一種從菠菜中提取蛻皮激素的方法
2023-06-01 12:11:41 2
一種從菠菜中提取蛻皮激素的方法
【專利摘要】本發明公開了一種從菠菜中提取蛻皮激素的方法，取待測樣品，在液氮中研磨成粉末，加入體積比9∶150ml?MeOH-CHCl3混合液或100％MeOH溶液至50ml，在37℃下震蕩2小時，然後用矽膠粉過濾，加入少許NaCl和50ml?n-Hexane萃取兩次，收集MeOH層，用旋轉蒸發儀進行乾燥，再用異丙醇重新溶解樣品，過濾後即可進行高效液相色譜分析，測定其含量。該方法中提取物經高效液相色譜分析，提取速度快、提取率高，並可微量提取。
【專利說明】一種從菠菜中提取蛻皮激素的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於植物源昆蟲蛻皮激素類似物的提取分離【技術領域】，涉及一種從菠菜中提取蛻皮激素的方法。
【背景技術】
[0002]植源性蛻皮激素I是一類非常重要的植物次生代謝產物，也是具有昆蟲蛻皮活性的天然留體化合物。植源性蛻皮激素能夠促進昆蟲的蛻皮，高濃度的蛻皮激素可以幹擾昆蟲正常的生理代謝，使昆蟲提早蛻皮而成為弱小的或畸形的個體。昆蟲對蛻皮激素相當敏感，輕者可引起昆蟲不育，重者可導致死亡。因此，植源性蛻皮激素在植物抵抗非適應性植食性昆蟲中扮演著重要的角色，非常低的濃度水平就可以阻止害蟲的侵害。從植物中提取蛻皮激素已然成為目前生產、研究和開發的熱點。從露水草、筋骨草中提取蛻皮激素的專利和報導屢見不鮮，但目前並沒有以菠菜(Spinacia oleracea L.)為原料提取蛻皮激素(beta-Ecdysone)並測定其含量的技術體系。菠菜是為數不多的能夠自身合成並積累大量植源性蛻皮激素的農作物。建立高效、簡便的菠菜蛻皮激素提取和測定的方法，可以為常規的菠菜抗蟲品種選育提供新的檢測指標，進而為發展農業害蟲防治新技術和抗蟲育種提供理論依據。
【發明內容】
[0003]本發明的目的在於克服上述技術存在的缺陷，提供一種簡便、快捷地從菠菜中提取蛻皮激素的方法。該方法提取方法簡單，回收率高，並且可以微量提取。其具體技術方案為:
[0004]一種從菠菜中提取蛻皮激素的方法，包括以下步驟:
[0005](I)取菠菜葉片，加入液氮，將其研磨為粉末狀；
[0006](2)將粉末置於50ml的離心管中，加入體積比為9: I的MeOH-CHCl3混合液或100%的MeOH溶液至50ml，放入恆溫培養搖床震蕩2h，搖床溫度設為37°C，轉速設為180rpm ；
[0007](3)將娃藻土 545加入到磨口布氏砂芯漏鬥中，厚度為2cm,壓實,將上述提取液倒入漏鬥，使用循環水式多用真空泵SHK-1II抽濾樣品；
[0008](4)將抽濾好的樣品倒入分液漏鬥中，加入己烷(Hexane) 50ml和少許NaCl，劇烈震蕩，使其充分萃取，然後靜置30min，取下層萃取液，上層萃取液倒掉，此步驟重複兩遍；
[0009](5)取萃取好的溶液，用旋轉蒸發儀乾燥樣品，水溫為45-50°C，乾燥晶體即為蛻皮激素提取物。
[0010]進一步優選，步驟(1)所述的菠菜葉片為新鮮的菠菜葉片。
[0011]進一步優選，步驟(1)所述的菠菜葉片研磨後需記錄其質量。
[0012]進一步優選,步驟(4)所述的NaCl的質量≤溶液質量的5%。
[0013]進一步優選，步驟(5)所述的乾燥樣品的溫度為45_50°C。[0014]一種本發明所述的從菠菜中提取蛻皮激素的方法製備得到的蛻皮激素樣品。
[0015]與現有技術相比，本發明的有益效果為:本發明利用甲醇、氯仿和己烷沉澱相結合以及多次重複提取的工藝，從菠菜中提取蛻皮激素，不僅操作簡便、耗時短、而且提取效率高，可以微量提取。蛻皮激素提取率可以達到100%。採用甲醇為提取溶劑，不但降低提取成本，同時也避免了環境汙染。採用高效液相色譜法測定蛻皮激素含量，靈敏度水平可達5mg/L。本發明的蛻皮激素通過三種有機溶劑的混合提取和萃取，使得該方法提取率達到100%，為植物體內該物質的檢測提供了可信的提取檢測方法，可以利用在分子檢測常規育種中，也可以利用在基因功能的研究中。
【具體實施方式】
