含有多聚γ穀氨酸的用於改進TLR介導的細胞免疫的組合物的製作方法

2023-06-01 13:46:21 2

專利名稱：含有多聚γ穀氨酸的用於改進TLR介導的細胞免疫的組合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及用於改進細胞免疫性的組合物，其含有有效劑量的多聚Y穀氨酸 (Y-PGA)，具體涉及含有多聚Y穀氨酸的用於改進細胞免疫性的組合物，所述組合物 具有誘導TLR介導的Thl細胞免疫性增強並改善抗原遞呈活性(antigen presenting activity)的效果以保持改善的活性。
背景技術：
細胞免疫性和體液免疫性的概念是相對而言的，細胞免疫性是由抗原專一性T細 胞或者抗原非專一性NK細胞(自然殺傷細胞，Natural KilIercel 1)或者巨噬細胞誘導的 免疫應答。體液免疫應答通過抗體誘導，其與細胞不相關，因此適於除去與細胞無關獨立作 用的抗原諸如細菌。但是，在抗原中，有一些不是存在於細胞之外的抗原，而是與宿主細胞 相關，或者存在於細胞內部。例如，病毒是在宿主細胞中增殖的代表性例子，以及癌細胞由 細胞本身的癌基因轉錄產生，於是大多數抗原與細胞相關或者存在於細胞內部。在這些情 況下，有抗原存在的細胞內部的問題應當通過去除抗原而有效解決，但抗體不能直接穿透 細胞，因此抗體難以與細胞中的抗原發生反應。雖然針對細胞表面抗原的抗體顯示了其中 抗體與細胞表面上的抗原結合的細胞毒性反應諸如ADCC(抗體依賴的細胞毒性，antibody dependentcellular cytotoxicity)，因此細胞由NK細胞或者巨噬細胞吞噬或者補體介導 裂解，但需要誘導細胞介導的免疫應答以便有效除去位於細胞內的抗原。也就是說，能夠通 過其中含有專一性抗原的細胞被消除的細胞免疫應答有效除去細胞相關抗原。根據效應物(effector)的功能，細胞免疫應答被分成兩類效應T細胞功能的 抗原專一性免疫應答和抗原非專一性效應細胞的免疫應答，諸如自然殺傷細胞或者巨噬細 胞。細胞毒性T細胞(CTL)-介導的應答是其中抗原專一性CTL直接作用於含有抗原的細胞 已殺死含有抗原的細胞的免疫應答，其為典型的專一性免疫應答的一種。在T細胞中雖然 介導遲髮型超敏應答(delayed type hypersensitivity response)的CD4T細胞不能作為 細胞介導的免疫應答的效應細胞(CD4效應T細胞)直接殺死細胞，但它們活化巨噬細胞， 促進細胞介導的免疫應答。另外，NK細胞或者巨噬細胞還在細胞介導的免疫應答中起重要 作用，儘管這些細胞是抗原非專一性細胞，但它們可識別異源細胞、腫瘤細胞、病毒感染細 胞以及類似細胞並破壞它們。但是，所使用的大多數常規免疫佐劑(immimoadjuvant)沒有得到安全保障 (secured)，或者常規免疫佐劑對於增強體液免疫來說是有效的，但它們在預防和治療病毒 感染性疾病、腫瘤疾病等方面不是有效的。已經報導GlaxoSmithkline的預防性宮頸癌疫苗AS04佐劑顯示了增強細胞免疫 性的部分效果，但其有限地用於注射疫苗，因此不能經口服途徑或者肌肉途徑使用。大多數病原體透過黏膜表面，並且大多數感染初步發生在黏膜和黏膜下組織。因此，常規注射用疫苗(parenteral vaccine)在誘導黏膜免疫應答方面效率非常低，因此已 經付出了相當大的努力來開發最佳黏膜免疫系統。