轉錄因子aprf的製作方法

2023-06-01 16:07:56 11

專利名稱：轉錄因子aprf的製作方法
技術領域：
本發明涉及新的轉錄因子，急性期反應因子(下文縮寫為APRF)，編碼它的DNA，尋找抗APRF功能的抑制劑的測定和篩選方法以及抗所述APRF功能的抑制劑。
更具體地說，本發明涉及與細胞中白細胞介素6(下文縮寫為IL-6)的信號傳遞有關的轉錄因子APRF，及其製備方法，編碼它的DNA，含所述DNA的複製和表達載體，用所述複製和表達載體轉化或轉染的宿主細胞，尋找抗APRF功能的抑制劑的測定和篩選方法以及抗所述APRF功能的抑制劑。
生物信號傳遞物通過將生物活性物質刺激的信號傳遞到細胞中，從而介導細胞應答。狹義上講，生物信號傳遞物是指一種物質，它從生物活性物質的受體收到信號並調節細胞核內的基因表達。在所述的生物信號傳遞物質中，與核DNA結合併調節基因表達的蛋白質被稱為轉錄因子。在本發明中，稱這些因子為轉錄因子。
通常轉錄因子本身是蛋白質。轉錄因子具有從一級生物活性媒介物到細胞，將信息(信號)傳遞給核內DNA的功能，並具有在轉錄階段，調節二級蛋白質表達的功能。即當第一生物活性物質作用於細胞並表達第二蛋白質時，轉錄因子在細胞內起作用。通過所述轉錄因子的轉錄包括提高(加速)表達和降低(限制)表達。在本發明中，通過第一蛋白質的作用調節其表達的第二蛋白質被稱為可誘導蛋白質，該蛋白質的相應基因被稱為可誘導基因。例如，由IL-6誘導的蛋白質，如結合珠蛋白被稱為IL-6誘導蛋白，而所述蛋白質的基因如結合珠蛋白基因被稱為IL-6誘導的基因。
由IL-6促進其表達的蛋白質實例有上述的結合珠蛋白，hemopequisin，C-反應蛋白，α2-巨球蛋白，α1-酸性糖蛋白，以及已知的在炎症的急性期明顯出現的那些蛋白質。相反，血清白蛋白是由IL-6抑制其表達的一種蛋白質實例。
轉錄物質與可誘導基因DNA的特定序列結合，然後調節所述可誘導基因的表達。通常，由轉錄因子結合的DNA序列位於啟動子區附近。可誘導基因的上遊。由轉錄因子結合的DNA序列與轉錄因子的種類有內在一致性。在文獻1(Montminy，M，Science 261，1694(1993))中描述了近期的轉錄因子研究。
迄今，已知NF-IL-6是與IL-6的細胞內信號傳遞有關的轉錄因子(參見文獻2Akira，S等人，EMBO，J.9，1897(1990)，文獻3Poli，V.等人，Cell，63，643(1990)，文獻4Kinoshita，S.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89，1473(1992)等)。
然而，在上述文獻中，還沒有關於轉錄物質直接從IL-6受體將轉錄信號傳遞給IL-6誘導基因的描述。另一方面，已知序列CTGGGA位於該IL-6可誘導基因的上遊。因此，在文獻5(Wegenka，U.M.等人，Mol.Cell Biol.，13，276，1993)中提供了某些由IL-6激活並結合所述序列的物質，但在該文獻中，儘管提出了所述蛋白質因子的存在，但未弄清所述因子的序列、結構、物理或化學特性如分子量。在該文獻中，未公開轉錄因子APRF這種物質本身。
轉錄物質存在於細胞內，並且當生物活性物質(第一蛋白質)與上文描述的細胞受體結合後，通常它通過被磷酸化，移到核內並與適當DNA序列結合，而調節可誘導基因的轉錄。因此，可以影響所述轉錄物質的作用如抑制的物質，可被作為與上述生物活性物質有關的疾病的治療藥劑。
從上述角度看，本發明人的目的在於與炎症等疾病有關的IL-6。本發明人分離並純化了APRF並確定了部分胺基酸序列，克隆了所述基因，確定了作為轉錄因子的APRF的全部核苷酸序列和推測的全部胺基酸序列，並首次得到作為物質的APRF本身。
本發明人繼續研究並建立了利用APRF確定和尋找可用於治療由IL-6誘導的疾病(如炎症疾病，白血病，癌，由活化的破骨細胞誘發的骨破折，肺動脈高壓等)的物質的方法。而且本發明人還得到了所述抑制劑。本發明是以這些知識為基礎完成的。
