一種利用花序軸高效誘導大蒜胚性愈傷組織的方法與流程

2023-06-02 02:04:11 3

本發明涉及植物組織培養技術，具體設計一種利用花序軸高效誘導大蒜胚性愈傷組織的方法。

背景技術：

大蒜(alliumsativuml.)別名蒜、胡蒜，為百合科(liliaceae)蔥屬(allium)二年生草本植物，主要以嫩葉(蒜苗或青蒜)、花莖(蒜薹)、鱗莖(蒜頭)為食用產品，營養價值極高，是我國栽培歷史悠久的重要經濟作物之一，也是重要的出口創匯蔬菜。我國絕大部分栽培大蒜不能形成種子，主要靠鱗莖進行無性繁殖，它的不育性也給品種遺傳改良造成了困難，不利於新品種選育，同時常年的無形繁殖也導致種性退化，導致大蒜的產量和品質逐年下降。

利用組織培養技術，可以有效改善種性退化的問題，大大增加繁殖效率，進而提高大蒜產量和品質。大蒜組織培養主要有2種途徑：器官發生途徑和體細胞胚發生途徑。相比器官發生途徑，通過體細胞胚發生途徑形成再生植株具有數量多、速度快、結構完整、遺傳穩定性強等優點，其中對體細胞胚進行懸浮培養不僅可以縮短培養周期，建立快速繁殖體系，還可為品種改良、轉基因受體和突變體篩選等提供良好的無性繁殖試驗體系，將體胚製成人工種子，實現種苗規模化生產，應用價值和發展前景廣闊。

目前，國內外的大蒜體細胞胚發生體系普遍存在著體胚發生頻率低的問題。我國尚未形成一套完善的胚性愈傷組織誘導技術體系，有關品種和不同外植體對體胚發生影響的研究還不夠深入系統，現有體系具有體胚發生頻率低、再生時間長、和快繁成本高等問題急需建立了一種高效誘導胚性愈傷組織和體胚發生的再生體系。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種利用花序軸高效誘導大蒜胚性愈傷組織的方法，解決現有技術中存在的愈傷組織誘導率低、誘導時間長、和快繁成本高等問題。

本發明的目的可以通過以下措施達到：

一種利用花序軸高效誘導大蒜胚性愈傷組織的方法，包括以下步驟：

步驟(1)：在花序軸上表面直徑0.3-0.5cm，蒜薹的花莖發育相對高度即花莖高度/假莖高度為0.5-3.0時，陸續採收蒜薹，然後剪下總苞帶4-6cm蔓段，浸泡在飽和洗衣粉溶液中25-35min，然後用流水衝洗25-35min；

步驟(2)：將充分衝洗的材料在超淨工作檯上，以70-75％乙醇表面消毒60-90s，2％次氯酸鈉溶液浸泡消毒10-15min後，用無菌水衝洗4-5次，最後置於無菌濾紙上吸乾表面水分進行愈傷組織誘導試驗；

步驟(3)：剝去無菌花序軸外層苞葉，除去表面退化的花原基殘留物和膜質苞片及花莖部分，按十字型縱切為4塊，接種在胚性愈傷組織誘導培養基中；

步驟(4)：挑選黃白色顆粒狀、質地堅硬且易破碎的胚性愈傷組織，將其接入20-40ml愈傷組織增殖培養基中懸浮振蕩培養，振蕩轉速為160-200r/min，每6-8d更換1次新鮮培養基；

步驟(5)：選擇增殖後大小一致的胚性愈傷組織為材料，在添加6.0-7.0g·l-1瓊脂的體細胞胚萌發培養基上進行培養，每瓶接種4-6g的愈傷團，每4-5周繼代1次。

本發明步驟(1)中取花序軸上表面直徑0.3-0.5cm，蒜薹的花莖發育相對高度(花莖高度/假莖高度)約為0.5-3.0時的大蒜花序軸作為外植體，優選表面直徑為0.5cm和蒜薹花莖發育相對高度為1的花序軸，選用花序軸，其出愈時間和誘導率均顯著優於其他外植體類型，且適用品種廣泛。

本發明步驟(2)花序軸的滅菌處理時，70～75％酒精表面消毒時間為60～90秒，2％次氯酸鈉溶液處理時間為10-15分鐘，以確保滅菌徹底。優選75％的酒精滅菌90s，2％的次氯酸鈉滅菌12分鐘。