[0016]下面結合具體實施例對本發明的技術方案作進一步詳細地說明。
[0017]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0018](I)取菠菜葉片，加入液氮，將其研磨為粉末狀。
[0019](2)將粉末置於50ml的離心管中，加入MeOH-CHCl3 (9: 1，V/V)至50ml，放入恆溫培養搖床震蕩2h，搖床溫度設為37°C，轉速設為180rpm。
[0020](3)將硅藻土 545加入到布氏砂芯漏鬥中，使用循環水式多用真空泵SHK-1II抽濾樣品。
[0021](4)將抽濾好的樣品倒入分液漏鬥中，加入己烷(Hexane) 50ml和少許NaCl，劇烈震蕩，使其充分萃取，然後靜置30min，30min後，取下層萃取液，上層萃取液倒掉。此步驟重複兩遍。
[0022](5)取萃取好的溶液，用旋轉蒸發儀乾燥樣品，水溫為45-50°C，直到將樣品蒸乾為止。
[0023](6)向樣品中加入異丙醇(Isopropanol),使用KQ-500DE型數控超聲波清洗器進行震蕩加速樣品的溶解，震蕩時間在5min左右，直到燒瓶壁上的固體全部溶解為止。
[0024](7)將溶解好的樣品溶液用移液槍吸出，利用一次性注射器將溶液通過0.45 iim的聚偏氟乙烯微孔濾膜(F型)過濾到2ml棕色色譜進樣瓶中。保存在4°C冰箱中。
[0025](8)高效液相色譜法測定蛻皮激素含量
[0026]移動相為10% Isopropanol (0.1% TFA)，所有試劑需要經過過濾，並使用數控超聲波清洗器清洗並抽氣後使用。所使用的儀器為AgilentllOOSeries高效液相色譜儀，色譜柱(Column)為Symmetry? C185 u m4.6X250mm,流動相為 10%異丙醇(Isopropanolalcohol)，檢測波長(Wavelength)為 248nm,柱溫(Column Temp)為 40°C,流速(Flow rate)為1.2ml/min，進樣量為20 U I，運行時間45.0min0
[0027]以上所述，僅為本發明較佳的【具體實施方式】，本發明的保護範圍不限於此，任何熟悉本【技術領域】的技術人員在本發明披露的技術範圍內，可顯而易見地得到的技術方案的簡單變化或等效替換均落入本發明的保護範圍內。
【權利要求】
1.一種從菠菜中提取蛻皮激素的方法，其特徵在於，包括以下步驟: (1)取菠菜葉片，加入液氮，將其研磨為粉末狀； (2)將粉末置於50ml的離心管中，加入體積比為9:1的MeOH-CHCl3混合液或100%MeOH溶液至50ml，放入恆溫培養搖床震蕩2h，搖床溫度設為37°C，轉速設為180r/min ； (3)將硅藻土545加入到布氏砂芯漏鬥中，厚度為2cm，壓實，將上述提取液倒入漏鬥，使用循環水式多用真空泵SHK-III抽濾樣品； (4)將抽濾好的樣品倒入分液漏鬥中，加入己烷50ml和NaCl，劇烈震蕩，使其充分萃取，然後靜置30min,取下層萃取液,上層萃取液倒掉,此步驟重複兩遍； (5)取萃取好的溶液，用旋轉蒸發儀乾燥樣品，水溫為45-50°C，乾燥晶體即為蛻皮激素提取物。
2.根據權利要求1所述的從菠菜中提取蛻皮激素的方法，其特徵在於:步驟(1)所述的菠菜葉片為新鮮的菠菜葉片。
3.根據權利要求1所述的從菠菜中提取蛻皮激素的方法，其特徵在於:步驟(1)所述的菠菜葉片研磨後需記錄其質量。
4.根據權利要求1所述的從菠菜中提取蛻皮激素的方法，其特徵在於:步驟(4)所述的NaCl的質量≤溶液質量的5%。
5.根據權利要求1所述的從菠菜中提取蛻皮激素的方法，其特徵在於:步驟(5)所述的乾燥樣品的溫度為45-50°C。
6.—種權利要求1-5中任一項 所述的從菠菜中提取蛻皮激素的方法製備得到的蛻皮激素。
【文檔編號】C07J9/00GK103788162SQ201410017263
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年1月7日 優先權日:2014年1月7日
【發明者】段方猛, 宋雯雯 申請人:青島農業大學