製備兩端帶有限制性內切酶粘性末端的目的dna片段的方法
2023-06-01 17:22:06 1
專利名稱：製備兩端帶有限制性內切酶粘性末端的目的dna片段的方法
技術領域：
本發明涉及一種製備兩端帶有限制性內切酶粘性末端的目的DNA片段的方法。
背景技術：
自PCR技術問世以來，適應PCR產物測序、改造和表達等需要，先後出現了多種克隆方法，包括在引物中引入完整酶切位點克隆法[Scharf S. J. , Horn G. Τ. & ErlichH. Α. (1986)Direct cloning and sequence analysis of enzymatically ampIifiedgenomic sequences. Science，233，1076-1078.]、無需連接反應的克隆方法[Aslanidis C. & de Jong P. J. (1990)Ligation-independent cloning of PCRproducts(LIC-PCR). Nucleic Acids Res. , 18(20) :6069-6074. ]、T 載體克隆法[Marchuk D.，Drumm Μ.，Saulino Α. & Collins F. S. (1991)Construction ofT-vectors, a rapid and general system for direct cloning of unmodified PCRproducts. Nucleic Acids Res. 19(5) :1154.]> 平 TfC ^ [Liu Z.G.& SchwartzL. Μ· (1992)An efficient method for blunt-end ligation of PCR products. Biotechniques. 12(1) :28, 30. ]、Hetero-stagger 克隆技術[Liu Ζ. (1996)Hetero-stagger cloning :efficient and rapid cloning of PCR products. NucleicAcids Res. 24 (12) :2458-2459. ] > autosticky PCR ^ * [Gal J., Schnell R. , SzekeresS. & Κ πι η Μ. (1999) Directional cloning of native PCR products with preformedsticky ends(autosticky PCR).Mol Gen Genet.260 (6) 569-573·]、無酶克隆法[Tillett D. & Neilan B. Α. (1999)Enzyme-free cloning :a rapid method to clonePCR products independent of vector restriction enzyme sites. Nucleic Acids Res. 27(19) :e26.]、嵌合引物克隆法[Chen G. J.，Qiu N. & Page Μ. P. (2002)Universalrestriction site-free cloning method using chimeric primers. Biotechniques. 32 (3) :516, 518-520. ]、3GC 克隆技術[Zheng D.，Liu X. & Zhou Y. (2008)3GC cloning :PCR products cloning mediated by terminal deoxynuc1eotidy1 transferase. AnalBiochem. 378 (1) :108-110.]等。這些方法各具特色，但也均存在各種局限性。以第一種克隆方法為例，該方法最早被用於PCR產物的克隆，目前仍然是最流行的一種克隆技術。