本發明步驟(3)中滅菌後，剝去無菌花序軸外層苞葉，除去表面退化的花原基殘留物等部分，可促進花序軸表面愈傷組織的誘導。

本發明步驟(3)中所採用的胚性愈傷組織誘導培養基所用的基本培養基可以為組培中常用的基礎培養基之一或其混合，如ms、b5或ms+b5，但為了獲得更高的胚性愈傷組織的誘導率，優選採用b5培養基。一種更優選的配比為：1倍b5培養基，2.0-3.0mg·l-12,4-d，0.3-0.6mg·l-1kt，30-40g·l-1蔗糖，6.0-7.0g·l-1瓊脂，ph5.8～6.2，更優選的配比為：1倍b5培養基，2.5mg·l-12,4-d，0.5mg·l-1kt，30g·l-1蔗糖，6.5g·l-1瓊脂，ph5.8。當選用2.5mg·l-12,4-d，0.5mg·l-1kt時，愈傷組織誘導率更高。

本發明步驟(4)愈傷組織在液體懸浮培養中增值培養能快速增重，四周後，愈傷組織增重率可達44.30％。

本發明步驟(4)中所採用的胚性愈傷組織增殖培養基的配比為1倍b5培養基，1.0-1.5mg·l-1的6-ba，0-0.5mg·l-1的kt，20-40g·l-1的蔗糖，ph為5.8-6.0或1倍b5培養基，1.0-1.5mg·l-1的6-ba，0-0.1mg·l-1的naa，20-40g·l-1的蔗糖，ph為5.8-6.0；優選的配比為1.0mg·l-16-ba，0.5mg·l-1kt，30g·l-1蔗糖，6.5g·l-1瓊脂，ph5.8，在此條件下，增重率最大。

本發明步驟(4)中胚性愈傷組織增殖過程中置於23-27℃，光照強度為50-200μmol·m-2·s-1，光周期12-14h·d-1光照條件下培養。

本發明步驟(5)中體細胞胚萌發培養基中包含：6-ba的濃度為1.5-2.5mg·l-1，kt的濃度為0.5-1.0mg·l-1，優選的配比為2.0mg·l-16-ba，0.5mg·l-1kt。每克愈傷組織萌發的芽數可達6.67。

本發明步驟(5)中的體細胞胚萌發培養基所用的基本培養基可以為組培中常用的基礎培養基之一或其混合，如ms、b5或ms+b5，但為了獲得更高的萌發率，優選採用ms培養基。步驟(5)中所述體細胞胚萌發培養基中還優選包括含有25-35g·l-1的蔗糖。

本發明的有益效果：

1、取材廣泛：首次利用大蒜花序軸為外植體誘導出體細胞胚，大蒜蒜薹上花序軸一般不作為食用器官，外植體來源豐富，進一步提高了大蒜產品器官的利用率。

2、體細胞胚誘導率高：4個品種在的愈傷誘導率為88％-90％，其中以『二水早』為外植體最高，愈傷組織誘導率高達90.18％。

3、再生時間短：本發明利用花序軸為外植體，平均出愈時間為9d。

4、遺傳穩定性強：和一般的愈傷組織比較，體細胞胚能保持較好的母細胞形狀，變異係數低。

5、培養周期短：花序軸直接誘導體細胞胚的時間最短只有9天，而利用其它外植體誘導的培養時間長達1個月以上，有的甚至需要2-3個月；利用懸浮培養大大縮短了培養周期。

6、誘導成本低：外植體來源廣泛，和蒜瓣等不同，花序軸的採收對大蒜產品器官售賣的影響不大，體胚誘導率高，再生時間短，大大降低了組織培養對溫度、光照等控制的成本。

7、適用品種廣泛：可適用於『二水早』、『徐州白』、『正月早』、『葡萄牙蒜』和『早熟蒜』等多種品種。

8、對體細胞胚進行懸浮培養不僅可以縮短培養周期，建立快速繁殖體系，還可為品種改良、轉基因受體和突變體篩選等提供良好的無性繁殖試驗體系，將體胚製成人工種子，實現種苗規模化生產，應用價值和發展前景廣闊。

