核酸擴增方法以及在該方法中使用的試劑和試劑套件的製作方法

2023-06-01 14:49:26 2

專利名稱：核酸擴增方法以及在該方法中使用的試劑和試劑套件的製作方法
技術領域：
本發明涉及樣品中核酸的擴增方法和在該方法中使用的試劑。更具體而言，本發 明涉及使用內標物的擴增方法。
背景技術：
作為能夠檢測樣品中的微量核酸的方法，多種核酸擴增方法得到了開發。在此之 中能夠在等溫條件下高效率地進行擴增的方法(LAMP法等)，作為使用沒有溫度控制功能 的低成本裝置就能夠簡易而迅速地進行檢測的技術，在廣範圍的檢測現場中得到應用。本發明人等報導了不使用內標物的LAMP法的檢測系統，能夠對於在IO3 IO9拷 貝/測試的濃度範圍的核酸進行定量(非專利文獻1)。但是因為該方法中不使用內標物， 所以得到的結果是靶核酸的相對量。一方面，在LAMP法中使用內標物的定量法得到了報導(非專利文獻2)。這個方法 是使用與靶核酸具有類似序列的內標物，將靶核酸和內標物同時進行擴增的方法。該方法 能夠進行定量的濃度範圍窄，為IO4 IO8拷貝/測試，因此為了對廣泛濃度範圍的核酸進 行測定，需要將樣品稀釋進行多次測定。非專禾U 文獻 1 :Y. Mori, et al. , Journal of Biochemical and BiophysicalMethods,59,145—157，2004非專利文獻2 :H. Tani，et al. , Analytical Chemistry, 79 (15), 5608-5613, 2007

發明內容
在使用內標物的檢測系統中，因內標物的擴增產物影響靶核酸的擴增反應而無法 精確地測定靶核酸，這是在擴增效率高的等溫核酸擴增方法中存在的共性問題。本發明的 課題是提供解決了所述問題的、在能夠確保對靶核酸的精確測定值的同時對內標物穩定進 行擴增的方法，以及在該方法中使用的試劑。本發明人等為了解決所述課題進行了深入探討的結果，發現了不在相同時期進行 內標物和靶核酸的擴增反應，也就是說，提前或滯後於靶核酸擴增反應而進行內標物的擴 增反應，能夠防止內標物的擴增產物對靶核酸擴增反應的影響，從而完成了本發明。也就是說，本發明提供了以下的(1) (9)。(1) 一種核酸擴增方法，其特徵在於使內標物提前於靶核酸進行擴增。(2)所述(1)所記載的核酸擴增方法，其特徵在於包括以下工序(a)向含有靶核酸的樣品中添加溶液的工序，該溶液中含有已知濃度或拷貝數的 內標物，(b)使用擴增反應液進行擴增反應的工序，該擴增反應液含有用於擴增內標物的 寡核苷酸引物(以下稱為「內標引物」)和用於擴增靶核酸的寡核苷酸引物(以下稱為「靶 核酸引物」)，所述內標引物能夠在一定條件下，使所述內標物在早於靶核酸擴增的時期進 行擴增，
(c)通過能夠分辨所述內標物的擴增反應和所述靶核酸的擴增反應的方法，進行 測定的工序。(3)所述(1)或(2)所記載的核酸擴增方法，其特徵在於進行靶核酸的定量。(4)所述(1)所記載的核酸擴增方法，其特徵在於包括以下工序(a)向含有靶核酸的樣品中添加溶液的工序，該溶液中含有已知濃度或拷貝數的 內標物，(b)使用擴增反應液進行擴增反應的工序，該擴增反應液含有用於擴增內標物的 寡核苷酸引物(以下稱為「內標引物」)和用於擴增靶核酸的寡核苷酸引物(以下稱為「靶 核酸引物」)，所述內標引物能夠在一定條件下，使所述內標物在早於靶核酸擴增的時期進 行擴增，(c)通過能夠分辨所述內標物的擴增反應和所述靶核酸的擴增反應的方法，進行 實時測定，根據其結果和內標物的添加量，計算樣品中的初始靶核酸濃度或拷貝數的工序。(5)所述(1)至(4)中任意一項所記載的核酸擴增方法，其特徵在於內標物至少在 弓I物設計區域內具有與靶核酸不同的鹼基序列。(6)所述(5)所記載的核酸擴增方法，其特徵在於內標引物設計為在一定條件下 與內標物進行特異性雜交而不與靶核酸雜交；並且，靶核酸引物設計為在所述一定條件下 與靶核酸進行特異性雜交而不與內標物雜交。(7)所述(5)或(6)所記載的核酸擴增方法，其特徵在於擴增反應使用LAMP法。(8) 一種測試試劑或試劑套件，其特徵在於是用於實施根據(1)至(7)中任意一項 所述的核酸擴增方法的。(9)所述(8)所記載的測試試劑或試劑套件，其特徵在於至少含有以下的試劑(a)至少在引物設計區域內具有與靶核酸不同的鹼基序列，並且濃度或拷貝數已 知的內標物，(b)在一定條件下能夠在早於靶核酸擴增的時期使內標物進行擴增的內標引物，(c)靶核酸引物。根據本發明，通過提前於靶核酸的反應而進行內標物的擴增反應，能夠在確保對 靶核酸的精確測定值的同時穩定地進行內標物的擴增。也就是說，在定性方法中，使得監測 從各樣品中的提取純化效率和樣品中的成分對擴增反應的影響成為可能。此外，在定量方 法中，能夠在7個數量級以上的廣範圍內對核酸的絕對量進行測定。


圖1是使用IO1至IO7拷貝/測試的各濃度的靶核酸(NG質粒)和內標核酸(CT質 粒)進行LAMP反應，對伴隨靶核酸擴增的淬滅(Quenching)探針的螢光消光使用Mx3000P 進行實時測定時的結果曲線圖。圖2是使用了 NG質粒的標準曲線圖。圖3是使用IO1至IO7拷貝/測試的各濃度的靶核酸(NG質粒)和內標核酸(CT 質粒)進行LAMP反應，對伴隨內標核酸擴增的淬滅探針的螢光消光使用Mx3000P進行實時 測定時的結果曲線圖。圖4是使用IO1至IO8拷貝/測試的各濃度的靶核酸(HBV質粒)和內標核酸
