MDR1基因多態性檢測體系及其試劑盒的製作方法

2023-06-01 07:29:31

本發明涉及一種基因多態性的檢測產品以及該產品所用到的引物、探針、檢測體系，屬於生物
技術領域：
。
背景技術：
：基因組dna在某一特定的核苷酸位置上發生轉換、顛換、插入或缺失，並且其在群體中出現的頻率≥1％，稱為單核苷酸多態性(snp)，基因多態性與某些基因組dna的修復功能有關，多態性可以顯著影響個體對藥物的敏感性，分子水平的疾病診斷可對腫瘤個體化治療和預後判斷提供指導。多藥耐藥1(mdr1)基因編碼p-糖蛋白，它是人體藥物轉運中最重要的轉運體，在腫瘤藥物多耐藥發生中起著主要作用，腫瘤細胞對多種化療藥物產生交叉耐藥性是造成腫瘤化療失敗的主要原因。mdr1(c3435t)是mdr1與p-gp表達相關的多態性位點，研究表明p-gp的表達在三種基因型的個體中從高至低依次為cc>tc>tt，cc基因型的患者p-gp表達水平較高，對人體抵抗病原體的侵害時有利的。臨床上通過檢測mdr1的基因多態性，有助於幫助乳腺癌患者預測蒽環藥物或者聯合泰素治療療效，指導用藥和個性化治療。目前主要測採用一代測序、flp、等位基因特異的寡核苷酸雜交、等位基因特異的pcr和基因晶片等技術，但是操作過程繁瑣，需要更換反應管而易發生汙染，多需要電泳和多步後處理，影響檢測結果的準確性。或儀器設備昂貴，難以大規模推廣應用。傳統的巢式pcr反應由於有2次pcr擴增，不但耗時、開管操作極易造成交叉汙染導致假陽性及結果的不準確性，而檢測結果需要電泳及凝膠成像系統才能看到結果，從而降低了擴增多個靶點的可能性，從pcr到檢測結果出來大約需要5h，主要應用於分子生物學領域和醫學檢測研究中。技術實現要素：本發明要解決的技術問題是提供一種能在樣本初始模板量低的條件下準確檢測出樣本基因mdr1的c3435t多態位點的基因型的mdr1基因多態性檢測試劑盒，以及該試劑盒所用的檢測體系。本發明為解決上述技術問題提出的一種技術方案是：一種mdr1基因多態性檢測體系，包括檢測引物對、檢測探針和肽核酸，所述檢測引物對包括檢測mdr1基因c3435t多態性位點外側的核苷酸序列如seqidno.1所示的外側上遊引物、檢測mdr1基因c3435t多態性位點外側的核苷酸序列如seqidno.2所示的外側下遊引物、檢測mdr1基因c3435t多態性位點內側的核苷酸序列如seqidno.3所示的內側上遊引物、檢測mdr1基因c3435t多態性位點內側的核苷酸序列如seqidno.4所示的內側下遊引物；所述外側上下遊引物引入脫氧次黃嘌呤；所述檢測探針包括檢測mdr1基因c3435t多態性位點為野生型的核苷酸序列如seqidno.7所示的野生型探針和檢測mdr1基因c3435t多態性位點為純合子的核苷酸序列如seqidno.8所示的純合子探針；所述野生型探針和純合子探針引入脫氧次黃嘌呤和錯配鹼基；所述肽核酸包括與檢測mdr1基因c3435t多態性位點的內側上遊引物部分互補的核苷酸序列如seqidno.5所示的肽核酸和與檢測mdr1基因c3435t多態性位點的內側下遊引物部分互補的核苷酸序列如seqidno.6所示的肽核酸。上述mdr1基因多態性檢測體系還包括內參引物對、內參探針、質控引物對和質控探針；所述內參引物上遊引物的核苷酸序列如seqidno.9所示，所述內參下遊引物的核苷酸序列如seqidno.10所示，所述內參探針的核苷酸序列如seqidno.11所示；所述質控上遊引物的核苷酸序列如seqidno.12所示，所述質控下遊引物的核苷酸序列如seqidno.13所示，所述質控探針的核苷酸序列如seqidno.14所示。上述各個探針的5』端設有螢光報告基團，所述各個探針的3』端設有螢光淬滅基團；所述螢光報告基團是fam、hex、rox或cy5，所述螢光淬滅基團是bhq1、bhq2或tamra。上述外側上下遊引物在反應體系中的最終濃度0.05μm/l，所述內側上下遊引物在反應體系中的最終濃度0.19μm/l，所述肽核酸在反應體系中的最終濃度為1nm/l，所述野生型探針在反應體系中的最終濃度為0.19μm/l，所述純合子探針在反應體系中的最終濃度為0.19μm/l；所述質控引物對在反應體系中的最終濃度為0.19μm/l，所述內參引物對在反應體系中的最終濃度為0.19μm/l，所述內參探針在反應體系中的最終濃度為0.19μm/l，所述質控探針在反應體系中的最終濃度為0.19μm/l。