本發明提供實質上純化的哺乳動物轉錄因子APRF。
實質上純化的形式指，例如對於SEQ ID NO 1或5所述多肽的情況下，在制品中的多肽，其中製品中90%以上，如95%，98%，或99%的多肽是SEQ ID NO.1或5的多肽。
上述本發明的APRF具有新的一級胺基酸序列。當用計算機將本發明多肽的胺基酸序列與Swiss Prot(Swiss Prot Release 2.0)資料庫中的所有已知序列進行比較時，沒有具有等同於本發明的多肽的胺基酸序列的多肽。此外，當用計算機與Gen Bank(Gen Bank Release 70.0)資料庫中的所有已知序列進行比較時，也沒有編碼等同於本發明多肽的核苷酸序列。
本發明APRF的詳細描述如下可以用下文描述的具體方法完成有關APRF的分離、純化、部分胺基酸序列的確定，CDNA的克隆，全部胺基酸序列的確定。該方法綜述如下。
即給小鼠施用IL-6，並在施用15分鐘後將其殺死。從肝中提取核蛋白部分。用固定有具下列序列的DNA寡聚物的柱純化提取物CCTTCCGGAATTC然後在聚丙烯醯胺凝膠上電泳純化。
用賴氨醯內肽酶水解純化的產物。用高效液體色譜分離由此得到的消化產物並分離各個峰。用自動胺基酸序列分析儀從N-末端開始確定上述得到的肽片段的胺基酸序列。
根據上述確定的部分胺基酸序列合成相應的DNA寡聚物。用DNA寡聚物從哺乳動物肝或胎盤的CDNA文庫中分離APRF的CDNA。從APRF的CDNA序列確定APRF蛋白質的胺基酸序列。
在本發明中，哺乳動物的實例是人、小鼠、大鼠等。雖然在相同的種中，但根據生產的組織或細胞也可以產生其中有某些胺基酸被取代，缺失或插入的APRF。本發明也包括上述亞類APRF。
本發明包括作為一個實施方案的人APRF。本發明具體包括具有SEQ ID NO.1所示胺基酸序列的多肽、其同系物，其片段。
本發明提供了編碼上述人APRF的DNA。本發明還提供具有SEQ ID NO.2和3所示核苷酸序列的DNA可與所述DNA和其片段雜交的DNA。
特別是，根據發明有提供(1)具有SEQ ID NO.1所示胺基酸序列的多肽，(2)編碼上述(1)多肽的DNA，(3)具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的DNA，和
(4)具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的DNA，為實施方案。
本發明包括作為實施方案的小鼠APRF。具體地說，本發明包括具有SEQ ID NO.5所示胺基酸序列的多肽，其同系物和其片段。
此外，本發明還提供編碼所述小鼠APRF多肽的DNA。具體地說，提供分別具有SEQ ID NO.6或7所示核苷酸序列的DNA，可與所述核苷酸和其片段雜交的DNA。
特別是，根據本發明提供(5)包括SEQ ID NO.5所示胺基酸序列的多肽(6)編碼上述(5)多肽的DNA(7)具有SEQ ID NO.6所示核苷醇序列的DNA，和(8)具有SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的DNA，為實施方案。
在本發明說明書中，具有SEQ ID NO.1或5所示胺基酸序列的(1)和(5)中所述多肽，不僅包括具有SEQ ID NO.1或5所示胺基酸序列的多肽(天然成熟蛋白質)，也包括在其N-或C-末端增加了適當的不同的胺基酸或少於20%的SEQ ID NO.1或5所示全部胺基酸的胺基酸序列，優選的是少於5%的胺基酸序列的多肽，以及包括下文所述的其同系物和片段的衍生物(其中改變(缺失，其他胺基酸序列的取代，加入其他胺基酸序列，插入等)了與功能無關的胺基酸或胺基酸序列)，假設它們具有等同的生物和藥物學特性。
SEQ ID NO.1或5的多肽同系物一般是一個大於至少有100，優選的至少150，例如200，250或300個連續胺基酸的區域，且至少70%，優選的至少80或90%並最好至少95%同源於SEQ ID NO.1或5所示多肽。下文將稱上述多肽同系物為本發明多肽。