5(Arita2質粒)進行LAMP反應，對伴隨靶核酸擴增的淬滅探針的螢光消光使用Mx3000P進 行實時測定時的結果曲線圖。圖5是使用了 HBV質粒的標準曲線圖。圖6是使用IO1至IO8拷貝/測試的各濃度的靶核酸(HBV質粒)和內標核酸 (Arita2質粒)進行LAMP反應，對伴隨內標核酸擴增的淬滅探針的螢光消光使用Mx3000P 進行實時測定時的結果曲線圖。圖7是顯示當內標物的模板濃度為ΙΟ2、104、IO6拷貝/測試時，靶核酸(HBV質粒) 以及內標核酸(Arita2質粒)的擴增時間變化的曲線圖。圖8是顯示在內標引物濃度為Xl和在低濃度引物(X0. 25、X0. 3、X0. 5)條件 下靶核酸(HBV質粒)和內標核酸(Arita2質粒)的擴增時間變化的曲線圖。圖9是顯示試劑成分AXl和高濃度試劑成分AX 1.2時，靶核酸(HBV質粒)和內 標核酸(Arita2質粒)的擴增時間變化的曲線圖。圖10是顯示使內標核酸(CT質粒；I. C.)和NG質粒的高濃度模板(NG_H)在同一 反應液中進行擴增的曲線圖。圖11是顯示使內標核酸(CT質粒；I. C.)和NG質粒的低濃度模板(NG_L)在同一 反應液中進行擴增的曲線圖。本說明書包括在本申請的優先權基礎文件日本專利申請2007-271902號說明書 中所記載的內容。
具體實施例方式本發明的核酸擴增方法，其特徵在於使內標物提前或滯後於靶核酸而進行擴增。 提前進行擴增，指的是比靶核酸模板的擴增開始更早地，使來源於內標物的擴增反應開始 進行。因此，需要設計出在早的時期(提前)進行擴增的內標引物。內標引物，是指用於擴 增內標物的寡核苷酸引物。一般來講，用於設計在早的時期進行擴增的引物的、特殊的設計 條件還沒有被確立。因此，在使用專用軟體等採用通常方法設計的引物中選擇在早的時期 進行擴增的引物，作為內標引物。滯後進行擴增，指的是比靶核酸模板的擴增開始更晚地，使來源於內標物的擴增 反應開始進行。因此，需要設計在晚的時期(滯後)進行擴增的內標引物。為此，在使用專 用軟體等採用常規方法設計的引物中選擇在晚的時期進行擴增的引物，作為內標引物。此外，在等溫核酸擴增方法中，一般來講存在隨著靶核酸濃度的升高擴增時期變 早的傾向。因此，為了使內標物在早的時期進行擴增，需要使內標物為高濃度。另一方面， 為了使內標物在晚的時期進行擴增，需要使內標物為低濃度。也就是說，在本發明中為了使內標物在早的時期(提前)進行擴增，和與靶核酸同 時擴增而進行測定時的擴增反應液相比，將內標物濃度設定得高，優選設定為10倍以上， 進一步優選設定為100倍以上。另一方面，為了使內標物在晚的時期(滯後)進行擴增，和 與靶核酸同時擴增而進行測定時的擴增反應液相比，將內標物濃度設定得低，優選設定為 0. 1倍以下，進一步優選設定為0. 01倍以下。在本發明中使用的內標物，只要是至少在引物設計區域內與靶核酸具有不同鹼基 序列的核酸即可，沒有特殊限制。作為這樣的核酸，可以列舉天然來源的核酸，以及部分地或完全由人工合成的核酸等。通過使本發明的內標引物濃度低於通常情況(單一核酸的檢測系統)，能夠抑制 內標物擴增產物量而提高靶核酸的檢測精度。此外，通過使核酸合成的底物核苷酸濃度高 於通常情況，在內標物的擴增反應中消耗的底物得以補償，靶核酸的擴增滯後得以消除，從 而能夠更加高靈敏度地、在更短時間內進行檢測。也就是說，在本發明中，為了使內標物在早的時期(提前)進行擴增，與使內標物 與靶核酸同時擴增而進行測定時的擴增反應液相比，內標引物濃度設定得低，優選設定為 不到1倍，進一步優選設定為0. 5倍以下。通過這樣能夠控制內標物的擴增產物量，提高靶 核酸的測定精度。此外，在本發明中，為了使內標物在早的時期(提前)進行擴增，和不使用內標物 而使相同的靶核酸擴增來進行測定時的擴增反應液相比，核酸合成的底物核苷酸濃度設定 得高，優選設定為超過1倍，進一步優選設定為1.1倍以上。通過這樣能夠使在內標物的擴 增反應中消耗的底物得以補償，靶核酸的擴增滯後得以消除，從而能夠更加高靈敏度地、在 更短時間內進行檢測。本領域技術人員可以對以上記載的反應試劑成分的條件進行適當調節，使內標物 得以提前擴增。此外，本發明的內標引物設計為在嚴格條件下與內標物進行特異性雜交而與靶核 酸不發生雜交；並且，靶核酸引物設計為在與所述相同的嚴格條件下與靶核酸進行特異性 雜交而與內標物不發生雜交。嚴格條件，指的是形成特異性雜交體而不形成非特異性雜交體的條件，也就是與 各核酸具有高度同源性(同源性為80%以上，優選為90%以上，進一步優選為95%以上) 的寡核苷酸發生雜交的條件。更加具體地說，這樣的條件可以舉例為在0. 5 IM的NaCl 存在下42 68°C、或在50%甲醯胺存在下42 °C、或在水溶液中65 68 °C進行雜交後，使 用0. 1 2倍濃度的SSC溶液在室溫 68°C條件下進行清洗的條件。在一個實施方式中，本發明的核酸擴增方法包括以下工序(a)向含有靶核酸的樣品中添加溶液的工序，該溶液中含有已知濃度或拷貝數的 內標物，(b)使用擴增反應液進行擴增反應的工序，該擴增反應液含有用於使內標物擴增 的寡核苷酸引物和用於使靶核酸擴增的寡核苷酸引物，所述用於使內標物擴增的寡核苷酸 引物能夠在早於靶核酸擴增的時期(提前)使所述內標物進行擴增，(c)通過能夠分辨所述內標物的擴增反應和所述靶核酸的擴增反應的方法，進行 測定的工序。