上述mdr1基因多態性檢測體系還包括甲醯胺，反應體系中加入甲醯胺的體積是反應體系總體積的12％。本發明為解決上述技術問題提出的另一種技術方案是：一種採用上述檢測體系的mdr1基因多態性檢測產品。本發明為解決上述技術問題提出的另一種技術方案是：一種mdr1基因多態性檢測試劑盒，包括pcr檢測液、質控檢測液、陽性對照和陰性對照；所述pcr檢測液包括檢測引物對、檢測探針和肽核酸；所述檢測引物對包括檢測mdr1基因c3435t多態性位點外側的核苷酸序列如seqidno.1所示的外側上遊引物、檢測mdr1基因c3435t多態性位點外側的核苷酸序列如seqidno.2所示的外側下遊引物、檢測mdr1基因c3435t多態性位點內側的核苷酸序列如seqidno.3所示的內側上遊引物、檢測mdr1基因c3435t多態性位點內側的核苷酸序列如seqidno.4所示的內側下遊引物；所述外側上下遊引物引入脫氧次黃嘌呤；所述檢測探針包括檢測mdr1基因c3435t多態性位點為野生型的核苷酸序列如seqidno.7所示的野生型探針和檢測mdr1基因c3435t多態性位點為純合子的核苷酸序列如seqidno.8所示的純合子探針；所述野生型探針和純合子探針引入脫氧次黃嘌呤和錯配鹼基；所述肽核酸包括與檢測mdr1基因c3435t多態性位點的內側上遊引物部分互補的核苷酸序列如seqidno.5所示的肽核酸和與檢測mdr1基因c3435t多態性位點的內側下遊引物部分互補的核苷酸序列如seqidno.6所示的肽核酸；所述質控檢測液包括內參引物對、內參探針、質控引物對和質控探針；所述內參引物上遊引物的核苷酸序列如seqidno.9所示，所述內參下遊引物的核苷酸序列如seqidno.10所示，所述內參探針的核苷酸序列如seqidno.11所示；所述質控上遊引物的核苷酸序列如seqidno.12所示，所述質控下遊引物的核苷酸序列如seqidno.13所示，所述質控探針的核苷酸序列如seqidno.14所示；所述陽性對照液是濃度為野生型質粒和純合子質粒的混合溶液；所述陰性對照液是濃度為不含mdr1基因野生型、雜合子和純合子的質粒溶液。上述pcr檢測液和質控檢測液中還包括pcr緩衝液、2.5mm的dntps和5u/μl的taqdna聚合酶；所述pcr緩衝液包括100mm的tris-hcl、15mm的kcl和15mm的mgcl2，用於配置所述pcr緩衝液的tris-hcl緩衝液的ph值為8.3；所述dntps包括datp、dgtp、dctp和dttp。上述外側上下遊引物在反應體系中的最終濃度0.05μm/l，所述內側上下遊引物在反應體系中的最終濃度0.19μm/l，所述肽核酸在反應體系中的最終濃度為1nm/l，所述野生型探針在反應體系中的最終濃度為0.19μm/l，所述純合子探針在反應體系中的最終濃度為0.19μm/l；所述質控引物對在反應體系中的最終濃度為0.19μm/l，所述內參引物對在反應體系中的最終濃度為0.19μm/l，所述內參探針在反應體系中的最終濃度為0.19μm/l，所述質控探針在反應體系中的最終濃度為0.19μm/l。上述mdr1基因多態性檢測試劑盒還包括甲醯胺，反應體系中加入甲醯胺的體積是反應體系總體積的12％。本發明具有積極的效果：(1)本發明的mdr1基因多態性檢測體系及其試劑盒，採用特異引物探針組合，採用改進後的巢氏pcr，增加了檢測的敏感性和可靠性，閉管操作降低汙染，具有高的靈敏度，靈敏度可達到0.5％～1％，與常規pcr的濃度相比，辦發明容易地檢測出非常低濃度樣本的mdr1(c3435t)位點的基因型，可以為蒽環類藥物的臨床用藥提供指導。(2)本發明的保留了原有的螢光定量的高敏感性和特異性的基礎上，極大地縮短了實驗時間，提高檢測效率，節約樣本，並且本發明的基因多態性檢測試劑盒，採用金標準進行對照實驗，基因型符合率≥99％，分子分型準確度高。(3)本發明設計了內參和質控對檢測的整個檢測過程監控，確保樣本可檢測結果的準確性與可靠性。附圖說明圖1採用實施例的試劑盒檢測陽性對照擴增曲線。圖2採用實施例的試劑盒檢測野生樣本擴增曲線。圖3採用實施例的試劑盒檢測純合樣本擴增曲線。圖4採用實施例的試劑盒檢測雜合樣本擴增曲線。具體實施方式下面通過實施例對本發明進行具體的描述，有必要在此指出的是以下實施例只用於對本發明進行進一步說明，不能理解為對本發明保護範圍的限制，該領域的技術人員可以根據上述本