此外，本發明的多肽片段至少是10，優選的至少15，例如20，25，30，40，50或60個胺基酸長，並也為下文所用術語「本發明多肽」所包括。
除具有SEQ ID NO.1或5所示胺基酸序列的多肽外的多肽和本發明所述的其片段，具有等同於SEQ ID NO.1或5所示胺基酸序列的多肽的生理學和藥理學特性。因此，本發明不僅提供具有SEQ ID NO.1或5所示胺基酸序列的多肽，而且提供具有等同生理學或藥物學特性的同源多肽。
可以與SEQ ID NO.2，3，6或7所示DNA雜交的DNA有不只一個至少100，優選的至少150，例如200，250，或300個連續核苷酸序列的區域，且至少70%，優選的至少80或90%，而且最好至少95%同源於SEQ ID NO.2，3，6或7所示的DNA。下文稱上述DNA同系物為本發明的DNA。
本發明的DNA片段指核苷酸部份含至少10，優選的15，如20，25，30或40個本發明DNA的核苷酸，並且上述片段等同於本發明的DNA。
本發明的DNA(在(2)或(6)中說明的)包括編碼SEQ ID NO.1或5所示多肽的一組核苷酸序列。
正如熟知的，有一到六種密碼子編碼一種胺基酸(如，已知蛋氨酸(Met)是一種密碼子。而亮氨酸(Leu)有六種密碼子)。
可圖示說明編碼SEQ ID NO.1或5所示胺基酸序列的代表性核苷酸序列，SEQ ID NO2，3，6或7所示的核苷酸序列。本發明的DNA包括選擇隨意密碼子而不改變所編碼的胺基酸序列的DNA。通過改變核苷酸序列，有可能提高多肽的產率。
(3)或(7)中說明的DNA分別是(2)或(6)所示DNA的實施方案，並且是天然形式的序列。
(4)和(8)所示的DNA表示(3)或(7)中定義的帶非轉譯區的DNA序列。
可以用已知方法，如基因重組、化學合成法等製備本發明的DNA(包括其片段，下文中相同)。在下列實施例中詳細說明製備方法。例如，可以按下列方法製備具有SEQ ID NO.3和7中所示核苷酸序列的DNA，即(ⅰ)從生產本發明多肽的細胞中分離mRNA，(ⅱ)從由此得到的mRNA製備第一條鏈(單鏈RNA)，然後製備第二條鏈(雙鏈DNA)(合成cDNA)，(ⅲ)將由此得到的CDNA插入適當的質粒載體中，(ⅳ)用由此得到的重組DNA轉化宿主細胞(製備cDNA文庫)(ⅴ)用雜交方法從cDNA文庫分離含所需DNA的質粒，和(ⅵ)確定所需的核苷酸序列。
詳細地說，用哺乳動物，如人或大鼠，被認為表達APRF的組織優選的，可以用肝，巨噬細胞，胎盤組織細胞或細胞系，按Okayama，H等人(在Methods in Enzymology，Vol.154，P3，(1987)中描述的)的方法，或用Chirgwin，J.M.等人(在Biochem.，18，5294(1979)描述的)的方法完成步驟(ⅰ)。
步驟(ⅱ)，(ⅲ)和(ⅳ)是製備CDNA文庫的系列步驟，並可按Gubler Hoffman(Gene，Vol.25，PP263，1983)的方法，經輕微改動來完成。作為在步驟(ⅲ)中所用的質粒載體的實例，可以使用已知的許多在E.Coli菌株中發揮功能的載體(如pBR322)和在枯草芽孢桿菌中發揮功能的載體(如pUB110)，和最好使用在E.coli中發揮功能的λ-ZAP Ⅱ等。在步驟(ⅳ)中，可以使用任何宿主細胞，最好用按Gene 96，23，(1990)中描述的方法製備的DH5感受態細胞。最近，可以從市場上得到各種動物組織的CDNA文庫。例如，可以從Clontech買到小鼠肝λgt11的CDNA文庫和人胎盤的CDNA文庫。最好用市場上的所述CDNA文庫。
可以用本身已知的方法，如噬菌斑雜交法，菌落雜交法(Gene，10，63(1980))完成步驟(Ⅴ)。其他動物的APRF DNA，其同系物，其片段可作為適當的探針。
步驟(ⅵ)本身是已知的，可以按雙脫氧終止子法或Maxam-Gilbert的方法完成。