在另一實施方式中，本發明的核酸擴增方法包括以下工序(a)向含有靶核酸的樣品中添加溶液的工序，該溶液中含有已知濃度或拷貝數的 內標物，(b)使用擴增反應液進行擴增反應的工序，該擴增反應液含有用於使內標物擴增 的寡核苷酸引物和用於使靶核酸擴增的寡核苷酸引物，所述用於使內標物擴增的寡核苷酸 引物能夠在早於靶核酸擴增的時期(提前)使所述內標物進行擴增，(c)通過能夠分辨所述內標物的擴增反應和所述靶核酸的擴增反應的方法，進行實時測定，根據其結果和內標物的添加量，計算樣品中的初始靶核酸濃度或拷貝數的工序。在本發明中所用的樣品，只要是有可能含有核酸的樣品即可，沒有特殊限制。作為 樣品，可以舉例為來源於人類或其它動物的活體或來源於植物、食品、環境的待測樣品，含 有部分或完全由人工合成的核酸的樣品，以及它們的培養液等。這些樣品可以進行分離、提 取、濃縮、純化等預處理。本發明中的靶核酸，指的是用於擴增的需要檢測的核酸；靶序列指的是靶核酸上 的作為靶的鹼基序列。靶核酸只要是用於擴增的任意核酸即可，沒有特殊限制。動植物的 各種基因、各種病毒的基因、細菌、黴菌、酵母等的各種微生物基因等，無論DNA或RNA均可 以作為靶核酸。靶核酸可以是天然的，也可以是人工合成的，也包括PNA等。此外，靶核酸 包括單鏈核酸和雙鏈核酸這二者。本發明中的模板核酸指本來的檢測對象，其分子中含有 靶序列，是引物設計的基礎。通過在進行分離、提取、濃縮、純化等預處理之前在樣品中添加內標物，並在預處 理之後實施本發明的方法來進行靶核酸的檢測，能夠監測預處理法的效率。此外，在預處理 後的樣品中添加內標物而進行靶核酸的定性檢測時，可以查出樣品中的成分對於擴增反應 的影響，從而能夠分辨假陰性。此外，使用各種已知濃度的靶核酸實施本發明的方法來預先 繪製標準曲線，再將未知的待測樣品的測定結果與該標準曲線相比較，能夠對未知的待測 樣品中的靶核酸進行定量。本發明中檢測核酸的方法，只要能夠分辨內標物和靶核酸的擴增反應即可，沒有 特殊限制。例如，可以採用使用螢光標記探針、放射性標記探針等的方法。本發明中的核酸擴增方法，只要是擴增效率高的等溫核酸擴增方法即可，沒有特 殊限制，例如適合採用使用具有X1 c+X2結構的引物的擴增方法或LAMP (Loop-mediated isothermal amplification，環介導等溫擴增)法。對使用具有Xlc+X2結構的引物的擴增方法說明如下。具有Xlc+X2結構的引物， 具體來講是如下設計的。(a)當從模板核酸鏈上的靶序列的3』側起向著該模板核酸鏈上的3'末端方向， 依次選擇了第1任意序列Flc和第2任意序列F2c時，按照從5』側到3』側的順序，含有與 該Flc相同的序列和與該F2c互補的序列F2的引物；(b)當從模板核酸鏈上的靶序列的5』側起向著該模板核酸鏈上的5'末端方向， 依次選擇了第3任意序列Rl和第4任意序列R2時，按照從5』側到3』側的順序，含有與該 Rl互補的序列Rlc和與該R2相同的序列R2的引物。此外，所述引物(a) (b)可以成對使用，也可以將(a) (b)中的任意一個與通常的引 物成對使用。擴增反應可以使用鏈置換型DNA聚合酶作為聚合酶在等溫條件下進行。因為引物 具有Xlc+X2的結構，始於該引物的延伸產物包括Xlc+(X2+)X1，其中下劃線部分為互補序 列，進一步進行鏈內退火而在合成的雙鏈核酸上生成單鏈部分。也就是說，即使不使雙鏈在 高溫條件下發生解離，在延伸產物上也會有鏈內退火而形成的新的鏈置換反應起點。此反 應的概況可以參考後述的LAMP法。此外，作為所述的鏈置換型DNA聚合酶，例如可以舉例為Bst DNA聚合酶、 Bca (exo-) DNA聚合酶、大腸桿菌DNA聚合酶I的克列諾片段(KlenowFragment)、Vent
8DNA聚合酶、Vent (Exo-) DNA聚合酶(從Vent DNA聚合酶除去核酸外切酶活性的產物)、 DeepVent DNA聚合酶、De印Vent (Exo_) DNA聚合酶(從De印Vent DNA聚合酶除去核酸外切 酶活性的產物)、Φ 29噬菌體DNA聚合酶、MS-2噬菌體DNA聚合酶、Z-Taq DNA聚合酶(廠 商日本寶酒造)、KOD DNA聚合酶(廠商日本東洋紡)等。以下對LAMP法進行說明。所謂「LAMP法」是納富等人開發的技術(Nucleic Acids Research, 28 (12)，e63, 2000)，是通過使作為模板的核苷酸與自身的3 『末端退火而作為互 補鏈合成的起點的同時，使此時形成的環和與之退火的引物相組合，從而能在等溫下進行 互補鏈合成的核酸擴增方法。此外，在LAMP法中，引物的3'末端始終與來源於樣品的區域 退火，因此鹼基序列的互補性結合的檢查機制反覆產生作用。其結果，能夠使高特異性的基 因序列的擴增反應成為可能。在LAMP法中，作為引物至少要使用能夠分辨模板核酸的鹼基序列上的共計6個 區域的鹼基序列的，由寡核苷酸所構成的4種引物(內部引物F(以下稱為FIP)、內部引物 B (以下稱為BIP)、外部引物F (以下稱為F3)以及外部引物B (以下稱為B3)，但伴隨著擴增 反應的進行，形成以自己為模板而具有成為合成起點的3'末端，並在其兩端各具有環狀結 構的 鈴型核苷酸。並且，在進一步使用具有與該 鈴結構5'末端側的環結構的單鏈部 分的鹼基序列的互補序列的引物(環引物F(以下稱為LF)以及/或者環引物B (以下稱為 LB)時，核酸合成的起點增加，從而能夠縮短反應時間和使檢測靈敏度提高。