該方法存在兩個明顯缺陷首先，多種II型限制性DNA內切酶對位於DNA 末端的識別位點切割效率很低，需要在引物的5』端添加較長的保護鹼基才能有效切割PCR 產物，但添加過長的保護鹼基可能會影響PCR擴增效果；其次，插入片段內含的限制酶位點會影響克隆位點的選擇，一些較長的PCR產物可能會含有較多種限制酶位點，不能方便地連接到載體中，實驗人員為克隆不同的PCR產物往往需要準備多種不同的內切酶，增加了克隆的難度和費用。使用較廣的另一種克隆方法-T載體克隆法，同樣存在兩大不足其一，此方法只能用於保真度最低的DNA聚合酶-Taq酶擴增產物的克隆，高保真DNA聚合酶(如PfiuVent酶等)擴增產物的末端為平末端，不能直接克隆到T載體中；其二，目前商用的各種T載體一般只能作為克隆載體，而不能作為表達載體，對於需要表達的基因，必須進行二次克隆， 費時費力，而且在二次克隆時，同樣需要考慮表達載體上是否有合適的克隆位點。後來發明的其它各種克隆方法，雖然能夠不同程度地解決以上兩種方法固有的問題，但自身或多或少存在效率低、成本高、周期長、技術複雜等不同的缺點，沒有一種能夠像前兩種方法那樣得到廣泛的應用。
發明內容
本發明的目的是提供一種製備可用於定向克隆的兩端帶有限制性內切酶粘性末端的目的DNA片段的方法。本發明提供的製備兩端帶有限制性內切酶粘性末端的雙鏈DNA片段的方法(孿生 PCR)，包括如下步驟(1)製備引物對甲和引物對乙；所述引物對甲由上遊引物甲和下遊引物甲組成； 所述引物對乙由上遊引物乙和下遊引物乙組成；所述引物對甲和所述引物對乙用於擴增同一目的DNA片段；所述上遊引物甲的5'末端具有限制性內切酶甲識別序列中切割位點下遊的全部序列；所述下遊引物甲的5'末端具有限制性內切酶乙識別序列中切割位點上遊的全部序列的反向互補序列；所述上遊引物乙的5'末端具有所述限制性內切酶甲識別序列中切割位點上遊的全部序列的反向互補序列；所述下遊引物乙的5'末端具有所述限制性內切酶乙識別序列中切割位點下遊的全部序列；(2)用所述引物對甲PCR擴增所述目的DNA片段，得到PCR擴增產物甲；用所述引物對乙PCR擴增所述目的DNA片段，得到PCR擴增產物乙；( 將所述PCR擴增產物甲和所述PCR擴增產物乙混合後依次進行變性和退火，得到5'末端帶有限制性內切酶甲識別序列的粘性末端且3'末端帶有限制性內切酶乙識別序列的粘性末端的雙鏈DNA片段。步驟(3)中，所述PCR擴增產物甲和所述PCR擴增產物乙最好等摩爾混合。所述限制性內切酶甲的切割位點可位於所述限制性內切酶甲的識別序列內；所述限制性內切酶乙的切割位點可位於所述限制性內切酶乙的識別序列內。步驟⑴中，所述限制性內切酶識別序列均指的是5' -3'單鏈。步驟⑶中， 所述限制性內切酶識別序列均指的是雙鏈。以上任一所述方法均可用於構建重組載體。本發明還保護一種製備重組載體的方法，包括如下步驟(1)用所述限制性內切酶甲和所述限制性內切酶乙酶切出發質粒，回收載體骨架；所述出發質粒中含有所述限制性內切酶甲的識別序列和所述限制性內切酶乙的識別序列；(2)將用以上任一所述方法製備的5'末端帶有限制性內切酶甲識別序列的粘性末端且3'末端帶有限制性內切酶乙識別序列的粘性末端的雙鏈DNA片段與步驟(1)得到的載體骨架連接，得到重組載體。本發明還保護引物對甲和引物對乙組成的引物組合物；所述引物對甲和所述引物對乙用於擴增同一目的DNA片段；所述上遊引物甲的5'末端具有限制性內切酶甲識別序列中切割位點下遊的全部序列；所述下遊引物甲的5'末端具有限制性內切酶乙識別序列中切割位點上遊的全部序列的反向互補序列；所述上遊引物乙的5'末端具有所述限制性內切酶甲識別序列中切割位點上遊的全部序列的反向互補序列；所述下遊引物乙的5'末端具有所述限制性內切酶乙識別序列中切割位點下遊的全部序列。本發明中，根據骨架載體上預期插入的多克隆位點設計兩對引物，以含有目的基因的DNA為模板，分別用兩對引物進行PCR擴增，得到兩種PCR擴增產物，將兩種PCR擴增產物混合後依次進行變性和退火，得到目的DNA片段(兩端帶有相應限制性內切酶的粘性末端，中間為目的基因)，目的DNA片段可以定向克隆至骨架載體的預期多克隆位點。與傳統PCR產物克隆方法相比，本發明所提供的克隆方法(孿生PCR克隆法)不需使用限制酶處理PCR產物，即可得到含有任意限制酶粘性末端的DNA片段，出發載體的多克隆位點全部可以使用，無需考慮目的基因中是否含有與載體多克隆位點相同的酶切位點，因而可輕鬆實現目的基因的定向克隆。本發明所提供的克隆方法簡單易行，成本低，效率高，通用性好， 可以廣泛應用於PCR產物的快速定向克隆。