一旦確定了SEQ ID NO.2，3，6和7中所示的核苷酸序列，可用化學合成法，PCR法或利用本發明的DNA片段為探針的雜交法得到本發明的DNA。此外，將插入本發明的DNA的載體DNA轉化到適當的宿主中，然後培養轉化體，可以得到所需量的本發明DNA。
本發明的另一實施方案提供含本發明DNA的複製和表達載體。所述載體可以是帶複製原點，以及選擇性地含有表達所述DNA的啟動子和啟動子調節子的例如質粒，病毒或噬菌體載體。該載體可含一個或多個選擇標記基因，如氨苄青黴素抗性基因。
本發明還提供由用於複製和表達本發明DNA的載體(包括含其開放閱讀框架的DNA SEQ ID NO.2，3，6或7)轉化或轉染的宿主細胞。在轉化中使用的宿主細胞可以是細菌、酵母、昆蟲或哺乳動物的細胞。可用通常所用的各方法完成轉化。
在有效表達的條件下培養所述轉化體細胞可以表達(生產)和積累本發明的多肽(包括其片段下文中相同)。根據所用的宿主細胞，培養條件也是熟知的。利用所述多肽的物理、化學和生物學特性，可以用常規的分離方法分離並純化所述轉化體細胞生產並積累的細胞內或細胞外的所需多肽。因此，可以以工業規模製備本發明的多肽，即APRF。因而，本發明還提供用基因重組製備多肽APRF的方法。
可以通過(1)從培養細胞中分離和純化，(2)化學合成，或(3)基因重組優選的，通過(3)中描述的用於工業化的方法製備本發明的多肽(如SEQ ID NO.1或5中所示的)。
更優選的用如下的表達系統(宿主-載體系統)用基因重組製備本發明的多肽。
例如，通過將編碼蛋白質的DNA(如具有SEQ ID NO.2或6所示核苷酸序列的DNA)連接至適當啟動子(如trp啟動子，lac啟動子，λPL啟動子，T7啟動子等)的下遊，然後插入在E.coli菌株中發揮作用的載體(如pBR322，pUC18，pUC19等)之中以製備表達載體，從而完成在E.coli中的表達。
然後，可以在適當的培養基中培養用由此得到的表達載體轉化的E.coli菌株(如E.coli DH1菌株E.coli JM 109菌株，E.coli HB101菌株)以得到所需的多肽。若利用細菌的信號肽，也可在外周胞質中產生所需的多肽。此外，也很容易生產與其他多肽的融合蛋白。
另外，通過將SEQ ID NO.3或7中所示的DNA插入適當載體(如反轉錄病毒載體，乳頭瘤病毒載體，牛痘病毒載體，SV40載體等)中的適當啟動子(如，SV40 啟動子，LTR啟動子，金屬硫蛋白啟動子等)的下遊，以得到表達載體，用由此得到的表達載體轉化適當的哺乳動物細胞(如猴COS-7細胞，中國倉鼠CHO細胞，小鼠L細胞等)，然後在適宜的培養基中培養轉化體以便在該培養基內得到所需的多肽，從而完成在哺乳動物細胞中的表達。
如上所述，通過在核內結合IL-6誘導基因的特定DNA部分，本發明的多肽，即轉錄因子APRF具有調節與細胞內信號傳送有關的轉錄的功能。因此，APRF可用於如闡明由於IL-6的作用誘導的疾病病理，用於研究或研製用於治療所述疾病的所述抑制劑。
利用本發明，可以完成尋找並確定抑制APRF作用的物質。本發明還提供用於尋找抑制APRF功能的物質的篩選方法。
APRF的功能包括其自身的磷酸化，傳遞到核內，與DNA結合。所述的抑制指對至少一種上述APRF功能的抑制。本發明人發現APRF存在於特定細胞內，當IL-6作用於細胞時，通過磷酸化而被激活。已知當該因子被磷酸化後，轉錄因子進入核內，然後與特定的DNA序列結合。因此，通過抑制磷酸化階段，或向核內的傳遞或APRF的自身表達階段等，可達到抑制目的。
再者，本發明還提供含APRF功能抑制劑為活性成分的藥劑。
上述活性成分包括，例如，具有含SEQ ID NO.1或5的胺基酸序列的多肽，其同系物，其片段，從所述多肽的同系物或片段免疫過的哺乳動物中得到的抗體，可結合APRF的核酸或其衍生物，APRF基因的反義核酸，含反義核酸的表達載體，可降解APRF的mRNA的核糖酶(ribozyme)
可以很容易地用常規方法，如根據APRF的胺基酸序列合成作為合適免疫原的肽或本發明施用該肽免疫動物來製備抑制APRF功能的APRF抗體。
