馬鈴薯y病毒陽性對照品的製備方法
2023-06-01 15:35:26 3
專利名稱：馬鈴薯y病毒陽性對照品的製備方法
技術領域：
本發明涉及病毒陽性對照品的製備方法。
背景技術：
馬鈴薯是中國第四大糧食作物，然而整體生產水平卻低於世界平均水平，其中最重要的原因就是病毒病嚴重影響了馬鈴薯的產量和品質。馬鈴薯Y病毒(Potato virus Y，PVY)是危害馬鈴薯的重要病毒之一，分布於世界各個馬鈴薯產區，可通過蚜蟲以非持久方式傳播，導致馬鈴薯退化、產量降低，嚴重時減產可達80%以上。特別是PVY在茄科作物上往往與馬鈴薯X病毒(PVX)發生協生作用，加劇了病毒病的危害，造成巨大的經濟損失。
目前最有效的防治措施是推廣脫毒種薯並加強檢測工作，有效的檢測方法是保證生產安全的重要措施，國內外常規檢測普遍採用病毒檢測試劑盒，應用DAS-ELISA技術進行PVY檢測，實驗檢測結果需要用病毒的陽性對照即馬鈴薯Y病毒凍乾粉來判斷結果是否準確，對實驗能否順利開展起著至關重要的作用，而該試劑盒全世界只有不足十家企業銷售，目前國內PVY病毒檢測幾乎完全依賴進口試劑盒，價格昂貴，限制了檢測技術的推廣普及，從而限制了馬鈴薯種薯質量的提高和產業的發展。另外，進口試劑盒存在以下缺點(I)價格昂貴進口試劑盒中的陽性對照價格昂貴，每瓶需要300元左右；(2)保質期短進口試劑盒中的陽性對照保質期為I年左右，如對陽性對照的凍乾粉進行稀釋或者稀釋後反覆凍融，保質期還將大大縮短，而且檢測結果值很低，不利於檢測結果的判斷；(3)不利於推廣普及由於價格昂貴，I套馬鈴薯Y病毒試劑盒中只有I瓶陽性對照，由於需要多次檢測，每次檢測都需要用陽性對照，因此，經過反覆凍融，保質期縮短，檢測值低，影響檢測結果。從而使馬鈴薯Y病毒的檢測試劑盒的應用受到限制，不利於推廣普及。
發明內容
本發明目的是為了解決現有PVY病毒檢測試劑盒中的陽性對照價格昂貴、保質期短以及不利於推廣普及的問題，而提供馬鈴薯Y病毒陽性對照品的製備方法。馬鈴薯Y病毒陽性對照品的製備方法按以下步驟實現一、將IOg的PVY繁殖寄主葉片和120mL的提取緩衝液混合後進行研磨，然後用雙層紗布過濾，得到病毒汁液；二、將O. 06 O. 12g的明膠和80mL的提取緩衝液混合，加熱至融化，然後加入6 IOg的蔗糖，繼續加熱至蔗糖融化，倒入病毒汁液中混勻，再倒入青黴素瓶中，每瓶加入I 2ml，蓋上瓶塞並放入冷凍乾燥機中抽乾，得到馬鈴薯Y病毒的凍乾粉，即完成馬鈴薯Y病毒陽性對照品的製備；其中步驟一中提取緩衝液每IOOmL由20g的PVP_40000、8· Og的NaCL、0. 2g的KH2PO4,2. 9g 的 Na2HPO4 · 12Η20、0· 2g 的 KCL、0. 2g 的 NaN3、0. 5mL 的 Tween20 和餘量的蒸餾水組成。
本發明製備的馬鈴薯Y病毒陽性對照品的有益效果是(1)價格低馬鈴薯Y病毒陽性對照每瓶價格為100元，而進口陽性對照的價格是300元左右，是進口價格的1/3 ；(2)保質期長，檢測靈敏度高對產品進行了保質期、檢測靈敏度的跟蹤實驗，經驗證該產品保質期達3年以上，DAS-ELISA檢測結果值達2. 000以上；(3)利於推廣普及價格低廉、檢測結果準確、保質期長，配合黑龍江省農業科學院生產的PVY病毒檢測試劑盒使用，利於推廣普及。
