犬源化腫瘤壞死因子抗體及其使用方法

2023-06-01 16:20:21

犬源化腫瘤壞死因子抗體及其使用方法
【專利摘要】本發明提供了特異性結合犬腫瘤壞死因子並抑制犬TNF結合TNFR1受體能力的犬源化抗體和嵌合抗體及其抗原結合片段。本發明還延及編碼犬源化抗體和嵌合抗體及其抗原結合片段的核酸和使用所述抗體和/或核酸治療犬慢性炎性疾病如關節炎的方法。
【專利說明】犬源化腫瘤壞死因子抗體及其使用方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及充當犬腫瘤壞死因子α抑制劑的結合抗體及其片段。本發明延及製備這些抗體及其片段的方法以及這些結合抗體和片段在治療犬的由腫瘤壞死因子介導的慢性炎症病症如關節炎中的治療用途。
[0002]發明背景
[0003]腫瘤壞死因子a (TNF- a、TNF- α、TNF)是在免疫、炎症、細胞增殖控制、分化和細胞凋亡方面發揮多效性功能的有效細胞因子。已經證明，使用腫瘤壞死因子受體(TNFR)免疫球蛋白Fe結構域融合蛋白或抗TNF中和單克隆抗體抑制TNF是治療包括風溼病關節炎和銀屑病性關節炎在內的各種人炎性疾病的成功的治療途徑。
[0004]寵物動物如狗會發生類似的炎性疾病，包括骨關節炎、免疫介導的多發性關節炎、血漿-淋巴細胞滑膜炎、系統性紅斑狼瘡(SLE)、血管炎和各種自身免疫性皮膚疾病。據估計，在美國五分之一的成年狗有關節炎，並且狗被用作人關節疾病如骨關節炎、前交叉韌帶撕裂和半月板損傷的模型。
[0005]已有大量的文件證明TNF在狗發生炎症中的作用。例如，封閉的胸部模型中由球囊閉塞引起缺血再灌注後，用TNF抑制劑依那西普(huTNFR-Fc)處理狗，使心肌損傷降低約25-40%，同時伴隨有相關的炎症標記物如ICAM-1和NF_kB的減少。同樣，也已經證明，在缺血-再灌注的開胸狗模型中使用2mg/kg TNFR-Fc，梗死面積降低60%。
[0006]而且，在患有膝關節炎的狗的滑液的細胞浸潤物中，TNF-α的分泌增加。已經顯示，在患有青光眼的狗的中心視網膜和外圍視網膜中，作為廣泛的炎性反應的一部分，TNF受體和II型TNF受體顯著增加。抗犬TNF MAb已用於通過捕捉ELISA法檢測用LPS處理的犬PBMC的上清液中低水平的TNF。還報導過，在犬血管外皮細胞瘤、成視網膜細胞瘤(tricoblastoma)、脂肪瘤和肥大細胞瘤的皮膚樣品中存在TNF-α表達。在骨關節炎的誘導模型中，犬關節軟骨中存在TNF- α受體和TNF受體。已經在患剝脫性皮膚型紅斑狼瘡(ECLE)的兩隻狗中測試了抗TNF的人源化單克隆抗體阿達木單抗(每兩周0.5mg/kg，共8周)，但是疾病進展照舊且血清TNF- α水平無變化。
[0007]由於TNF參與犬的各種炎性介導的病症，因此需要可用於長期抑制TNF的犬TNF抑制劑，從而預防或治療所述慢性炎性病症。
[0008]發明概述
[0009]經過大量的努力，本發明人意外地確定出一種製備抗體的方法，該方法產生了特異性結合犬TNF且中和犬TNF的生物活性的抗體和結合片段。特別是，本文表明，儘管在該抗體的框架區中引入了大量的胺基酸修飾，由於這些修飾是以新穎的和創造性的方式作出的，因此本發明的抗體和結合片段仍然以高特異性結合犬TNF。進一步證明，該結合通過抑制犬TNF與TNF受體表達 的細胞膜結合來使犬TNF的生物活性減退。因而，這將能夠預防犬的TNF介導的誘導的發生、炎性介導的疾病如關節炎的發展或進展。
[0010]使用重組DNA方法生產本發明的抗體，且本發明的抗體顯示對犬TNF的結合特異性，同時還具有犬的框架和恆定結構域序列，以降低將其施用至犬宿主時它們的免疫原性。結果，使異種抗體誘導的風險最小。由於使用標準方法如CDR移植等不能產生該抗體，因此對犬TNF的結合特異性完全是出人意料且意想不到的。