上述得到的抗體是有用的APRF功能抑制劑，並且對於了解APRF本身在細胞或活體中的行為也是很重要的。可以按所述抗體的識別部分設計低分子的APRF抑制劑。本發明包括所述的低分子APRF抑制劑。
為了抑制APRF的功能，將APRF基因本身的反義核酸或用所述反義核酸轉染的適當表達載體施用於細胞或活體。可以用所述的反義核酸或含所述反義鏈的表達載體作為本發明APRF功能抑制劑的活性成分。
另外，降解本發明APRF mRNA的核糖酶也抑制APRF的功能，因此，也可用核糖酶作為APRF功能抑制劑的活性成分。
可以用經基因重組方法部分修飾的APRF蛋白質或其衍生物互補或抑制APRF在細胞或活體內的功能。將經基因重組方法部分修飾的APRF基因或其基因衍生物施用於細胞或活體可達到相同的目的。
本發明還提供含抑制本發明APRF功能的抑制劑的抑制藥劑。可以以使其在細胞或活體內發揮功能的適當劑型(施用形式)施用所述的抑制藥劑。例如，可將該藥劑製成脂質體等，在其表面進行適當的修飾以使活性成分被直接攝入核內，也可根據劑型從適當的途徑施用。
通過使用本發明的抑制劑，找到了治療由IL-6誘導的疾病的新方法。
APRF是本發明人最新分離並測定的一種與IL-6的細胞內信號傳送有關的蛋白質。另一方面，在某些情況下，一種特定的轉錄因子還涉及其他生物活性物質的信號傳遞。因此，APRF的抑制作用不僅可用於IL-6誘導的疾病，也可用於由其他生物活性物質誘發的疾病，其中APRF介導信號傳遞。本發明人獨立發現實際上，APRF的磷酸化作用是由除IL-6外的其他細胞激活素，如制瘤素M，白血病抑制因子，白細胞介素11，睫狀神經營養因子等誘導的。也可用本發明有的APRF功能抑制藥劑治療由所述細胞激活素誘導的疾病。
實施例下列實施例詳細具體地說明但不限制本發明。
實施例1APRF的分離從施用人IL-6並在施用後15分鐘殺死的小鼠肝的核提取物中分離APRF。
(1)分離核提取物用稍微改動的Wegenka，U.M.等人(Mol.Cell. Biol.，13，276(1993))的方法製備核提取物。
給小鼠靜脈內施用人IL-6(5μg/小鼠)，並在施用15分鐘後殺死。立即將小鼠肝免疫接種到含1mM原釩酸鹽的冰冷HANKS溶液中。然後用在冰上發動機驅動的Teflonglass均漿器、經20個循環將勻漿緩衝液中的肝勻漿，所述勻漿緩衝液含10mMHEPES(PH7.6)，0.5mM亞精胺，0.15mM精胺，25mM KCl，1mM EDTA，1mM EGTA，1mM二硫蘇糖醇(DTT)，1mM苯基甲基磺基氟化物(PMSF)，10%含0.3M蔗糖的甘油(每個肝3ml)。
勻漿前加入抑肽酶(10μg/ml)，亮肽素(2μg/ml)，胃蛋白酶抑制素(2μg/ml)和1mM原釩酸鹽。將核置於含2M蔗糖的均漿緩衝液中勻漿後，用一個SW28 rotor(Hitachi)以27，000rpm在4℃離心30分鐘分離核。
除去上清液後，將來自10個肝的核重懸於含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的1mM核提取緩衝液(50mM Tris(PH7.8)，420mMKcl，5mM Mgcl2，0.1mM EDTA，2mM DTT，0.5mM PMSF)中。在4℃緩慢攪動30分鐘後，用SW28 rotor以27，000rpm將混合物離心30分鐘，然後使上清液在含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的透析緩衝液(20mM HEPES.(PH7.8)，50mMKCl，12.5mM Mgcl2，1mM EDTA，1mM DTT，1mM PMSF，0.1 Nonidet P-40(BDH Laboratory)，20%甘油)中透析。將提取物離心以除去不溶的沉澱。