內部引物是LAMP法中所必需的引物，其是當在模板DNA的各鏈中，選定了存在於 3，側的任意序列X2c，和與其相比靠近5，側的任意序列Xlc的情況下，按照從3，側到5， 側的順序含有該X2c的互補序列X2和該Xlc的相同序列Xlc (具有Xlc+X2結構)的引物。 從功能上講，內部引物上的X2是與模板發生特異性退火而提供互補鏈合成起點的部分，而 Xlc提供擴增(延伸)產物形成環所需的互補序列。於是，該環成為新的互補鏈的合成起 點ο外部引物是具有與比內部引物位於更外側(也就是模板的3』側)的任意序列X3c 互補的序列，能夠與此退火的2種引物(與2條鏈各自互補的各1種)。此外，為了使引物容易與模板核酸退火，所述Xl (Xlc)、X2(X2c)、X3 (X3c)的長度 優選為5 100個鹼基，進一步優選為10 50個鹼基。所述內部引物和外部引物是2條鏈(F和R)分別需要的，因此分別設計兩種內部 引物(Flc+F2和Rlc+R2)以及兩種外部引物(F3和R3)。優選對各任意序列進行選擇，使得由LAMP法所得到的擴增產物不是優先進行分 子間退火，而是優先進行分子內退火，從而在末端形成髮夾結構。例如，為了優先在分子內 退火，在選擇任意序列時考慮Flc序列和F2c序列之間的距離以及Rl序列和Rlc序列之間 的距離是很重要的。具體來講，優選進行選擇，使得兩序列間隔0 500個鹼基，進一步優 選0 100個鹼基，最優選10 70個鹼基的距離存在。這裡的數值是指分別不包括Flc 序列和F2c序列本身以及Rl序列和R2序列本身的鹼基數。此外，環引物指的是，當在LAMP法的擴增產物的同一鏈上生成的互補序列相互退 火而形成環時，在其3'末端含有與該環內的序列互補的鹼基序列的2種引物(與2條鏈各 自互補的各1種)。所述外部引物和環引物在LAMP法中不是必須的引物，但有這些時能夠 使擴增(延伸)反應更加高效率地進行。
這一系列反應，優選在用於給予酶反應適合的pH值的緩衝劑、用於維持酶活性和 退火所必須的鹽類、酶的保護劑、如需要還可以在解鏈溫度(Tm)的調整劑共存的條件下進 行。緩衝劑可以使用Tris-HCl等具有從中性到弱鹼性的緩衝作用的緩衝劑。pH根據使用 的DNA聚合酶進行調整即可。可以適當添加例如KC1、NaCl, MgCl2或(NH4)2SO4等鹽類，用 於維持酶活性和調整DNA的解鏈溫度(Tm)。酶的保護劑可以使用牛血清白蛋白(albumin) 和糖類等。此外，解鏈溫度(Tm)調整劑一般可以使用甜菜鹼(betaine)、脯氨酸(proline)、 二甲基亞碸或甲醯胺等。LAMP法中的反應是通過對於模板核酸添加以下的成分⑴(ii) (iii)，並且在使 得內部引物能夠與模板核酸上的互補序列形成穩定的鹼基對結合、且鏈置換型聚合酶能夠 維持酶活性的溫度下進行溫育而進行。溫育溫度為50 75°C，優選為55 70°C，溫育時 間為1分鐘 10小時，優選為5分鐘 4小時。(i)2種內部引物，或進一步包括2種外部引物，或進一步包括2種環引物(ii)鏈置換型聚合酶(iii)底物核苷酸從外部引物開始的核苷酸鏈合成，需要在從內部引物開始的核苷酸鏈合成之後開 始。達到這個目的的方法，可以舉例為將內部引物的濃度設定得高於外部引物的濃度等。 具體來講，可以通過將內部引物的濃度設定得比外部引物的濃度高2 50倍，優選設定為 4 25倍來進行實施。在實施本發明的方法時需要的各種試劑，可以預先包裝而使其套件化。例如，可以 將內標物、內標引物、靶核酸引物、作為核酸合成底物的4種dNTPs、DNA聚合酶、逆轉錄酶、 緩衝液、鹽類、保護劑、標記探針等必要試劑作為套件來供應。具體來講，本發明的測試試劑或試劑套件，至少包括以下試劑(a)至少在引物設計區域內具有與靶核酸不同的鹼基序列，並且濃度或拷貝數已 知的內標物，(b)能夠在早於靶核酸擴增的時期使內標物進行擴增的，用於擴增內標物的寡核 苷酸引物，(c)用於擴增靶核酸的寡核苷酸引物。本發明的測試試劑或試劑套件，可以進一步含有以下試劑(a)用於檢測內標物的寡核苷酸探針，和(b)用於檢測靶核酸的寡核苷酸探針。實施例以下給出本發明的實施例，但本發明不局限於這些實施例。實施例1.使用LAMP法進行淋菌(淋菌)的定量(1)檢測模板作為內標物模板，製作了將沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis)的隱蔽性質粒 區域的一部分進行了亞克隆而得到的質粒DNA(以下稱為CT質粒)。此外，作為靶核酸模 板，製作了將淋菌mtrA區域的一部分進行了亞克隆而得到的質粒DNA(以下稱為NG質粒)。內標模板序列(CT質粒)(序列號1)CTCGAGMGA TTTATCGTAC GCAMTATCA TCTTTGCGGTTGCGTGTCCT GTGACCTTCA 60
TTATGTCGGAGTCTGAGCACCCTAGGCGTTTGTACTCCGTCACAGCGGTTGCTCGMGCA120
CGTGCGGGGTTATCTTAAMGGGATTGCAGCTTGTAGTCCTGCTTGAGAGMCGTGCGGG180
CGATTTGCCTTMCCCCACCATTTTTCCGGAGCGAGTTACGMGACAAMCCTCTTCGTT240
GACCGATGTACTCTTGTAGAMGTGCATMACTTCTGAGGATMGTTATAATMTCCTCT300
TTTCTGTCTGACGGTTCTTAAGCTGGGAGAMGAMTGGTAGCTTGTTGGAMCAMTCT360