[0011]根據本發明的第一方面，提供了特異性結合犬腫瘤壞死因子(TNF)犬源化抗體或其抗原結合片段。
[0012]在某些實施方案中，通過下述方法製備該抗體，其包括或基本上由以下步驟組成:
[0013]-提供來自犬之外的物種的供體抗體，其中所述供體抗體對腫瘤壞死因子具有結合特異性；
[0014]-將所述供體抗體框架區胺基酸序列的每一胺基酸殘基與存在於一個或多個犬抗體框架區的胺基酸序列中對應位置的每一胺基酸殘基進行比較，以鑑別出所述供體受體框架區胺基酸序列內與所述一個或多個犬抗體框架區的胺基酸序列的對應位置的一個或多個胺基酸殘基不同的一個或多個胺基酸殘基；以及
[0015]-用存在於一個或多個犬抗體中對應位置的一個或多個胺基酸殘基取代所述供體抗體中一個或多個鑑別出的胺基酸殘基。
[0016]上述方法修飾了犬中使用的供體抗體，通過這種方式使得修飾的抗體的框架區內的任何位置不含有對犬中的該位置而言是外來的任何胺基酸。因此，修飾的抗體保留了供體抗體對靶抗原的特異性和親和性，但重要的是這種修飾並沒有產生潛在的外來表位。因此，犬中修飾的抗體並不視為是外來的，並因此沒有引起可能導致中和抗體功效的免疫反應，尤其是在長期施用後。
[0017]在某些實施方案中，取代所述一個或多個鑑別出的胺基酸殘基的步驟包括，用存在於對應位置的與所述一個或多個取代的胺基酸殘基具有最高同源性的一個或多個胺基酸殘基來取代所述一個或多個鑑別出的胺基酸殘基。
[0018]在某些實施方案中，該方法還包括用衍生自犬抗體的重鏈和/或輕鏈的恆定結構域取代所述供體抗體的重鏈和/或輕鏈的恆定結構域的步驟。
[0019]上述方法並不包括⑶R移植。根據上述方法製備的抗體包含供體抗體的⑶R、根據上述方法製備的犬源化框架區，以及犬的恆定結構域。
[0020]本發明延及根據上述方法製備的抗體例如以下描述的那些抗體及其片段。
[0021]因此，根據本發明的另一方面，提供了包含肽的組合物或編碼肽的核酸序列，其中所述肽包含選自以下的胺基酸序列:SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8 和 SEQ ID NO:9。通常，所述肽結合腫瘤壞死因子α。在某些實施方案中，所述肽是犬源化抗體或嵌合抗體或其結合片段。在某些實施方案中，根據以上描述的製備抗體的方法製備犬源化抗體。
[0022]在某些方面，本發明提供了包含犬腫瘤壞死因子α結合劑的組合物或編碼腫瘤壞死因子α結合劑的寡核苷酸，其中所述結合劑包含選自以下的胺基酸序列:SEQ IDN0:USEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID Ν0:7、SEQ ID NO:8 和 SEQ ID NO:9。
[0023]本發明的另一方面提供了特異性結合犬腫瘤壞死因子(TNF)尤其是犬TNF-α的犬源化抗體或嵌合抗體或其抗原結合片段。通常，犬源化抗體或嵌合抗體或由其衍生的抗原結合片段中和犬TNF的生物活性。特別是，犬源化抗體或嵌合抗體或結合片段與犬TNF的結合隔絕了犬TNF結合和激活膜相關的犬TNF受體的能力。在某些實施方案中，犬源化抗體或嵌合抗體包含選自以下的胺基酸序列:SEQ ID NO: K SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8 和 SEQ ID NO:9。在某些實施方案中，根據以上描述的製備抗體的方法來製備犬源化抗體。
[0024]本發明的又一方面提供了犬源化抗體，其結合補體且啟動補體介導的TNF-α表達細胞的細胞裂解。這類抗體將減少TNF表達炎性細胞的數目，從而導致體內長期抗炎活性。在某些實施方案中，根據以上描述的製備抗體的方法來製備犬源化抗體。
[0025]在本發明的以上方面的某些實施方案中，所述犬源化抗體或嵌合抗體或其結合片段以Kd為IX 10_8或更小的結合親和力結合TNF。