具體實施例方式具體實施方式
一本實施方式馬鈴薯Y病毒陽性對照品的製備方法按以下步驟實現一、將IOg的PVY繁殖寄主葉片和120mL的提取緩衝液混合後進行研磨，然後用雙層紗布過濾，得到病毒汁液； 二、將O. 06 O. 12g的明膠和80mL的提取緩衝液混合，加熱至融化，然後加入6 IOg的蔗糖，繼續加熱至蔗糖融化，倒入病毒汁液中混勻，再倒入青黴素瓶中，每瓶加入I 2ml，蓋上瓶塞並放入冷凍乾燥機中抽乾，得到馬鈴薯Y病毒的凍乾粉，即完成馬鈴薯Y病毒陽性對照品的製備；其中步驟一中提取緩衝液每IOOmL由20g的PVP_40000、8· Og的NaCL、0. 2g的KH2PO4,2. 9g 的 Na2HPO4 · 12Η20、0· 2g 的 KCL、0. 2g 的 NaN3、0. 5mL 的 Tween20 和餘量的蒸餾水組成。本實施方式中PVY繁殖寄主葉片的獲得①在馬鈴薯生長季節裡，田間採集有花葉或壞死症狀的馬鈴薯葉片，帶回實驗室，經血清學DAS-ELISA方法檢測為PVY病毒的葉片保存於-20°C冰箱，作為PVY毒源；②通過摩擦接種的方式將PVY毒源接種到PVY的繁殖寄主「黃苗榆煙」上，對接種植株從接種之日起每隔10天，用血清學DAS-ELISA方法檢測，當檢測結果值達2. 000以上進行採收，進行馬鈴薯Y病毒陽性對照品的製備。本實施方式中放入冷凍乾燥機中抽乾，得到馬鈴薯Y病毒的凍乾粉的工藝過程如下I.將冷凍乾燥機打開，溫度調至-50°c ；2.當溫度達到_50°C時，將青黴素瓶放入冷凍乾燥機中抽乾3小時；3. _40°C，抽乾 3 小時；4. _30°C，抽乾 3 小時；5. _20°C，抽乾 3 小時；6.-10°C，抽乾 3 小時；7. 0°C，抽乾 3 小時;8. 10°C，抽乾 I 小時;9. 20°C，抽乾 I 小時;10. 30°C，抽乾 I 小時;11.真空狀態壓蓋；12.取出青黴素瓶。本實施方式中製備的馬鈴薯Y病毒陽性對照品配合黑龍江省農業科學院生產的PVY病毒檢測試劑盒使用；黑龍江省農業科學院生產的PVY病毒檢測試劑盒的主要成分為抗體(IgG)、酶標抗體(IgG-Ap)、樣品提取緩衝液、洗漆緩衝液、包被緩衝液、酶標緩衝液、底物緩衝液、底物、馬鈴薯Y病毒陽性對照和陰性對照。
具體實施方式
二 本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟二中將O. Ig的明膠和SOmL的提取緩衝液混合，加熱至融化，然後加入Sg的蔗糖。其它步驟及參數與具體實施方式