作為這些努力中的一個，在黏膜下組織 中改善抗原輸送到免疫細胞中的免疫佐劑(脂質體，免疫刺激複合物以及中心體)已經被 開發，並且還報導了使用其進行實驗(Sjolander等人，J. Leukocyte Biol. 64 :713，1998)。 但是，雖然黏膜下免疫性對於許多情況是有效的，但需要將黏膜免疫系統與非黏膜(系統 性)免疫系統組合以便在許多感染中誘導免疫應答。當考慮到上面提到的技術時，所選抗原物質的大量生產以及可將抗原物質的效果 最大化並將其安全輸送的成本效率高(cost-effective)的佐劑的開發稱為所需的先決條 件，以便開發具有商業競爭力並且有效的藥物組合物。另外需要可經皮、口服、黏膜以及全 身給藥並調整和針對免疫應答的免疫佐劑。因此，本發明的發明人付出了極大的努力來開發更有效且安全的免疫佐劑，結果 發現，由桿菌菌株產生的多聚Y穀氨酸具有增強TLR4介導的Thl細胞免疫性，增加抗原遞 呈活性，並保持增加的活性的效果，確定多聚Y穀氨酸作為CMI (細胞介導的免疫性)佐劑 是有用的，並且當口服給藥時是安全的，由此完成本發明。

發明內容
因此，本發明的主要目的是提供增強細胞免疫性的組合物，其包括有效劑量的多 聚Y穀氨酸。本發明的另一目的是提供預防和治療人類病毒和細菌感染以及癌症的疫苗組合 物，或者預防和治療動物病毒和細菌感染的疫苗組合物，其包括有效劑量的多聚Y穀氨 酸，並具有增強細胞免疫性的效果。為了實現上述目的，本發明提供了增強細胞免疫性的組合物，其包括有效劑量的 多聚Y穀氨酸。另外，本發明提供了通過增強細胞免疫性預防和治療人類病毒或者細菌感染和癌 症的疫苗組合物，其包括有效劑量的多聚Y穀氨酸。本發明提供了通過增強細胞免疫性預防和治療動物病毒或者細菌感染的疫苗組 合物，其包括有效劑量的多聚Y穀氨酸。通過下列詳細描述和隨附的權利要求書，本發明的上述和其他目的、特徵和實施
方式將更加容易理解。


圖1是顯示多聚Y穀氨酸通過鍾狀(toll-like)受體4(TLR4)信號轉導 (signaling)對來自骨膜的巨噬細胞具有活化效果的結果。圖2是顯示多聚Y穀氨酸對樹突細胞具有活化效果的結果。圖3是顯示由Y -PGA處理的自野生型C3H/HeN小鼠和TLR4突變體C3H/HeJ小鼠 的骨膜細胞分化而成的樹突細胞分泌的IL-12p70的量的測量結果。圖4顯示了通過FACS分析得到的分泌IFN- γ的⑶8+Τ細胞，以便檢查根據樹突 細胞與T細胞之間的比例的T細胞活化。圖5是顯示通過分析根據樹突細胞與T細胞之間的比例的T細胞活化的抗原遞呈活性。圖6是顯示通過由siRNA的TLR4表達抑制的Y -PGA治療對TLR4依賴性信號轉 導抑制的結果。圖7是顯示使用多聚Y穀氨酸作為細胞免疫性增強劑的包含乳酸菌 (Lactobacillus)表面上表達的E7的疫苗組合物的抗癌效果的結果。圖8是顯示針對人CEA的體液免疫應答在小鼠中通過在其表面上表達CEA的乾酪 乳桿菌(Lactobacillus casei)和含有Y-PGA的組合物誘導的結果。圖9是顯示針對人類CEA的細胞免疫應答通過在其表面上表達CEA的乾酪乳桿菌 和含有Y -PGA的組合物誘導的ELISP0T測定結果。圖10是顯示針對人類CEA的細胞免疫應答通過在其表面上表達CEA的乾酪乳杆 菌和含有Y -PGA的組合物誘導的FACS測定結果。圖11是顯示通過在其表面上表達CEA的乾酪乳桿菌和含有Y -PGA的組合物給藥 的抗癌效果(腫瘤尺寸減小)的結果。圖12是顯示通過在其表面上表達CEA的乾酪乳桿菌和含有Y -PGA的組合物給藥 的抗癌效果(存活率增加)的結果。