發明內容對本發明作出一些非本質的改進和調整。下述實施例中，若非特意表明，所用的試劑均為分析純，所用試劑均可從商業渠道獲得。文中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如j.薩姆布魯克等編著的科學出版社2002年出版的《分子克隆實驗指南》一書中所述的條件，或按照製造商所建議的條件。除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用於本發明中。實施例一、試劑盒的組成。本實施例的mdr1(c3435t)基因多態性檢測試劑盒包括：pcr檢測液、質控檢測液、陽性對照、陰性對照，具體成分如表1所示。表1試劑盒組成表上述表1中試劑盒各組分的說明如下：pcr檢測液由10×pcr緩衝液、dntps、熱啟動酶、引物對、探針和肽核酸混合液配製而成。10×pcr緩衝液包括100mm的tris-hcl、500mm的kcl和15mm的mgcl2，用於配置pcr緩衝液的tris-hcl緩衝液的ph值為8.3。dntps包括datp、dgtp、dctp和dttp，在反應體系中終濃度為0.2mm。熱啟動酶是使用濃度為5u/μl的taqdna聚合酶，在反應體系中終濃度0.05u/μl。10×pcr緩衝液、dntps和熱啟動酶均來自takara(貨號：r007a)。引物探針肽核酸混合液包括檢測mdr1(c3435t)的外側上遊引物、檢測mdr1(c3435t)的外側下遊引物、檢測mdr1(c3435t)的內側上遊引物、檢測mdr1(c3435t)的內側下遊引物、針對mdr1(c3435t)的內側上遊引物的肽核酸、針對mdr1(c3435t)的內側下遊引物的肽核酸、檢測mdr1(c3435t)的野生型探針、檢測mdr1(c3435t)的純合子探針，序列見表2，均由上海百力格生物技術有限公司合成。外側引物在反應體系中的最終濃度為0.05μm/l，內側引物在反應體系中的最終濃度為0.19μm/l，肽核酸在反應體系最終的濃度為1nm/l，檢測mdr1(c3435t)野生型探針和檢測mdr1(c3435t)純合子探針在最終反應體系中的最終濃度為0.19μm/l。為了減少非特異性擴增，提高檢測的特異性和靈敏度，在本發明的檢測反應體系中加入12％甲醯胺試劑。質控液由10×pcr緩衝液、dntps、熱啟動酶、引物對和探針混合液配製而成。10×pcr緩衝液包括100mm的tris-hcl、500mm的kcl和15mm的mgcl2，用於配置pcr緩衝液的tris-hcl緩衝液的ph值為8.3。dntps包括datp、dgtp、dctp和dttp，在反應體系中終濃度為0.2mm。熱啟動酶是使用濃度為5u/μl的taqdna聚合酶，在反應體系中終濃度0.05u/μl。10×pcr緩衝液、dntps和熱啟動酶均來自takara(貨號：r007a)。引物探針混合液包括檢測內參上遊引物、檢測內參的下遊引物、檢測內參的探針、檢測質控上遊引物、檢測質控下遊引物、檢測質控的探針，序列見表2，引物、探針及肽核酸均由上海生工生物工程有限公司合成。內參引物和探針在反應體系的最終濃度為0.19μm/l，質控引物和探針在反應體系的最終濃度為0.19μm/l。為了減少非特異性擴增，提高檢測的特異性和靈敏度，在本發明的質控反應體系中加入12％甲醯胺試劑。陽性對照液是濃度為10ng/μl的野生型質粒和10ng/μl的純合子質粒的混合溶液。陰性對照液是濃度為10ng/μl不含mdr1基因野生型、雜合子和純合子的質粒溶液。野生型質粒的獲取為野生型質粒常規構建步驟：設計位於突變位點兩側的引物，擴增含對應位點的野生型產物，構建入質粒，挑選並測序驗證。純合子質粒的獲取為純合子質粒常規構建步驟：設計一條覆蓋相應多態性位點並將等位鹼基引入到引物序列中的特異引物，與相對應的上遊或下遊野生型引物配對，擴增含相應位點的目的片段產物，構建入質粒，挑選並測序驗證。上遊引物、下遊引物、探針和肽核酸的核苷酸序列如表2所示。表2引物、探針、肽核酸序列表引物探針名稱seqno.