GACTMTCTCCMGCTTMGACTTCAGAGGAGCGTTTACCTCCTTGGAGCATTGTCTGGG420
CGATCAAC 428
(2)內標引物和淬滅探針的合成
將沙眼衣原體(Chlamydiatrachomatis)的隱蔽性質粒區域作為靶，設計了與近
緣菌沒有交叉性的引物。引物的合成是委託Operon生物技術公司進行的。此外，淬滅探針 的合成是委託J_Bio21公司進行的。
0109]CT-FIP (序列號 2)
0110]5' -CAAGCAGGACTACAAGCTGCAGCGTTTGTACTCCGTCAC-3『
0111]CT-BIP :(序列號 3)
0112]5' -GCGGGCGATTTGCCTTAACTCGGTCAACGAAGAGGTT-3'
0113]CT-F3 (序列號 4) 5 『 -ATGTCGGAGTCTGAGCAC-3 『
0114]CT-B3 (序列號 5) 5 『 -CCTCAGAAGTTTATGCACTTTC-3 『
0115]CT-LF (序列號 6) 5 『 -AAGATAACCCCGCACGT-3 『
0116]CT-LB (序列號 7) 5 『 -GGAGCGAGTTACGAAGACA-3 『
0117]CT-Pr (TAMRA 標記)(序列號 8)
0118]5' -ATAACCCCGCACGTGCTTCGAGCAACC-3『
0119](3)靶核酸引物和淬滅探針的合成
0120]將淋菌的mtrA區域作為靶，設計了與近緣菌沒有交叉性的引物。引物的合成是委 託Operon生物技術公司進行的。此外，淬滅探針的合成，是委託J_Bio21公司進行的。
0121]NG-FIP :(序列號 9)
0122]5' -CGTGGCTCAACACATGACCCAAGCGTCCGGTCGGCA-3'
0123]NG-BIP (序列號 10)
0124]5' -ACGGAGAAAGTTTACAACCGGACACAAAACAGGCTCATATCCAGC-3'
0125]NG-F3 (序列號 11)5' -GCGGTTATCTCTGCATCG-3 『
0126]NG-B3 (序列號 12) 5 『 -GGTGTCGTAGCGGAAAC-3 『
0127]NG-LF (序列號 13) 5 『 -CGGGAAAAATACAATATCGCCC-3 『
0128]NG-LB (序列號 14) 5 『 -CGACAAAACGGCACATTTATGG-3 『
0129]NG-Pr (B0DIPY-FL 標記)(序列號 15)
0130]5' -CACATTTATGGTCAAACAGTG CGGCAAC-3『 0131 ](4) LAMP反應試劑的成分和濃度
0132]調製LAMP最終反應溶液30 μ L，其中各試劑濃度如下。
0133]· 30mM Tris-HCl (ρΗ8· 8)
0134]· 15mM KCl
0135]· 15mM (NH4)2SO4
11
· 12mM MgSO4· 0. 15% Tween20· 2. ImM dATP· 2. ImM dCTP· 2. ImM dGTP· 2. ImM dTTP· 38. 4U Bst DNA 聚合酶(New England Biolab 公司)· IO7拷貝CT質粒·內標引物0. 8μΜ CT-FIP(序列號 2)和 CT-BIP(序列號 3)0. 1 μ M CT-F3 (序列號 4)和 CT-B3 (序列號 5)0. 4 μ M CT-LF (序列號 6)和 CT-LB (序列號 7)· 0. 067 μ M 內標探針 CT-Pr (序列號 8) 靶核酸引物0. 8μΜ NG-FIP(序列號 9)和 NG-BIP(序列號 10)0. ΙμΜ NG-F3(序列號 11)和 NG_B3(序列號 12)0. 4μ M NG-LF(序列號 13)和 NG-LB(序列號 14)· 0. 067 μ M靶核酸探針NG-Pr (序列號15)(5)檢測和計算定量值檢測是使用淬滅探針(Quenching Probe)法進行的。使用Mx3000P (STRATAGENE公 司)，對伴隨內標物和靶核酸的擴增的螢光消光進行了實時測定。定量值是根據Tt值(熒 光強度隨擴增變化而達到特定數值的時間)依賴於初始模板量而進行計算的。(6)靶核酸的定量評價將NG質粒IO1至IO7拷貝的稀釋系列作為靶核酸，添加到所述LAMP反應試劑中。 在63°C進行60分鐘LAMP反應，使用淬滅探針法對螢光消光進行實時測定，繪製了標準曲 線。其結果，最低檢測靈敏度為NG質粒10拷貝/測試(圖1)，定量測定範圍為IO1至 IO7拷貝/測試(標準曲線的相關係數為R = 0.9994)(圖2)。NG質粒和CT質粒均具有良 好的再現性(圖1，3)，此外，NG質粒的IO1至IO7拷貝/測試的所有的擴增均在60分鐘以 內結束。實施例2.使用LAMP法進行HBV的定量(1)檢測模板作為內標物模板，製作了將人工核酸進行了亞克隆而得到的質粒DNA(以下稱為 Arita2質粒)。此外，作為靶核酸模板，製作了將HBV S區域的一部分進行了亞克隆而得到 的質粒DNA (以下稱為HBV質粒)。內標模板序列(Arita2質粒)(序列號16)ATTCGMGGG TGATTGGATC GGAGATAGGA TGGGTCMTCGTAGGGACM TCGMGCCAG 60MTGCMGGG TCMTGGTAC GCAGMTGGA TGGCACTTAGCTAGCCAGTT AGGATCCGAC 120TATCCMGCG TGTATCGTAC GGTGTATGCT TCGGAGTMCGATCGCACTA AGCATGGCTC 180