附圖說明

圖1懸浮培養對胚性愈傷組織增殖影響；a.增殖前；b.增殖後；

圖2不同激素組合對大蒜體細胞胚發育的影響；a.6-ba+kt；b.6-ba+naa；c.kt+naa；

圖3大蒜體細胞胚發生；a.瘤狀突起；b.結構鬆散的胚性愈傷組織；c.球形胚、盾形胚；d.成熟胚；

圖4大蒜花序軸形成的胚性愈傷組織形態；a.底部白色形成物；b.頂部膨大突起；c.d.e.『二水早』胚性愈傷組織；f.毛狀根；

圖5大蒜體細胞胚萌發情況；a.體胚中心變綠；b.c.綠點處萌發出根和芽；d.正常苗。

具體實施方式

通過以下實施例對本發明作進一步的詳細說明，但本發明的內容並不局限於此。

實施例1：

為了對比不同外植體類型對不同品種大蒜胚性愈傷組織誘導的影響，試驗以花序軸、鱗莖盤(帶莖尖)、試管苗的葉基部和根尖為材料，品種為『二水早』、『徐州白』、『正月早』、『葡萄牙蒜』和『早熟蒜』。將花序軸剝去外層苞葉，除去表面退化的花原基殘留物和膜質苞片及花莖部分，按十字型縱切為4塊，接種在同一培養皿上；將滅菌處理過的蒜瓣去掉貯藏葉和營養葉，切去鱗莖盤上部6mm處的假莖和葉片，切去貼近莖盤底部的約lmm的木栓化組織，得到約5mm厚帶發芽葉基的莖盤(帶莖尖)，每培養皿接種4個；將試管苗發白的發芽葉基部切成約0.5cm2的小塊，在葉脈中部橫切幾下，葉背向下接種到愈傷組織誘導培養基上；根尖切成1cm的小段，葉基部和根尖每培養皿分別接10個。3次重複，每重複接種10個培養皿。每天觀察生長情況並統計愈傷組織誘導率。

愈傷組織誘導率(％)＝產生愈傷組織外植體數/(接種外植體數－死亡數－汙染數)×100。

結果見表1和表2：不同的大蒜品種和取材部位對出愈有很大影響。同一品種的不同外植體之間，出愈時間和誘導率均有顯著差異。

表1不同品種和外植體對大蒜胚性愈傷組織誘導的影響

注:表中不同字母表示在0.05水平上差異顯著。

如表1所示，根尖和葉基部均以『二水早』出愈最快且誘導率最高，其次是『徐州白』、『正月早』、『早熟蒜』，『葡萄牙蒜』最慢且誘導率最低；鱗莖盤則以『徐州白』出愈最快(16d)，其次是『早熟蒜』、『正月早』、『二水早』，『葡萄牙蒜』最慢，需30d，彼此之間差異顯著，但以上最快的出愈時間也需要至少16天，而誘導率以『二水早』、『徐州白』、『正月早』較高，與『早熟蒜』和『葡萄牙蒜』差異顯著，誘導率最高可達到25.01％。

如表2所示，本發明所採用的外植體花序軸，以『二水早』和『徐州白』出愈最快，為7-9d，『正月早』和『早熟蒜』為12-14d；不同品種誘導率均在90％左右，其出愈時間和誘導率均顯著優於其他外植體類型，且適用品種廣泛。大蒜『二水早』花序軸誘導大蒜體細胞胚見圖3。

表2不同品種對大蒜花序軸胚性愈傷組織誘導的影響

注:表中不同字母表示在0.05水平上差異顯著。

實施例2：

為了對比不同基本培養基對不同品種大蒜胚性愈傷組織誘導的影響，選用ms、b5和ms+b5有機培養基，試驗品種有『二水早』、『徐州白』、『正月早』和『早熟蒜』，激素選用2.5mg·l-12,4-d+0.5mg·l-1kt。花序軸為外植體誘導胚性愈傷組織的方法和誘導率計算方法同實施例1。

結果如表3：『二水早』、『徐州白』、『正月早』和『早熟蒜』在b5基本培養基中與在ms和ms+b5有機兩種基本培養基中出愈時間無顯著性差異，但4個品種在b5培養基上的愈傷誘導率均高於其他基礎培養基，為88％-90％，其中以『二水早』最高，為90.18％。