具體實施例方式在一個方面，本發明涉及改善細胞免疫性的組合物，其含有有效劑量的多聚Y穀氨酸。在本發明中，用於改善細胞免疫性組合物的多聚Y穀氨酸的分子量優選為 IOOkDa 15，OOOkDa,更優選 1，OOOkDa 15，OOOkDa0在本發明中，確定多聚Y穀氨酸通過來自骨膜的巨噬細胞和樹突細胞誘導了 TLR 介導的Thl細胞免疫性的增強，並提高了樹突細胞的抗原遞呈活性，由此保持了改善的活 性。在本發明中，用於改善免疫性的組合物優選被加入到疫苗中以便預防和治療人類 病毒和細菌感染或者動物病毒和細菌感染，顯示免疫增強效果。根據本發明，包括多聚Y穀氨酸作為有效成分的增強免疫性的組合物可根據常 規製備方法製成口服劑型諸如粉末、顆粒，藥片、膠囊、懸浮液、乳液、糖漿、氣溶膠等，外用 製劑，栓劑和用於注射的滅菌液。可包含在用於增強免疫性的組合物中的載體、賦形劑和稀釋劑包括乳糖、葡萄糖、 蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藻糖醇、麥芽糖醇、澱粉、阿拉伯樹膠、藻酸鹽、白明膠、磷 酸鈣、矽酸鈣、纖維素、甲基纖維素、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羥甲基苯甲酸、羥丙 基苯甲酸、滑石粉、硬脂酸鎂和礦物油。本發明的組合物可與常規稀釋劑或者賦形劑諸如填料、膨脹劑、結合劑、溼潤劑、 分解質和表面活性劑製成製劑形式。用於口服給藥的固體製劑包括片劑，丸劑，粉末，顆 粒，膠囊等，並且固體製劑通過將至少一種賦形劑例如澱粉、碳酸鈣、蔗糖、乳糖、白明膠等 混合到藥物組合物中製成製劑。而且，潤滑劑諸如硬脂酸鎂和滑石粉也可加入到賦形劑 中使用。用於口服給藥的液體製劑包括懸浮劑，齊培丙醇(zipeprol)，乳液，糖漿等，並 且除常規稀釋劑諸如水和液體石蠟之外，各種賦形劑例如溼潤劑、增甜劑、矯臭劑、防腐劑等可包含在其中。用於注射給藥的製劑包括滅菌水溶液、非水溶液、懸浮液、乳液、凍幹劑 (Iyophilizedpreparation)和栓劑。非水溶液和懸浮液包括菜油諸如丙二醇和聚乙二醇和 橄欖油以及可注射酯諸如油酸乙酯等。栓劑的基本材料包括半合成脂肪酸酯(witepsol)、 硬聚乙二醇(macrogol)、吐溫(Tween)61、可可油、月桂脂(laurin butter)、甘油、白明膠寸。在本發明的含有多聚Y穀氨酸作為有效成分的用於增強免疫性的藥物組合物 中，給予患者狀況和體重、待治療的疾病狀態、劑量、給藥途徑和時間，Y-PGA可以不同劑量 水平加入，但本領域技術人員可優化劑量水平，優選地，其可以0. 001 10gPGA/kg個體重 量的劑量給藥，更優選以0. 01 2gPGA/kg個體重量的劑量給藥。如果Y -PGA以低於0. 001gPGA/kg個體重量的劑量加入，免疫增強效果不能被預 期，如果Y-PGA以超過10gPGA/kg個體重量的劑量加入，則由於粘度增加而難以以注射形 式給藥，並且當劑量增加時免疫增強效果保持不變，因此是不經濟的。本發明的藥物組合物可經各種途徑給藥到包括大鼠、小鼠的哺乳動物、家畜、人類 等。