皮克斯有限責任公司