進行的
MTCCTAGGC ATTCGTACCG ATCACACCCG ATAGCTACCC ATTCCTACGG TTACGTACGC TATGGMCGG (2)內標引物和淬滅探針的合成 將人工核酸Arita2作為靶設計了引物
TGATAGGTTCGCACATAGCATGCCACATACGATCCGTGATTGCTAGCGTG240AGMCTCACGCCTTATGACTGCCCTTATGTCACCGCTTATGTCTCCCGAT300TTATCTCAGCCCTMTCTCTGCGGTTTAGTCTGGCCTTMTCCATGCCTC360TCATACCATCGCTCATACCTTCCGACATTGCATCCGTCATTCCMCCCTG420TCTMCCTAGCCTCTATCCTACCCAGTTAGGTTGCCTCTTAGCATCCCTG480TCTTACCATGCGTCTTACCTTGGCACTATCGATGGGAGTATGGTAGCGAG540ACTMCGTAGGCAGTMGCTAGGGTGTMGGTTGGGACTAAGGATGCCAG600
引物的合成是委託Operon生物技術公司 此外，淬滅探針的合成是委託J_Bio21公司進行的。
淬滅探針(QP)是日本獨立行政法人產業技術綜合研究所開發的螢光標記探針， 其原理在於通過與靶序列進行雜交，靶序列中存在的鳥嘌呤使螢光消光(參考日本專利第 3437816號，日本專利第3985959號)。Arita2-FIP (序列號 17)5 『 -CGCTTGGATAGTCGGATGCAAGGGTCAATGGTAC-3『Arita2-BIP (序列號 18)5 『 -ACGGTGTATGCTTCGGTGTGCGAACCTATCAGC-3『Arita2-F3 (序列號 19) 5 『 -GGACAATCGAAGCCAGAA-3 『
Arita2-B3 (序列號 20) 5 『 -ATCACGGATCGTATGTGG-3 『Arita2-LF (序列號 21) 5' -GCTAGCTAAGTGCCATCC-3 『Arita2-LB (序列號 22) 5 『 -AACGATCGCACTAAGCAT-3 『Arita2-Pr (TAMRA 標記)(序列號 23)5' -GCTAGCTAAGTGCCATCCATTCTGCGTACC-3'(2)靶核酸引物和淬滅探針的合成將HBV的S區域作為靶設計了引物。引物的合成，是委託Operon生物技術公司進 行的。此外，淬滅探針的合成是委託J_Bio21公司進行的。HBV-FIP (序列號 24)5' -CCGCAGACACATCCAGCGATAAACCTCCAATCACTCACCAA-3'HBV-BIP (序列號 25)5' -CATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGTTCCTGGAATTAGAGGACA-3『HBV-F3 (序列號 26) 5 『 -CAAAATTCGCAGTCCC-3 『HBV-B3 (序列號 27) 5 『 -GCAGGTCTTGCATGGTCC-3 『HBV-LF (序列號 28) 5 『 -CAGCGATAGCCAGGACA-3 『HBV-LB (序列號 29) 5 『 -TCTGGACTATCAAGGTATGTTGC-3 『HBV-Pr (B0DIPY-FL 標記)(序列號 30)5' -GTTGGTTCTTCTGGACTATCAAGGTATGTTGCCC-3'(4) LAMP反應試劑的成分和濃度調製LAMP最終反應溶液30 μ L，其中各試劑濃度如下。· 25mM Tris-HCl (ρΗ8· 8)
· 12. 8mM (NH4)2SO4· 9. 7mM MgSO4· 0. 10% Tween20· 1. 79mM dATP· 1. 79mM dCTP· 1. 79mM dGTP· 1. 79mM dTTP· 28. 8U Bst DNA 聚合酶(New England Biolab 公司)· IO6 拷貝 Arita2 質粒·內標引物0. 4μΜ Arita2_FIP(序列號 17)和 Arita2_BIP(序列號 18)0.05 μ M Arita2_F3(序列號 19)和 Arita2_B3 (序列號 20)0. 4μΜ Arita2_LF(序列號 21)和 Arita2_LB(序列號 22)· 0. 067 μ M 內標探針 Arita2_Pr (序列號 23) 靶核酸引物1. 6μΜ HBV-FIP (序列號 24)和 HBV-BIP (序列號 25)0. 2 μ M HBV-F3 (序列號 26)和 HBV-B3 (序列號 27)0. 8 μ M HBV-LF (序列號 28)和 HBV-LB (序列號 29)· 0. 067 μ M靴核酸探針HBV-Pr (序列號30)(5)檢測和計算定量值檢測是使用淬滅探針法進行的。使用Mx3000P (STRATAGENE公司)，對伴隨內標物 和靶核酸的擴增的螢光消光進行了實時測定。定量值是根據Tt值依賴於初始模板量而進 行計算的。