核苷酸序列(5』-3』)mdr1外側上遊引物1gtgagggcagcaaaggaggccmdr1外側下遊引物2ggcctcctttgctgccctcacmdr1內側上遊引物3tgctgagaacattgcctatgmdr1內側下遊引物4cattaggcagtgactcgatgamdr1內側上遊肽核酸5gaacattgcctatgmdr1內側下遊肽核酸6aggcagtgactcgamdr1野生型探針7ggtggtgtcacaggaagtgatcmdr1純合子探針8ggtggtgtcacaggaagcgatt內參上遊引物9tgtaggagggacttagagaag內參下遊引物10accctttagggagaaaacgct內參探針11cctgccctttgagtttgatgat質控上遊引物12gcctgtaatcccagctacttg質控下遊引物13ggagtgcagtggcatgatctc質控探針14tgaggtacgagaattgcttgmdr1外側引物是針對mdr1(c3435t)多態性位點兩側產物長度約300-500bp的引物，mdr1內側引物是針對mdr1(c3435t)多態性位點兩側產物長度約90-150bp的引物，為了使外側引物先於內側引物與dna模板結合，外側引物引入脫氧次黃嘌呤，mdr1內側肽核酸是針對mdr1(c3435t)多態性位點內側的上遊引物和內側下遊引物設計的dna類似物，肽核酸部分序列與內側引物重合，能夠先於內側上遊引物與dna模板結合，從而在反應初始階段抑制了內側引物的擴增，mdr1野生型探針和mdr1純合子探針是針對mdr1(c3435t)多態性位點設計的特異性探針，探針的5』端標記有螢光信號基團，螢光信號基團有fam、hex、rox、cy5等，探針的3』端標記有螢光淬滅基團，螢光淬滅基團包括bhq1、bhq2、tamra等，由於野生型探針和純合子探針序列只相差一個鹼基，特異性較低，本發明將脫氧次黃嘌呤引入到檢測多態性檢測特異性探針中，並在探針的3』端引入1個錯配鹼基，在一定程度上提高探針的特異性。本實施例的野生型探針的螢光信號基團是fam，純合子探針的螢光信號基團是hex。內參引物探針是區別於mdr1的gapdh基因，通過檢測內參基因的擴增，可分析實驗結果有效性。質控基因的引物設計是排除mdr1基因外側引物以外的mdr1基因其他位置保守區域，質控引物探針不享受突變檢測位點引物和引物結合位點，在保守區域不同區段設計引物探針，質控序列擴增在本發明中作用除了可校正諸如dna含量、標本內pcr聚合酶抑制物，不同反應管間擴增效率的差異，還用於通過比較基因型和質控的擴增情況確定樣本基因型。二、試劑盒的使用方法。本實施例的mdr1(c3435t)基因多態性檢測試劑盒的具體檢測步驟如下：1、樣本dna提取。採用試劑盒(axygenmultisourcegenomicdnaminiprepkit)提取樣本血液樣本dna，或者採用康為世紀生物科技有限公司的口腔拭子基因組dna提取試劑盒(貨號：cw0530s)抽提口腔黏膜樣本dna，具體的操作參見試劑盒產品說明書。2、樣本dna質量檢測。獲得樣本dna後，通過thermo-fisher核酸蛋白定量儀(nanodrop2000)測定濃度和純度，控制樣本質量，最終加入反應體系中的樣本。od260/od280的比值在1.8～2.0之間的可獲得最優反應結果，濃度稀釋為5～20ng/μl。3、pcr反應。採用本實施例的mdr1(c3435t)基因多態性檢測試劑盒試進行檢測，反應體系的體積為10μl，試劑盒各組分的使用濃度及在反應體系中的終濃度詳見表1。(反應體系的體積還可以是20μl，在配製時將10μl反應體系中的組分翻倍即可)。1)配製10μl的質控pcr反應體系和10μl的檢測pcr反應體系：質控pcr反應體系：取9μl的質控檢測液和1μl樣本dna。檢測pcr反應體系：別取9μl的檢測試劑和1μl模板(如果是dna樣本，濃度5～20ng/μl)，並設置重複。反應體系中的模板分別指對應的樣本dna，陽性對照，陰性對照，空白對照，空白對照液為超純水。2)pcr反應程序。各反應體系在abi實時螢光定量pcr擴增儀(stepone)上進行實時螢光pcr反應，最優反應程序如表3所示。表3pcr反應程序表優選地，pcr擴增的條件為：預變性階段的條件95℃，10min；循環1，10個循環，條件為95℃15s，退火溫度55℃，時間為10秒，延伸溫度72℃，時間30秒；循環2，30個循環，條件為94℃15s，退火溫度60℃，時間為10秒；循環3條件為4℃保溫。