[0026]在本發明的另一或相關方面，提供了中和抗體或其抗原結合片段，其能夠特異性結合犬腫瘤壞死因子α (TNF-α)，所述抗體或抗體結合片段包含、組成為或基本組成為輕鏈可變結構域和/或重鏈可變區，所述輕鏈可變結構域包含胺基酸序列SEQ ID NO:1或與其具有至少85、90、95或99%的同一性的胺基酸序列，所述重鏈可變區包含胺基酸序列SEQID NO: 2或與其具有 至少85、90、95或99%的同一性的胺基酸序列。通常，所述抗體是嵌合抗體或犬源化抗體。
[0027]在所述抗體是犬源化抗體或其片段的某些實施方案中，所述抗體或其片段包含、組成為或基本組成為輕鏈，所述輕鏈包含胺基酸序列SEQ ID N0:3或與其具有至少85、90、95或99%的同一性的胺基酸序列。
[0028]在某些實施方案中，所述重鏈(VH)的可變區結合至包含至少一個免疫球蛋白恆定結構域的另一胺基酸序列。在某些實施方案中，所述免疫球蛋白恆定結構域衍生自子類IgG(免疫球蛋白G)的抗體，以形成本發明的犬源化抗體的完整重鏈。已知四種不同的犬重鏈恆定結構域。通常，所述恆定結構域包含CHl、CH2和CH3區以及位於CHl和CH2區之間的合適的連接體(或「鉸鏈(hinge) 」)。
[0029]在某些實施方案中，犬源化抗體或抗體結合片段包含、組成為或基本組成為重鏈，所述重鏈包含選自以下的胺基酸序列:SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6和SEQ IDNO: 7，或與所述胺基酸序列具有至少85、90、95或99%的同一性的胺基酸序列。在某些實施方案中，所述嵌合抗體或抗體結合片段包含、組成為或基本組成為重鏈，所述重鏈包含胺基酸序列SEQ ID N0:9或與其具有至少85、90、95或99%的同一性的胺基酸序列。在某些實施方案中，所述嵌合抗體包含重鏈，所述重鏈具有選自以下的胺基酸序列:SEQ ID NO:20,SEQ ID NO: 21和SEQ ID NO: 22，或與所述胺基酸序列具有至少85、90或95%的序列同源性的胺基酸序列。
[0030]在抗體是犬源化抗體的實施方案中，所述抗體具有胺基酸序列，其中通過缺失、添加和/或取代使殘基改變以使序列去免疫，從而當施用至犬個體時不會產生對抗其的異種抗體。特別是，所述抗體包含犬衍生的框架和恆定結構域胺基酸序列。
[0031]在另一方面，本發明延及中和抗體或其抗原結合片段，其特異性結合犬腫瘤壞死因子(TNF)，所述抗體或抗體結合片段包含、組成為或基本上組成為輕鏈和重鏈，其中所述輕鏈(VL)的可變區包含胺基酸序列SEQ ID N0:1或與其具有至少85、90、95或99%的同一性的胺基酸序列，且其中所述重鏈(VH)的可變區包含、組成為或基本上組成為與胺基酸序列SEQ ID NO: 2相同或基本上同源的胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 2具有至少85、90、95或98 %的同一性的胺基酸序列。
[0032]在某些實施方案中，所述抗體是包含輕鏈和/或重鏈的犬源化抗體，所述輕鏈包含、組成為或基本上組成為胺基酸序列SEQ ID NO: 3,所述重鏈包含、組成為或基本上組成為選自以下的胺基酸序列:SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6和SEQ ID NO: 7，或與所述胺基酸序具有至少85%胺基酸同一'丨生、更優選95%以及最優選至少98%同一'丨生的的序列。通常，所述輕鏈是K輕鏈。
[0033]在某些實施方案中，所述抗體是包含輕鏈和/或重鏈的嵌合抗體，所述輕鏈包含、組成為或基本上組成為胺基酸序列SEQ ID NO:8或與其具有至少85%、更優選95%以及最優選至少98%同一性的胺基酸同一性的序列，所述重鏈包含、組成為或基本上組成為胺基酸序列SEQ ID N0:9或與其具有至少85%、更優選95%以及最優選至少98%同一性的胺基酸同一性的序列。通常，所述輕鏈是K輕鏈。