表3不同品種和基本培養基對大蒜胚性愈傷組織誘導的影響

注:表中不同字母表示在0.05水平上差異顯著。

實施例3：

為了對比不同激素種類和濃度對大蒜胚性愈傷組織誘導的影響，本試驗的細胞分裂素選用kt(6-糖基氨基嘌呤)，設0.1、0.5、1.0mg·l-13個濃度，生長素2,4-d設1.5、2.5、3.5mg·l-13個濃度完全組合設計，共9個處理，每處理3次重複，每重複接種10個培養皿，每個培養皿接種4個外植體。每天觀察生長情況並統計愈傷組織誘導率。花序軸為外植體誘導胚性愈傷組織的方法和誘導率計算方法同實施案例1。

結果如表4：本發明所優先採用2.5mg·l-12,4-d+0.5mg·l-1kt愈傷組織誘導率最高，為90.18％，優於其他組合濃度說明在此濃度下2,4-d與kt協同作用於大蒜花序軸愈傷誘導。此處理下，大蒜花序軸形成的胚性愈傷組織形態見圖4。

表4不同激素對大蒜胚性愈傷組織誘導的影響

注:表中不同字母表示在0.05水平上差異顯著。

實施例4：

為了對比不同蔗糖濃度和ph對大蒜胚性愈傷組織誘導的影響，蔗糖濃度設20、30和40g·l-1，ph設5.4、5.8和6.23個梯度，共9個處理，每處理3次重複，每重複接種10個培養皿，每個培養皿接種4個外植體。花序軸為外植體誘導胚性愈傷組織的方法和誘導率計算方法同實施案例1。

結果如表5所示：不同蔗糖濃度和ph對大蒜胚性愈傷組織誘導有影響，本發明選用的蔗糖30-40g·l-1、ph值為5.8-6.2效果較好，特別是蔗糖為30g·l-1、ph5.8時，愈傷組織誘導率最高，為90.18％。

表5不同蔗糖濃度和ph對大蒜胚性愈傷組織誘導的影響

注:表中不同字母表示在0.05水平上差異顯著。

實施例5：

為了對比不同激素種類和濃度以及不同培養方式對大蒜胚性愈傷組織增殖的影響，挑選黃白色顆粒狀、質地堅硬且易破碎的胚性愈傷組織，將其接入固體培養基和50ml三角瓶中(懸浮培養)，液體培養基體積為30ml。激素選用6-ba、kt、tdz、naa，具體濃度及組合見表6。每處理5瓶，測定愈傷組織接入前後的培養瓶重量。懸浮培養用hy-4a數顯調速多用振蕩器(常州市偉嘉儀器製造有限公司生產)，轉速設定為180r/min，每7d更換1次新鮮培養基。4周後測定愈傷組織轉出前後培養瓶重量，統計胚性愈傷組織的生長量和增殖倍數。

表6大蒜胚性愈傷組織增殖培養基

結果如表7所示：本發明所選用的液體培養中增重率最低的l3(1.5mg·l-16-ba+0.5mg·l-1tdz)仍然高於固體培養中增重率最高的s1，即本發明所選用的液體培養愈傷組織增殖效果更好；選用液體培養基對激素種類和濃度的要求略低，如l1或l2的組合均有較好的效果，優選的l1(1.0mg·l-16-ba+0.5mg·l-1kt液體培養)增重率最大，達44.30％。懸浮培養4周後，愈傷組織增重情況見圖1。

表7不同培養方式和激素對大蒜胚性愈傷組織增殖的影響

注:表中不同字母表示在0.05水平上差異顯著。

實施例6：

為了對比不同激素種類和濃度對大蒜體胚萌發的影響，選擇增殖後大小一致的胚性愈傷組織為材料，在添加6.5g·l-1瓊脂的固體培養基上培養，具體配方見表8。每處理3次重複，每重複10瓶，每瓶接種5g左右的愈傷團，每4周繼代1次，光照下培養16周。觀察體胚發育狀況，統計再生根、苗數，計算萌發率。

萌發率(苗數/g)＝萌發苗數/胚性愈傷組織鮮重。

表8大蒜體細胞胚發育培養基

結果如表9和圖2：本發明所選用的6-ba+kt體胚萌發率最高，優於對比組合，且苗正常；而6-ba+naa的組合不僅萌發率較低，且有捲曲苗；kt+naa的組合體胚萌發率同樣較低，且部分體胚苗弱並稍有玻璃化。大蒜體細胞胚萌發情況見圖5。

表9不同激素組合對大蒜體細胞胚發育的影響