圖1為瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。泳道1 :DNA分子量標準；泳道2 =PCR擴增產物甲；泳道3 :PCR擴增產物乙。圖2為用PCR擴增產物甲和PCR擴增產物乙得到混合DNA片段(DNA片段I、DNA 片段II、DNA片段III和DNA片段IV)的示意圖。圖3為質粒pFLAG-CMV2多克隆位點示意圖。圖4為10個陽性克隆中質粒的酶切鑑定。圖5為重組質粒pFLAG-CMV2-PCGFl的部分測序結果。A中的EcoR I為上遊克隆位點，B中的EcoR I為PCGFl內含的EcoR I位點。
具體實施例方式以下的實施例便於更好地理解本發明，但並不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。實施例中使用NanoDrop 2000超微量分光光度計測定 DNA片段的濃度。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。所有引物合成及測序工作均由英濰捷基(上海)貿易有限公司北京辦事處完成。Deep Vent DNA聚合酶、限制性內切酶和T4 DNA連接酶均購自New England Biolabs 公司。Taq DNA聚合酶購自天根生化科技(北京)有限公司。人白細胞cDNA文庫購自美國 Clontech公司，產品目錄號為638821。質粒pFLAG_CMV2為Sigma公司產品，產品目錄號為 E7398(其多克隆位點示意圖見圖3)。大腸桿菌DH5ci為天根生化科技(北京)有限公司產品，產品目錄號為CB101-03。實施例中用於培養大腸桿菌的培養基均為LB培養。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重複實驗，結果取平均值。實施例1、應用孿生PCR定向克隆一、引物設計根據多梳環指l(polycomb group ring finger 1，PCGF1)基因(PCGF1 基因)的 mRNA序列(GenBank NM_032673 ；相應的DNA見序列表的序列1，編碼序列為序列表的序列1自5'末端第27至806位核苷酸)設計兩對引物，FL/RS引物對(由上遊長引物FL和下遊短引物RS組成)和FS/RL引物對(由上遊短引物FS和下遊長引物RL組成)。FL/RS引物對和FS/RL引物對的靶序列(與PCGFl基因相應的序列)相同。上遊長引物FL:5' -AATTCTAAGATGGC GTCTCCTCAGG-3『(下劃線部分為限制性內切酶EcoRI識別序列中切割位點下遊的全部序列，斜體字母乂爪為/ 1/^基因的起始密碼子)；下遊短引物RS:5' -1ACCTCCTCTTCTCTTTCAC-3『(下劃線部分為限制性內切酶 Bgl II識別序列中切割位點上遊的全部序列的反向互補序列，斜體字母以對應/ 1/^基因的終止密碼子TAG的一部分)。 上遊短引物FS 5 『 -CTAAGATGGCGTCTCCTCAGG-3 『(下劃線部分為限制性內切酶 EcoRI識別序列中切割位點上遊的全部序列的反向互補序列，斜體字母乂爪為基因的起始密碼子)；下遊長引物RL:5' -GATCTACCTCCTC TTCTCTTTCAC-3』 (下劃線部分為限制性內切酶Bgl II識別序列中切割位點下遊的全部序列，斜體字母對應/ 1/^基因的終止密碼子TAG)。限制性內切酶EcoRI的識別序列為5' -G^ AATTC-3' ( ^標註切割位點)。限制性內切酶Bgl II的識別序列為5' -A^GATCT-3' Γ標註切割位點)。二、製備帶有限制性內切酶粘性末端的目的DNA片段以人白細胞cDNA文庫為模板，用FL/RS引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產物甲。