[0034]在其他的實施方案中，本發明的抗體或結合片段延及非糖基化變體，其中使適合於糖基化的恆定結構域胺基酸殘基缺失或用不能被糖基化的殘基取代，從而阻止糖基化。
[0035]本發明人進一步限定了一系列可以與互補決定區(CDR)結合以形成犬源化重鏈可變結構域和犬源化輕鏈可變結構域的框架區(FR)。每一個重鏈結構域和輕鏈結構域都具有4個框架區，稱為FR1、FR2、FR3和FR4。
[0036]抗體分子可以包含重鏈可變結構域，其包含⑶R1、⑶R2和⑶R3區以及相關的插入框架區。重鏈可變結構域(VH)⑶R稱為VHCDR，根據卡巴特編號系統(Kabat numberingsystem)在下列位置可以找到這些⑶R:VHCDRl -卡巴特殘基31-35、VHCDR2 -卡巴特殘基 50-65、VHCDR3 -卡巴特殘基 95-102 (Kabat EAet al.(1991) Sequences of proteinsof immunological interest (具有免疫學重要性的蛋白質序列),5thedition.Bethesda:USDepartment of Health and Human Services)。而且，抗體進一步包含輕鏈可變結構域，其包含⑶R1XDR2和⑶R3區以及相關的插入框架區。輕鏈可變結構域(VL)⑶R稱為VIXDR，根據卡巴特編號系統在下列胺基酸殘基位置可以找到這些⑶R:VIXDRl -卡巴特殘基24-34、VLCDR2-卡巴特殘基50-56、VLCDR3 -卡巴特殘基89-97。輕鏈可變結構域或重鏈可變結構域包含四個框架區，FRU FR2、FR3 和 FR4，按下列排列:FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3_FR4與Q)R穿插。
[0037]在另一方面，本發明延及抗犬TNF抗體或其犬TNF結合片段，所述抗體或抗體結合片段包含輕鏈可變區和/或重鏈可變區，所述輕鏈可變區包含以下中的至少一個:
[0038]由胺基酸序列SEQ ID NO: 10組成或包含所述胺基酸序列的FRl框架區；
[0039]由胺基酸序列SEQ ID NO: 11組成或包含所述胺基酸序列的FR2框架區；
[0040]由胺基酸序列SEQ ID NO: 12組成或包含所述胺基酸序列的FR3框架區；以及
[0041]由胺基酸序列SEQ ID NO: 13組成或包含所述胺基酸序列的FR4框架區；
[0042]所述重鏈可變區，包含以下中的至少一個:
[0043]由胺基酸序列SEQ ID NO: 14組成或包含所述胺基酸序列的FRl框架區；
[0044]由胺基酸序列SEQ ID NO: 15組成或包含所述胺基酸序列的FR2框架區；
[0045]由胺基酸序列SEQ ID NO: 16組成或包含所述胺基酸序列的FR3框架區；以及
[0046]由胺基酸序列SEQ ID NO: 17組成或包含所述胺基酸序列的FR4框架區。
[0047] 通常，輕鏈⑶R和重鏈⑶R衍生自對犬TNF具有結合特異性的抗體。[0048]通常，本發明的犬源化抗犬TNF抗體由重組DNA方法產生，其不需要將回復突變引入輕鏈可變結構域或重鏈可變結構域的框架區內。
[0049]在某些實施方案中，包含以上描述的所述至少一個框架區的輕鏈可變結構域與犬衍生輕鏈恆定結構域結合，犬衍生輕鏈恆定結構域通常為輕鏈K恆定結構域，但任選地為λ輕鏈。在某些實施方案中，所述輕鏈包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 10的FRl區、具有胺基酸序列SEQ ID NO: 11的FR2區、具有胺基酸序列SEQ ID NO: 12的FR3區、具有胺基酸序列SEQ ID Ν0:13的FR4區，或與前述胺基酸序列具有至少60、70、80、90、95或98%序列同一性的胺基酸序列的框架區。在某些實施方案中，所述同一性是在至少約5個胺基酸，優選約10個胺基酸的長度上。