(6)靶核酸的定量評價將HBV質粒IO1至IO8拷貝的稀釋系列作為靶核酸，添加到所述LAMP反應試劑中。 在63°C進行60分鐘LAMP反應，使用淬滅探針法對螢光消光進行實時測定，繪製了標準曲 線。其結果，最低檢測靈敏度為HBV質粒10拷貝/測試(圖4)，定量測定範圍為IO1 至IO8拷貝/測試(標準曲線的相關係數為R = O. 9996)(圖5)。HBV質粒和Arita2質粒 均具有良好的再現性(圖4，6)，此外，HBV質粒的IO1至IO8拷貝/測試的所有的擴增均在 60分鐘以內結束。實施例3. HBV檢測中內標物濃度變化的影響為了調查提前擴增所需要的內標物的濃度，對HBV檢測中內標物(Arita2質粒) 的模板量為每測試IO2拷貝、IO4拷貝、和IO6拷貝時進行了研究。(I)LAMP反應試劑的成分和濃度內標物的模板量以外的反應試劑成分和濃度，與實施例2相同。(2) HBV質粒模板量和檢測將每次測試的HBV質粒模板量設為IO1拷貝、IO8拷貝這兩種濃度，在63°C條件下
14進行了 60分鐘LAMP反應。使用Mx3000P (STRATAGENE公司)對各模板量時隨著HBV質粒 和內標物(Arita2質粒)擴增引起的螢光消光進行了實時檢測，計算了 Tt值。(3)結果將在(2)中求得的Tt值作為擴增時間，顯示在表1和圖7中。內標物為低濃度 (IO2拷貝/測試)時，高濃度(IO8拷貝/測試)的HBV質粒模板提前於內標物進行擴增，受 其影響內標物的擴增反應大幅度滯後。此外，HBV質粒模板的兩個濃度間的內標物的擴增 時間差很大，是5. 67分鐘。一方面，內標物為高濃度(IO6拷貝)時內標物的擴增沒有滯後， 並且內標物的擴增時間與HBV質粒模板濃度無關，是基本一定的。也就是說，為了使內標物 更早地，並且與靶核酸模板量無關地在一定時間內擴增，需要將內標物模板量設定得高，在 本研究中選擇IO6拷貝/測試是適當的。表1內標物模板量變化時的靶核酸和內標物的擴增時間(分鐘)
模板量內標模板量(拷貝/測試)(拷貝/測試)IO8IO4IO2HBV IO1拷貝33.927.422.4HBV IO8拷貝5.905.575.54Arita2 (HBV IO1 拷貝)5.386.848.33Arita2 (HBV IO8 拷貝)5.418.4114.0實施例4 HBV檢測中內標引物濃度變化的影響為了調查適合提前擴增的內標引物濃度，在HBV檢測中將內標引物濃度設定 為Xl(在不使內標物提前擴增的體系中使用的濃度)、X0. 25、X0. 3、X0. 5而進行了研允。(I)LAMP反應試劑的成分和濃度Xl內標引物1. 3μΜ Arita2_FIP(序列號 17)和 Arita2_BIP (序列號 18)0. 17 μ M Arita2-F3 (序列號 19)和 Arita2_B3 (序列號 20)1. 3μΜ Arita2_LF(序列號 21)和 Arita2_LB (序列號 22)此外，內標引物量以外的反應試劑的成分和濃度與實施例2相同。(2) HBV質粒模板量和檢測將HBV質粒模板量設定為每次測試IO1拷貝、IO8拷貝這2種濃度，在63°C進行60 分鐘的LAMP反應。使用Mx3000P (STRATAGENE公司)對於各模板量中伴隨著HBV質粒、內 標物的擴增的螢光消光進行實時檢測，計算了 Tt值。(3)結果將在(2)中求得的Tt值作為擴增時間顯示在表2和圖8中。內標引物量多時 (X1)，HBV質粒的擴增時間整體變慢，靈敏度附近的擴增時間滯後明顯。此外，內標引物量 過於低時(X0. 25)，某些HBV質粒濃度時內標物的擴增時間發生背離，難於在一定時間內進行擴增。因此，在本研究中選擇X0. 3作為內標引物濃度是適當的。表2內標引物量變化時的靶核酸和內標物的擴增時間(分鐘) 實施例5. HBV檢測中反應試劑成分濃度的影響為了調查適合內標物提前擴增的反應試劑成分濃度，在HBV檢測中，改變含有底 物核苷酸的反應試劑成分，對其影響進行了探討。(I)LAMP反應試劑的成分和濃度調製了含有底物核苷酸的試劑成分AX 1 (在單一的靶核酸檢測系統中通常使用 的濃度)和其1. 2倍濃度的試劑成分X 1. 2。試劑成分AXlLAMP最終反應溶液30 μ L中各試劑濃度如下。25mM Tris-HCl (ρΗ8· 8)IOmM KClIOmM (NH4)2SO48mM MgSO40. 10% Tween201. 4mM dATP1. 4mM dCTP1. 4mM dGTP1. 4mM dTTP28. 8U Bst DNA 聚合酶(New England Biolab 公司)此外，試劑成分A之外的內標物(Arita2質粒)、內標引物、內部標準探針、靶核酸 引物、靶核酸探針以及這些物質的濃度與實施例2相同。(3) HBV質粒模板量和檢測將HBV質粒模板量設定為每次測試IO1拷貝、IO4拷貝、IO8拷貝這3種濃度，在63°C 進行60分鐘的LAMP反應。使用Mx3000P(STRATAGENE公司)對於各模板量中伴隨著HBV 質粒、內標物的擴增的螢光消光進行實時檢測，計算了 Tt值。(3)結果將在(2)中求得的Tt值作為擴增時間顯示在表3和圖9中。在試劑成分AXl反 應液中，高濃度的HBV質粒模板(IO8拷貝/測試)優先於內標物進行擴增，而在XI. 2反