例如，給藥模式可包括口服和直腸給藥，或者靜脈、肌肉、皮下、子宮內膜或者側腦室 (intracerebroventicular)給藥途徑。包括本發明的含有多聚Y穀氨酸作為有效成分的用於增強免疫性的組合物的功 能食品和飼料添加劑可根據常規方法被製成粉末、顆粒、片劑、膠囊、液體懸浮液等，並且本 領域技術人員可確定優選劑量。在另一方面，本發明涉及通過增強細胞免疫性來預防和治療疾病的疫苗組合物， 其包括有效劑量的多聚Y穀氨酸。根據本發明的多聚Y穀氨酸誘導了 TLR介導的Thl細胞免疫性的增強，並改善了 抗原遞呈活性以保持改善的活性，因此可預期其起到改善預防和治療細胞內病毒感染、細 菌疾病以及由細胞突變引起的腫瘤的作用。 雖然報導的具有增強細胞免疫性的HPV/AS04疫苗(Giarmini S. L.等人， Vaccine. 14 =5937,2006)僅僅可以注射形式得到，本發明的疫苗組合物具有的優點在於， 其可經多種途徑給藥，諸如口服給藥、鼻腔噴灑給藥等等以及可注射形式給藥。本發明的發明人提交了公開了含有多聚Y穀氨酸的佐劑組合物的專利申請(韓 國專利註冊號10-0517114)，該申請涉及通過所公開的佐劑組合物的體液免疫應答的誘導 增加針對抗原的免疫應答，從而誘導高抗體滴度的組合物，即便在與組合物一起使用的抗 原的免疫原性很低的情況下也是如此。本發明提供了用於增強細胞免疫性的組合物，其包括具有高分子量的有效劑量的 多聚Y穀氨酸，並可誘導針對抗原的更有效的細胞免疫應答，所述抗原與宿主細胞相關或 者存在於細胞內並且誘導的體液免疫應答抗體對其沒有效果。雖然誘導體液免疫的抗體不 能直接滲透到細胞內，因此難以與細胞內部的抗原發生反應，但根據本發明的用於增強細 胞免疫性的組合物可實現細胞免疫的增強，與宿主細胞相關或者存在於細胞內的抗原例如 病源諸如在宿主細胞中增殖的代表性的例子病毒，以及通過細胞本身轉錄產生的癌細胞可 通過所述細胞免疫的增強被有效消除。由於這些性質，使用具有低細胞免疫原性諸如滅活 疫苗和亞單位疫苗的抗原將組合物加入到疫苗組合物中，由此使疫苗組合物能夠具有增強 的免疫效果。
實施例此後，將通過是實力更為詳細地對本發明進行描述。但是應當理解的是，這些是實 力僅僅用於說明的目的，而不解釋為限制本發明的範圍。實施例1 γ -PGA的生產及其分子量的測定在含有用於Y-PGA生產的3L基本培養基(GS培養基，含有5 % L-穀氨酸 5 % 葡萄糖，1 % (NH4)2SO4jO. 27 % KH2PO4,0. 42 % Na2HPO4 · 12Η20，0· 05 % NaCl,0. 3 % MgSO4 · 7Η20，維生素溶液 lml/L，ρΗ 6. 8)的 5L 發酵罐中接種 1 % 的 Bacillus subtilis var chungkookjang(KCTC 0697BP)培養液，然後在150rpm的攪拌速度、Ivvm的空氣注入率 和37°C的溫度下培養72小時。在培養完成後使用濾紙從培養液中除去細胞，由此得到含有 Y -PGA的樣品液。將2N的硫酸溶液加入到含有Y-PGA的樣品液中並在10°C靜置12小時以收集 Y-PGA沉澱。使用Nutsche過濾器以過量的蒸餾水洗滌沉澱以得到γ-PGA。將得到的多 聚、穀氨酸使用合適的方法切割以得到具有均一分子量的Y-PGA待用，或者根據分子量 分離PGA待用，並使用GPC(凝膠滲透柱，gel permeation column)測定其分子量，在以下 實施例中使用具有平均分子量為IOkDa和2000kDa的多聚γ穀氨酸進行實驗。