[0050]在某些另外的實施方案中，包含以上描述的至少一個框架區的重鏈可變區與犬衍生重鏈恆定結構域結合。在某些實施方 案中，恆定結構域的胺基酸序列沒有任何翻譯後修飾，或者可以經修飾而除去可能經歷N-連接或O-連接糖基化的任何殘基或全部殘基，這樣使得恆定結構域不發生糖基化。在某些實施方案中，重鏈包含具有胺基酸序列SEQ IDNO: 14的FRl區、具有胺基酸序列SEQ ID NO: 15的FR2區、具有胺基酸序列SEQ ID NO: 16的FR3區和具有胺基酸序列SEQ ID NO: 17的FR4區，或具有與前述胺基酸序列有至少60、70、80、90、95或98%序列同一性的胺基酸序列的框架區。在某些實施方案中，所述同一性是在至少約5個胺基酸，優選約10個胺基酸的長度上。
[0051]在某些另外的實施方案中，可以對本文描述的框架區進行修飾。也就是說，
【發明者】已確認，對於每一框架區中的一些殘基來說，可以為指定位置選擇胺基酸殘基。重要的是，這些框架區修飾不會導致向互補決定區的構象改變，這是由於這可能會不利地改變所得抗體的結合特異性和/或親和性。在某些實施方案中，本發明延及將2個或多個胺基酸取代引入到輕鏈可變區和/或重鏈可變區的框架區的胺基酸殘基。
[0052]因此，在某些另外的實施方案中，本發明延及包含具有FRl區的輕鏈可變結構域的多肽，例如抗體或其抗原結合片段，所述FRl區包含通過以下一個或多個胺基酸取代而修飾的胺基酸序列SEQ ID NO: 10，所述胺基酸的取代為(其中胺基酸用其單字母代碼表示):位置5的胺基酸殘基T (Τ5)被胺基酸殘基M或I取代，S7是T，A 9是L或P，S12是A，L13 是 V，S14 是 T 或 R，Q15 是 P 或 R，Ε16 是 D，Κ18 是 E、A、P、T 或 L，V19 是 A，Τ20是S，Τ22是S或Y，以及C23是Y。
[0053]在某些另外的實施方案中，具有胺基酸序列SEQ ID NO: 11的輕鏈FR2區可以通過以下一個或多個胺基酸取代進行修飾:Υ2是F、I或L，Q3是R、L或I，Q4是H，Κ5是R，Ρ6是3或八，67是0，人9是5、1'或卩，1(11是03或1?，1^2是1?、？、6、人或5，114是L，以及Υ15 是 F、N、S、E 或 V。
[0054]在某些另外的實施方案中，具有胺基酸序列SEQ ID NO: 12的輕鏈FR3區可以通過以下一個或多個胺基酸取代進行修飾:G1是A、V2是A、P3是S，S4是D，F6是L或V，S7是 I，G8 是 A，T13 是 A，D14 是 E，T16 是 S 或 R，L17 是 F，T18 是 R 或 K，S21 是 R、G 或 T，L22 是 V，P24 是 A，E25 是 D、G、I 或 N，V27 是 A、T、G 或 S，A 28 是 G，以及 V29 是 I 或 L。
[0055]在某些另外的實施方案中，具有胺基酸序列SEQ ID NO: 13的輕鏈FR4區可以通過以下一個或多個胺基酸取代進行修飾:G2是S，Q3是A、P或T，G4是E，T5是P，K6是Q或S，V7是L或W，E8是D或R，以及19是L。[0056]在某些另外的實施方案中，具有胺基酸序列SEQ ID NO: 14的重鏈FRl區可以通過以下一個或多個胺基酸取代進行修飾:E1是D或G、V2是G、L、E、I或M，Q3是H、R、A、V、E、K、L、P 或 S，L4 是 V 或 P，V5 是 A、L、E 或 M，E6 是 Q 或 A，S7 是 F、L 或 T，G9 是 E，GlO是 D、A、N、E 或 T，L11 是 Q、R、V 或 W，V12 是 A、I 或 M，Q13 是 K、R 或 N，P14 是 F 或 T，G15是 A、E 或 T，G16 是 E 或 A，S17 是 T 或 P，L18 是 R，R19 是 K、T、G 或 V，L20 是 I 或 V，S21是 Y，A 23 是 V、L、I 或 E，人24是1\￥、6、1或5，525是？、6或1'，626是0、1?或1'，以及 F27是 L、1、S、D、T 或 V。