(2)分離APRF將在(1)中製備的核提取物(從3000個小鼠肝中得到的)在存在鮭精DNA(200μg/ml)的情況下，與含高親和APRF結合位點寡核苷酸(5-biothinylated串連的回文APRF一致序列，2XCCTTCCGGGAATTC)的抗生蛋白鏈菌素共軛的順磁珠(Dynabeads M-280抗生蛋白鏈菌素，Dynal)在4℃溫育30分鐘。
用洗滌溶液(20mM HEPES(PH7.9)，1mM EDTA，5mM MgCl2，0.05% Np-40，10%甘油)粗略洗滌結合的蛋白質，然後用含1MKCl的洗滌溶液洗脫。立即用洗滌溶液稀釋洗脫液，再與帶APRF結合位點的磁珠一起溫育。
三個循環的DNA親和層析後，用SDS-PAGE分離洗滌物。純化的產物含95kd多肽(主帶)，85kd和75kd多肽(次帶)。所有蛋白質均在酪氨酸殘基被磷酸化。在未用IL-6處理的細胞提取物中檢測不到所述蛋白質。
從凝膠上洗脫95kd的磷蛋白帶，用10%(v/v)三氯乙酸沉澱，用丙酮洗滌，並溶解於含8M脲和10mM Tris，PH9.0的緩衝液中。用賴氨醯基內肽酶將該蛋白質在37℃消化6小時。通過使用在1mm×25cm PP-300柱(Applied Biosystems提供)上的0.1%(V/V)三氟乙酸和乙腈梯度的反相高壓液體層析分離所得的肽。
收集分離的肽並通過在Applied Biosystems Model 477A測序儀上的自動Edman降解定序。確定了所述肽的胺基酸序列。下文稱該片段為肽3。
Thr Gln Ile Gln Ser Val Glu Pro Tyr實施例2APRF的CDNA克隆用-來自肽3的簡併寡核苷酸5′-AC(AGCT)CA(AG)AT(ACT)CA(AG)TC(AGCT)GT-3′和-λgt11載體反引物，經PCR擴增來自小鼠肝λgt11 CDNA文庫(CLML 1035b;Clontech)的一份噬菌體模板DNA，得到含特有DNA序列的PCR產物，所述序列編碼肽3提取物的胺基酸序列。用94℃1分鐘，55℃1分鐘，72℃2分鐘為一循環，完成30個循環的PCR。
證實將上述擴增的CDNA亞克隆至PT7 Blue T載體(Novagen)中得到了具有正確肽3胺基酸序列的PCR產物。
用PCR產物為探針，經噬菌斑雜交分別篩選到約1.5×106個小鼠肝噬菌斑和巨噬細胞λgt 11 CDNA文庫(受讓於Dr.Shigekazu Nagata of Osaka Bioscience Laboratory)。
在添加了5×Denhardt′s溶液(0.1%Fico11，0.1%聚乙烯基吡咯烷酮和0.1%牛血清白蛋白)和0.5%SDS(十二烷基硫酸鈉)的6×SSC中，於65℃雜交反應15小時。用含1%SDS的2×SSD，在65℃洗滌濾器二次，每次30分鐘。
分離陽性克隆並進行序列分析。通過用雙鏈的雙脫氧鏈終止法分析CDNA的核苷酸序列。
所述陽性菌落經分析為具有2310bp(SEQ ID NO.6所示)開放閱讀框架的小鼠APRF的全長CDNA克隆。
所述全長核苷酸序列示於SEQ ID NO.7。從開放閱讀框架推測的胺基酸序列列於SEQ ID NO.5。
用相同的探針和相同的條件，通過篩選人胎盤CDNA文庫(CLHL 1008b;Clontech)分離人APRF的CDNA。
全長核苷酸序列和開放閱讀框架核苷酸序列分別列於SEQ ID NO.3和2。從開放閱讀框架推測的胺基酸序列列於SEQ ID NO.1。
實施例3Northern印跡分析用氯化銫梯度法從小鼠組織製備總RNA。用Oligo-dT Latex(Oligotex-dT30，Roche)純化Poly(A)+RNA。使3μg的poly(A)+RNA經瓊脂糖凝膠電泳，然後將RNA轉移到尼龍膜(HybondPlus;Amersham)上。對於人組織，從Clontech買-RNA印跡膜(Human Multiple Tissue Northern Blot)。
將膜與放射標記的DNA探針雜交，所述探針分別含小鼠樣品小鼠APRF的核苷酸806-1200，人樣品人APRF的核苷酸238-726。洗滌膜，然後乾燥並放射自顯影。作為內對照，用肌動蛋白探針再與膜雜交。