本發明為了防止循環段2較長的片段的非特異性擴增，不設置延伸程序。4、pcr結果判定。1)試劑盒有效性的判定。陽性對照：陽性對照fam和hex信號通道所有的擴增曲線有明顯的指數增長期，且ct值均陽性≤25。陰性對照：陰性對照fam、hex信號通道所有的擴增曲線無明顯的指數增長期，或ct值均陰性≥40。空白對照：空白對照陰性對照fam、hex信號通道所有的擴增曲線無明顯的指數增長期。2)檢測樣本有效性的判定。根據內參fam通道和質控hex通道的ct值進行判定：內參gapdh的fam信號通道擴增曲線呈s型，但ct32，檢測結果無效；內參gapdh的fam信號通道擴增曲線不呈s型，但且18≤ct≤32之間，樣本檢測結果無效；內參gapdh的fam信號通道擴增曲線呈s型，並且18≤ct≤32之間，樣本有效。質控mdr1的hex信號通道擴增曲線呈s型，且ct＜20，則樣本基因組加入過量，建議稀釋後重新檢測；質控mdr1的hex信號通道擴增曲線呈s型，20≤ct≤30，樣本加入量適中，適合進行結果判定；質控mdr1的hex信號通道擴增曲線呈s型，ct＞30,則樣本基因組加入量低，不能穩定的進行突變結果判定。3)多態性結果的判定。通過以上步驟，確定檢測樣本和實驗結果均有效的前提下，再對樣本的結果進行判定。野生基因型檢測是檢測反應液中fam信號通道的擴增情況，純合基因型檢測是檢測反應液中hex信號通道的擴增情況。按照以下步驟對樣本檢測結果進行判讀，確定樣本基因型。a.若檢測液中有fam信號通道的擴增曲線有明顯的指數增長期，hex信號通道的擴增曲線無明顯的指數增長期，且20≤ct≤35，則檢測樣本為野生型。b.若檢測液中有hex信號通道的擴增曲線有明顯的指數增長期，fam信號通道的擴增曲線無明顯的指數增長期，且20≤ct≤35，則檢測樣本為純合型。c.若檢測液中有fam和hex信號通道的擴增曲線均有明顯的指數增長期，且|ct(檢測fam)-ct(檢測hex)|≤5，則檢測樣本為雜合型。d.若檢測液中有fam和hex信號通道的擴增曲線均有明顯的指數增長期，|ct(檢測fam)-ct(檢測hex)|>5，則將檢測的較小的ct值與質控ct比較，兩者之間的差記做△△ct，若△△ct＝|ct(檢測fam/hex)-ct(質控hex)|≤7，則為ct值較小檢測結果基因型，若△△ct＝|ct(檢測fam/hex)-ct(質控hex)|>7,重新檢測。顯然，上述實施例僅僅是為清楚地說明本發明所作的舉例，而並非是對本發明的實施方式的限定。對於所屬領域的普通技術人員來說，在上述說明的基礎上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這裡無需也無法對所有的實施方式予以窮舉。而這些屬於本發明的精神所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處於本發明的保護範圍之中。sequencelisting上海賽安生物醫藥科技股份有限公司mdr1基因多態性檢測體系及其試劑盒無14patentinversion3.3121dna人工合成1gtgagggcagcaaaggaggcc21221dna人工合成2ggcctcctttgctgccctcac21320dna人工合成3tgctgagaacattgcctatg20421dna人工合成4cattaggcagtgactcgatga21514dna人工合成5gaacattgcctatg14614dna人工合成6aggcagtgactcga14722dna人工合成7ggtggtgtcacaggaagtgatc22822dna人工合成8ggtggtgtcacaggaagcgatt22921dna人工合成9tgtaggagggacttagagaag211021dna人工合成10accctttagggagaaaacgct211122dna人工合成11cctgccctttgagtttgatgat221221dna人工合成12gcctgtaatcccagctacttg211321dna人工合成13ggagtgcagtggcatgatctc211420dna人工合成14tgaggtacgagaattgcttg20當前第1頁12