[0057]在某些另外的實施方案中，具有胺基酸序列SEQ ID NO: 15的重鏈FR2區可以通過以下一個或多個胺基酸取代進行修飾:W1是C，V2是1、A、F或L，Q4是L或H，A5是S、T、G、P、V 或 D，P6 是 L，G7 是 E、R 或 L，K8 是 R、E、G、A、M 或 Q，G9 是 E、R、D、T 或 V，LlO 是T、P、F*M，Ell 是 Q、H、D、L、P 或 R，W12 是 L、C、S、Y、F 或 M，V13 是 L、I 或 F，以及 S14 是A、T、G 或 L。
[0058]在某些另外的實施方案中，具有胺基酸序列SEQ ID NO: 16的重鏈FR3區可以通過以下一個或多個胺基酸取代進行修飾:R1是Q，F2是V或L，T3是A、I或S，14是V、L、M或T，S5 是 A、F或 T，R6 是K，D7 是E 或N，N8 是D、T、S、I 或G，A 9 是 G、V、S、D、P 或 T，KlO 是 R、E、N、Q、G 或 M，Nll 是 D、S、K、H 或 R, S12 是 T、M、I 或 A，L13 是 V、M、A 或 I，Y14是 F、H、S 或 T，L15 是 I，Q16 是 H、E、D、R 或 A，M17 是 L，N18 是 D、S、T、H、K、P 或 R，S19 是G、D、R、N 或 T，L20 是 V，R21 是 T、G、K、S 或 I，A 22 是 V、D、T、S、G 或 P，E23 是 D、A 或 V，T25 是 A、S 或 M，A 26 是 G 或 V，V27 是 M、1、L、F、T、K 或 Q，Y28 是 H，Y29 是 F 或 H，A 31是￥、1\6、]?、1?、5、(:或1^ 以及 K32 是 R、S、N、G、A、T、P、D、Q、V、E、1、Μ。
[0059]在某些另外的實施方案中，具有胺基酸序列SEQ ID NO: 17的重鏈FR4區可以通過以下一個或多個胺基酸取代進行修飾=Wl是L，G2是A或S，Q3是P、H、R或D，Τ5是A、S、I 或 N，L6 是 S、Q、P 或 R，V7 是 L、I 或 P，Τ8 是 F、1、A、S、L、P 或 Y，V9 是 A，SlO 是 A、C、P或Τ，以及Sll是L、A或P。
[0060]在某些實施方案中，所述抗體是單克隆抗體。通常，所述抗體是犬源化抗體或其片段。或者，所述抗體是嵌合抗體或其片段。
[0061]在某些另外的實施方案中，本發明的犬源化或嵌合TNF中和抗體或由其衍生的結合片段與犬TNF-α (腫瘤壞死因子α )特異性結合且其結合親和性的平衡解離常數(Kd)為IxlO-8或更小。而且，優選該犬源化抗體或嵌合抗體不與犬內存在的任何其他表位交叉反應，並且進一步，當將本發明的抗體施用於犬時，不產生針對本發明的抗體的異種抗體。此外，優選當體內並不需要短期抗炎活性時，犬TNF結合抗體的恆定結構域不介導任何下遊的效應子功能，其包括但不限於補體的結合和激活、A DCC和Fe受體的結合和激活。這類恆定結構域選自由以下組成的重鏈:SEQ ID Ν0:4、非糖基化的SEQ ID NO:4、非糖基化的SEQID Ν0:5、非糖基化的 SEQ ID NO:6、非糖基化的 SEQ ID Ν0:7 和 SEQ ID Ν0:7。
[0062]在某些其他實施方案中，優選當體內需要短期抗炎活性時，犬TNF結合抗體的恆定結構域介導效應子功能，其包括但不限於補體的結合和激活、A DCC和Fe受體的結合和激活，這導致體內犬TNF表達細胞的除去。這類恆定結構域選自由SEQ ID Ν0:5和SEQ IDNO:6組成的重鏈。