序列表(1)一般資料(ⅰ)申請人(A)姓名KISHIMOTO，TADAMITSU(B)街道3-5-31，Nakanocho(C)城市Tondabayashi-shi，(D)州Osaka(E)國家日本(F)郵編(ZIP)584(ⅱ)發明名稱轉錄因子APRF(ⅲ)序列數8(2)SEQ ID NO1的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度770個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型(D)拓撲結構線性
(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO1


(2)SEQ ID NO2的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度2310個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型mRNA的CDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO2


(2)SEQ ID NO3的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度2787個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型mRNA的CDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO3


(2)SEQ ID NO4的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度2787個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型mRNA的CDNA(ⅵ)來源(A)生物體Homo Sapiens(F)組織類型胎盤(ⅸ)特徵(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置221.2533(C)鑑定方法P(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO4




(2)SEQ ID NO5的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度770個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO5



(2)SEQ ID NO6的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度2310個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型mRNA的CDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO6

(2)SEQ ID NO7的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度2652個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型mRNA的CDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO7


(2)SEQ ID NO8的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度2652個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型mRNA的CDNA(ⅵ)來源(A)生物體小鼠(F)組織類型肝(ⅸ)特徵(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置259..2571(C)鑑別方法P(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO8




權利要求
1.實質純化形式的哺乳動物轉錄因子APRF。
2.根據權利要求1的APRF，它來自於人。
3.根據權利要求2的APRF，它選自含SEQ ID NO.1所示胺基酸序列的多肽，其同系物和其片段。
4.根據權利要求3的APRF，含有SEQ ID NO.1所示的胺基酸序列。
5.編碼權利要求1APRF的DNA。
6.根據權利要求5的DNA，它編碼權利要求2，3或4的APRF。
7.根據權利要求5的DNA，它選自權利要求6所述具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的DNA，以及能與SEQ ID NO.2雜交的DNA和其片段。
8.根據權利要求5的DNA，它選自權利要求6所述具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的DNA，以及能與SEQ ID NO.3雜交的DNA和其片段。
9.根據權利要求1的APRF，它來自小鼠。
10.根據權利要求9的APRF，它選自含有SEQ ID NO.5所示胺基酸序列的多肽，其同系物和其片段。
11.根據權利要求10的APRF，它具有SEQ ID NO.5所示的胺基酸序列。
12.根據權利要求5的DNA，它編碼權利要求9，10或11的APRF。
13.根據權利要求5的DNA，它選自權利要求12具有SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列的DNA，以及能與SEQ ID NO.6雜交的DNA和其片段。
14.根據權利要求5的DNA，它選自權利要求12具有SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列的DNA，以及能與所述DNA雜交的DNA和其片段。
15.一種含權利要求5到8和12到14任一項的DNA的複製或表達載體。
16.用權利要求15的複製或表達載體轉化或轉染的宿主細胞。
17.一種生產APRF的方法，包括在有效表達權利要求1到4和9到11的APRF的條件下，培養權利要求16的宿主細胞。
18.一種尋找對APRF的功能具有抑制活性的產物的篩選方法，包括使用權利要求1的APRF。
19.一種抑制藥劑，含有作為活性成分的，對權利要求1APRF的功能具抑制活性的產物。
20.根據權利要求19的抑制藥劑，其中所述產物是權利要求1的抗體。
21.根據權利要求20的抑制藥劑，其中所述抗體來自用多肽免疫的哺乳動物，所述多肽含SEQ ID NO.1或5所示的胺基酸序列，其同系物或其片段。
22.根據權利要求19的抑制藥劑，其中所述產物是能與權利要求1APRF結合的核酸或其衍生物。
23.根據權利要求19的抑制藥劑，其中所述產物是權利要求1APRF的反義核酸或含所述反義核酸的表達載體。
24.根據權利要求19的抑制藥劑，其中所述產物是能降解權利要求1的APRF的mRNA的核糖酶。
全文摘要
哺乳動物轉錄因子APRF，製備它的方法，編碼所述產物的DNA，含所述DNA的複製和表達載體，用所述複製和表達載體轉化或轉染的宿主細胞，尋找APRF功能抑制藥劑的確定和篩選方法以及抗所述APRF功能的抑制藥劑。本發明的肽可用於補充或抑制APRF的功能，篩選抗APRF功能的抑制藥劑。以本發明的所述產物為活性成分的抑制劑也可用於治療與細胞激活素即IL-6有關的疾病，即炎症疾病。
文檔編號H01L23/525GK1113517SQ95104590
公開日1995年12月20日 申請日期1995年4月4日 優先權日1994年4月4日
發明者審良靜男, 岸本忠三 申請人:岸本忠三