實施例2 γ -PGA 口服給藥時的毒性檢測結果為了檢查Y-PGA 口服給藥的安全性，使用小鼠進行多聚-Y-穀氨酸單獨口 服給藥的毒性檢測由GLP(Good Laboratory Practice)認可的Biotoxtech公司根據 Biotoxtech Standard Operating Procedures (SOPs),Good Laboratory Practice (GLP)規 則和檢測指南來進行。使用10隻6周齡的雄鼠(159. 76 177. 27g)和10隻雌鼠(121. 60 138. 80g)， 並且給藥到單個小鼠的Y-PGA的劑量以給藥當天禁食後測定的體重為基礎進行計算。給 藥前所有小鼠被禁食16小時但可自由接近飲用水，然後使用單劑量的Y -PGA通過使用連 接有用於口服給藥的導管的一次性注射器(5ml)的胃管對它們進行強制口服給藥，接著在 給藥後餵養飼料4小時。作為初步實驗，將100mg/ml的γ -PGA分別以20ml/kg的單劑量口服給藥到2隻 雄鼠和2隻雌鼠，結果沒有觀察到死鼠，因此使用2000mg/20ml/kg作為單劑量。與給藥到 實驗組的實驗材料相同劑量的賦形劑給藥到對照組，待給藥的劑量被設定為20ml/kg。結果，如表1中所示，在觀察階段沒有觀察到由Y-PGA 口服給藥引起的死亡和一 般症狀。在觀察階段，觀察到對照組和實驗材料被給藥的實驗組中雄鼠和雌鼠的體重增加。 在對照組和實驗材料被給藥的實驗組的雄鼠和雌鼠中屍體解剖結果沒有揭示任何肉眼可 見的異常發現。通過單次Y-PGA 口服給藥到小鼠的結果，由實驗材料引起的一般症狀和死 亡沒有被觀察到，因此可以確定在雌鼠和雄鼠中Y -PGA的致死計量超過2000mg/kg。表 權利要求
一種增強細胞免疫性的組合物，其含有有效劑量的多聚γ穀氨酸。
2.根據權利要求1的組合物，其特徵在於，所述細胞免疫性的增強通過TLR(鍾狀受 體)介導。
3.根據權利要求1的組合物，其特徵在於，所述多聚Y穀氨酸的平均分子量為 IOOkDa 15，OOOkDa。
4.根據權利要求1的組合物，其特徵在於，所述其包括藥學上可接受的載體。
5.一種預防和治療病毒或細菌感染的疫苗組合物，其包括權利要求1的組合物。
6.根據權利要求5的組合物，其特徵在於，所述病毒或細菌感染為人或者動物感染。
7.一種預防或治療癌症的疫苗組合物，其含有權利要求1的組合物。
全文摘要
本發明涉及用於改進細胞免疫性的組合物，其含有有效劑量的多聚γ穀氨酸，具體涉及含有多聚γ穀氨酸的用於改進細胞免疫性的組合物，所述組合物具有誘導TLR介導的Th1細胞免疫性增強並改善抗原遞呈活性的效果以保持改善的活性的效果。本發明含有有效劑量的多聚γ穀氨酸的組合物具有非常小的毒性和副作用，並可被加入到疫苗組合物中預防和治療動物病毒或者細菌感染或者癌症，或者加入到疫苗組合物中預防和治療人類病毒或細菌感染和癌症，以顯示細胞免疫性增強效果。
文檔編號A61K31/765GK101951928SQ200780101680
公開日2011年1月19日 申請日期2007年10月15日 優先權日2007年10月12日
發明者夫夏玲, 成文喜, 李一翰, 金哲仲, 金陽賢 申請人:生物領先公司;韓國生命工學研究院