以人白細胞cDNA文庫為模板，用FS/RL引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產物乙。PCR反應體系由模板、10X緩衝液、dNTPs、上遊引物、下遊引物、De印Vent DNA聚合酶和去離子水組成；dNIPs的濃度為125ymol/L，上遊引物的濃度為200nmol/L，下遊引物的濃度為200nmol/L，每4(^1^反應體系中含有50叫模板、1單位De印VentDNA聚合酶禾口 4yL IOX緩衝液。
權利要求
1.一種製備兩端帶有限制性內切酶粘性末端的雙鏈DNA片段的方法，包括如下步驟(1)製備引物對甲和引物對乙；所述引物對甲由上遊引物甲和下遊引物甲組成；所述引物對乙由上遊引物乙和下遊引物乙組成；所述引物對甲和所述引物對乙用於擴增同一目的DNA片段；所述上遊引物甲的5'末端具有限制性內切酶甲識別序列中切割位點下遊的全部序列；所述下遊引物甲的5'末端具有限制性內切酶乙識別序列中切割位點上遊的全部序列的反向互補序列；所述上遊引物乙的5'末端具有所述限制性內切酶甲識別序列中切割位點上遊的全部序列的反向互補序列；所述下遊引物乙的5'末端具有所述限制性內切酶乙識別序列中切割位點下遊的全部序列；(2)用所述引物對甲PCR擴增所述目的DNA片段，得到PCR擴增產物甲；用所述引物對乙PCR擴增所述目的DNA片段，得到PCR擴增產物乙；(3)將所述PCR擴增產物甲和所述PCR擴增產物乙混合後依次進行變性和退火，得到 5'末端帶有限制性內切酶甲識別序列的粘性末端且3'末端帶有限制性內切酶乙識別序列的粘性末端的雙鏈DNA片段。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於步驟C3)中，所述PCR擴增產物甲和所述PCR 擴增產物乙等摩爾混合。
3.如權利要求1或2所述的方法，其特徵在於所述限制性內切酶甲的切割位點位於所述限制性內切酶甲的識別序列內；所述限制性內切酶乙的切割位點位於所述限制性內切酶乙的識別序列內。
4.權利要求1或2或3所述方法在構建重組載體中的應用。
5.一種製備重組載體的方法，包括如下步驟(1)用權利要求1所述限制性內切酶甲和權利要求1所述限制性內切酶乙酶切出發質粒，回收載體骨架；所述出發質粒中含有權利要求1所述限制性內切酶甲的識別序列和權利要求1所述限制性內切酶乙的識別序列；(2)將用權利要求1或2或3所述方法製備的5'末端帶有限制性內切酶甲識別序列的粘性末端且3'末端帶有限制性內切酶乙識別序列的粘性末端的雙鏈DNA片段與步驟(1) 得到的載體骨架連接，得到重組載體。
6.引物對甲和引物對乙組成的引物組合物；所述引物對甲和所述引物對乙用於擴增同一目的DNA片段；所述上遊引物甲的5'末端具有限制性內切酶甲識別序列中切割位點下遊的全部序列；所述下遊引物甲的5'末端具有限制性內切酶乙識別序列中切割位點上遊的全部序列的反向互補序列；所述上遊引物乙的5'末端具有所述限制性內切酶甲識別序列中切割位點上遊的全部序列的反向互補序列；所述下遊引物乙的5'末端具有所述限制性內切酶乙識別序列中切割位點下遊的全部序列。
全文摘要
本發明公開了一種製備兩端帶有限制性內切酶粘性末端的目的DNA片段的方法。本發明中，根據骨架載體上預期插入的多克隆位點設計兩對引物，以含有目的基因的DNA為模板，分別用兩對引物進行PCR擴增，得到兩種PCR擴增產物，將兩種PCR擴增產物混合後依次進行變性和退火，得到目的DNA片段(兩端帶有相應限制性內切酶的粘性末端，中間為目的基因)，目的DNA片段可以定向克隆至骨架載體的預期多克隆位點。與傳統PCR產物克隆方法相比，本發明所提供的克隆方法簡單易行，成本低，效率高，通用性好，可以廣泛應用於PCR產物的快速定向克隆。
文檔編號C12N15/11GK102181430SQ20111004764
公開日2011年9月14日 申請日期2011年2月28日 優先權日2011年2月28日
發明者徐光翠, 李小英, 解博紅, 謝雲飛, 閆清華 申請人:新鄉醫學院