16應液中，內標物的擴增在先，並且與HBV質粒模板的濃度無關，能夠在一定時間內使內標物 進行擴增。因此，為了使內標物提前擴增，應將含有底物核苷酸的反應試劑成分濃度設得較 高，在本探討中研究XI. 2是適當的。表3反應試劑成分量變化時的靶核酸和內標物的擴增時間(分鐘) 實施例6.使用LAMP法講行淋菌的檢測(1) LAMP反應試劑成分和濃度反應試劑成分和濃度與實施例1中相同。
0280](2)檢測以高濃度的NG質粒或低濃度的NG質粒作為靶核酸，在63°C下進行LAMP反應60 分鐘，使用淬滅探針法對於螢光消光進行了實時測定。(3)結果如圖10，11所示，能夠在同一反應系中進行內標物(CT質粒)和靶核酸(NG質粒) 的擴增，與靶核酸的模板濃度無關，內標物的擴增時間是一定的。本說明書中引用的所有的出版物、專利和專利申請，作為參考直接包括於本說明 書中。
權利要求
一種核酸擴增方法，該核酸擴增方法中使用內標物，其中，內標物提前或滯後於靶核酸而進行擴增。
2.根據權利要求1所述的核酸擴增方法，該核酸擴增方法中內標物提前於靶核酸而進 行擴增，其包括以下工序向含有靶核酸的樣品中添加溶液的工序，該溶液中含有已知濃度或拷貝數的內標物；使用擴增反應液進行擴增反應的工序，該擴增反應液含有用於擴增內標物的寡核苷酸 引物和用於擴增靶核酸的寡核苷酸引物，所述用於擴增內標物的寡核苷酸引物能夠在早於 靶核酸擴增的時期使所述內標物進行擴增；通過能夠分辨所述內標物的擴增反應和所述靶核酸的擴增反應的方法進行測定的工序。
3.根據權利要求1所述的核酸擴增方法，該核酸擴增方法中內標物提前於靶核酸而進 行擴增，其包括以下工序向含有靶核酸的樣品中添加溶液的工序，該溶液中含有已知濃度或拷貝數的內標物；使用擴增反應液進行擴增反應的工序，該擴增反應液含有用於擴增內標物的寡核苷酸 引物和用於擴增靶核酸的寡核苷酸引物，所述用於擴增內標物的寡核苷酸引物能夠在早於 靶核酸擴增的時期使所述內標物進行擴增；通過能夠分辨所述內標物的擴增反應和所述靶核酸的擴增反應的方法，進行實時測 定，根據其結果和內標物的添加量，計算出樣品中的初始靶核酸濃度或拷貝數的工序。
4.根據權利要求1至3中任意一項所述的核酸擴增方法，其中，進行靶核酸的定量。
5.根據權利要求1至3中任意一項所述的核酸擴增方法，其中，檢測靶核酸的有無。
6.根據權利要求1至5中任意一項所述的核酸擴增方法，其中，內標物至少在引物設計 區域內具有與靶核酸不同的鹼基序列。
7.根據權利要求1至6中任意一項所述的核酸擴增方法，其中，用於擴增內標物的寡核 苷酸引物設計為與內標物特異性雜交而不與靶核酸雜交；並且，用於擴增靶核酸的寡核苷 酸引物設計為與靶核酸特異性雜交而不與內標物雜交。
8.根據權利要求1至7中任意一項所述的核酸擴增方法，該核酸擴增方法中內標物提 前於靶核酸而進行擴增，其中，使用下述用於擴增內標物的寡核苷酸引物，所述用於擴增內 標物的寡核苷酸引物設計為使得在早於靶核酸擴增的時期發生內標物擴增。
9.根據權利要求1至8中任意一項所述的核酸擴增方法，其特徵在於通過以下的條 件設定，使內標物提前於靶核酸進行擴增(a)與使內標物和靶核酸同時擴增來進行測定時的擴增反應液相比，將內標物設定為 更高濃度和/或將用於擴增內標物的寡核苷酸引物設定為更低濃度；(b)與不使用內標物而使相同的靶核酸擴增來進行測定時的擴增反應液相比，將底物 核苷酸設定為更高濃度。
10.根據權利要求1至9中任意一項所述的核酸擴增方法，其中，在等溫條件下進行擴 增反應。
11.根據權利要求1至9中任意一項所述的核酸擴增方法，其中，擴增反應使用下述引 物(a)和/或引物(b)(a)當從模板核酸上的靶序列的3』側起朝著該模板核酸上的3'末端方向依次選定第1任意序列Flc和第2任意序列F2c時，按照從5』側到3』側的順序含有與該Flc相同的序 列和與該F2c互補的序列F2的引物；(b)當從模板核酸上的靶序列的5』側起朝著該模板核酸上的5'末端方向依次選定第 3任意序列Rl和第4任意序列R2時，按照從5』側到3』側的順序含有與該Rl互補的序列 Rlc和與該R2相同的序列R2的引物。
12.根據權利要求1至9中任意一項所述的核酸擴增方法，其中，擴增反應為LAMP法。
13.—種測試試劑或試劑套件，其用於實施根據權利要求1至12中任意一項所述的核 酸擴增方法。
14.根據權利要求13所述的測試試劑或試劑套件，其用於實施內標物提前於靶核酸而 進行擴增的核酸擴增方法，其至少含有以下的試劑內標物，其至少在引物設計區域內具有與靶核酸不同的鹼基序列，並且濃度或拷貝數 已知；用於擴增內標物的寡核苷酸引物，其能夠在早於靶核酸擴增的時期使內標物進行擴增；用於擴增靶核酸的寡核苷酸引物。
15.根據權利要求14所述的測試試劑或試劑套件，其還含有如下的試劑(a)用於檢測內標物的寡核苷酸探針；和(b)用於檢測靶核酸的寡核苷酸探針。
全文摘要
本發明的課題在於提供一種在使用內標物的核酸檢測系統中，能夠在確保對靶核酸的精確測定值的同時穩定地對內標物進行擴增的方法，以及在該方法中使用的試劑套件。本發明涉及使用內標物的樣品中靶核酸的擴增方法，和在該方法中使用的試劑以及試劑套件，在所述方法中，通過提前於靶核酸擴增而使內標物進行擴增，來防止內標物的擴增產物對靶核酸的擴增反應產生影響。
文檔編號C12Q1/68GK101903520SQ200880122150
公開日2010年12月1日 申請日期2008年10月17日 優先權日2007年10月19日
發明者保坂憲光, 神田秀俊, 米川俊廣, 納富繼宣 申請人:榮研化學株式會社