一相同。實施例馬鈴薯Y病毒陽性對照品的製備方法按以下步驟實現一、將IOg的PVY繁殖寄主葉片和120mL的提取緩衝液混合後進行研磨，然後用雙 層紗布過濾，得到病毒汁液；二、將O. Ig的明膠和80mL的提取緩衝液混合，加熱至融化，然後加入8g的蔗糖，繼續加熱至蔗糖融化，倒入病毒汁液中混勻，再倒入青黴素瓶中，每瓶加入I 2ml，蓋上瓶塞並放入冷凍乾燥機中抽乾，得到馬鈴薯Y病毒的凍乾粉，即完成馬鈴薯Y病毒陽性對照品的製備；其中步驟一中提取緩衝液每IOOmL由20g的PVP_40000、8· Og的NaCL、0. 2g的KH2PO4,2. 9g 的 Na2HPO4 · 12Η20、0· 2g 的 KCL、0. 2g 的 NaN3、0. 5mL 的 Tween20 和餘量的蒸餾水組成。本實施例中放入冷凍乾燥機中抽乾，得到馬鈴薯Y病毒的凍乾粉的工藝過程如下I.將冷凍乾燥機打開，溫度調至_50°C ；2.當溫度達到_50°C時，將青黴素瓶放入冷凍乾燥機中抽乾3小時；3. _40°C，抽乾 3 小時；4. _30°C，抽乾 3 小時；5. _20°C，抽乾 3 小時；6.-10°C，抽乾 3 小時；7.0°C，抽乾 3 小時；8. 10°C，抽乾 I 小時;9. 20°C，抽乾 I 小時;10. 30°C，抽乾 I 小時;11.真空狀態壓蓋；12.取出青黴素瓶。本實施例中製備的馬鈴薯Y病毒陽性對照品配合黑龍江省農業科學院生產的PVY病毒檢測試劑盒使用，進行靈敏度的跟蹤實驗，DAS-ELISA檢測結果值達2. 000以上。
權利要求
1.馬鈴薯Y病毒陽性對照品的製備方法，其特徵在於馬鈴薯Y病毒陽性對照品的製備方法按以下步驟實現 一、將IOg的PVY繁殖寄主葉片和120mL的提取緩衝液混合後進行研磨，然後用雙層紗布過濾，得到病毒汁液； 二、將O.06 O. 12g的明膠和80mL的提取緩衝液混合，加熱至融化，然後加入6 IOg的蔗糖，繼續加熱至蔗糖融化，倒入病毒汁液中混勻，再倒入青黴素瓶中，每瓶加入I 2ml，蓋上瓶塞並放入冷凍乾燥機中抽乾，得到馬鈴薯Y病毒的凍乾粉，即完成馬鈴薯Y病毒陽性對照品的製備； 其中步驟一中提取緩衝液每IOOmL由20g的PVP-40000、8. Og的NaCL、0. 2g的ΚΗ2Ρ04、2.9g 的 Na2HPO4 · 12Η20、0· 2g 的 KCL、0. 2g 的 NaN3、0. 5mL 的 Tween20 和餘量的蒸餾水組成。
2.根據權利要求I所述的馬鈴薯Y病毒陽性對照品的製備方法，其特徵在於步驟二中將O. Ig的明膠和80mL的提取緩衝液混合，加熱至融化，然後加入8g的蔗糖。
全文摘要
馬鈴薯Y病毒陽性對照品的製備方法，它涉及病毒陽性對照品的製備方法。它為了解決現有PVY病毒檢測試劑盒中的陽性對照價格昂貴、保質期短以及不利於推廣普及的問題。方法一、將PVY繁殖寄主葉片和提取緩衝液混合後進行研磨，過濾得病毒汁液；二、明膠和提取緩衝液混合加熱至融化，加入蔗糖，融化後倒入病毒汁液中混勻，再倒入青黴素瓶中，然後凍幹，得馬鈴薯Y病毒的凍乾粉即完成。本發明製備的馬鈴薯Y病毒陽性對照品價格低，是進口價格的1/3；保質期達3年以上，DAS-ELISA檢測結果值達2.000以上；配合黑龍江省農業科學院生產的PVY病毒檢測試劑盒使用，利於推廣普及。
文檔編號G01N33/569GK102854313SQ20121037159
公開日2013年1月2日 申請日期2012年9月29日 優先權日2012年9月29日
發明者張威, 白豔菊, 高豔玲, 範國權, 申宇, 李學湛, 孟憲欣, 盧娜 申請人:黑龍江省農業科學院植物脫毒苗木研究所