[0063]在某些另外的實施方案中，可以對本發明的抗體進行重鏈的恆定區的胺基酸序列修飾。所述修飾可以包括一個或多個胺基酸殘基的添加、取代或缺失。通常為了改變抗體的功能特性而進行這些胺基酸的改變。例如，可以進行胺基酸修飾以防止被抗體恆定結構域介導的下遊效應子功能，例如通過防止抗體結合Fe受體、激活補體或誘導ADCC的能力。此外，為了改變當施用於犬時抗體的循環半衰期，可以對重鏈恆定結構域的胺基酸殘基進行修飾。
[0064]本發明延及結合犬TNF並且隔絕其結合TNFR的能力的抗體片段。
[0065]在某些實施方案中，抗體結合片段可以包含通過柔性連接體連接以形成單鏈抗體的本發明的重鏈和輕鏈序列。
[0066]單鏈Fv (scFv)包含VH結構域和VL結構域。VH結構域和VL結構域結合形成革巴結合位點。這兩個結構域通過肽連接體共價連接。scFv分子在N末端需要輕鏈可變結構域的情況下可以具有VL-連接體-VH的形式，或在N末端需要VH結構域的情況下為VH-連接體-VL的形式。因此，在某些另外的實施方案中，抗原結合片段是單鏈Fv(ScFv)抗體片段。在某些另外的實施方案中，抗體結合片段選自Fab抗體片段、Fab』抗體片段、F(ab』)2抗體片段、Fv抗體片段、scFV抗體片段等，但並不限於此。[0067]在一些實施方案中，本發明提供了用於聯合療法的多特異性或多價抗體，其包含與具有不同結合特異性的其他抗體偶聯或結合的本發明的抗TNF抗體或結合片段。多特異性抗體包含對第一 TNF表位有特異性的至少一個抗體或結合片段，和對TNF上存在的另一表位或對不同的抗原有特異性的至少一個結合位點。多價抗體包含對同一 TNF表位有結合特異性的抗體或抗體結合片段。因此，在某些實施方案中，本發明延及包含本發明的犬源化抗體的四個或更多Fv區或Fab區的抗體融合蛋白。另外的實施方案還延及抗體融合蛋白，其包含衍生自本文描述的抗體的一個或多個Fab區與來自對TNF有特異性的抗體的一個或多個Fab區或Fv區。在某些另外的實施方案中，本發明延及雙特異性抗體，其中本發明的抗體或其結合片段與對第二靶標有結合特異性的第二抗體或其結合片段連接，所述靶標不是TNF。優選地，所述第二靶標通過TNFRl受體有助於阻止TNF介導的信號傳導。可以通過本領域技術人員熟知的多種重組方法來製得這樣的多價抗體、雙特異性抗體或多特異性抗體。
[0068]本發明的另一方面提供了治療或預防有需要的犬的免疫介導的病症的方法，該方法包括以下步驟:
[0069]提供治療有效量的本發明的抗體或其抗原結合片段，其特異性結合犬TNF-α ;以及
[0070]將所述抗體或其抗原結合片段施用至犬。
[0071]在某些實施方案中，該抗體是犬源化抗體。
[0072]在某些實施方案中，所述抗體是犬源化抗體。在某些實施方案中，所述犬源化抗體包含輕鏈可變結構域和/或重鏈可變結構域，所述輕鏈可變結構域包含胺基酸序列SEQ IDNO:1或與所述胺基酸序列具有至少85%同一性的序列，所述重鏈可變結構域包含胺基酸序列SEQ ID N0:2或與所述胺基酸序列具有至少85%序列同源性的胺基酸序列。
[0073]在某些實施方案中，所述犬源化抗體包含輕鏈和/或重鏈，所述輕鏈具有胺基酸序列SEQ ID N0:3或與所述胺基酸序列具有至少85%序列同一性的序列，所述重鏈包含、組成為或基本組成為:選自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7的胺基酸序列，或與所述胺基酸序列具有至少85%胺基酸同一性、更優選為至少98%同一性的序列。
[0074]在某些實施方案中，所述抗體是包含輕鏈和/或重鏈的嵌合抗體，所述輕鏈具有胺基酸序列SEQ ID NO:8，所述重鏈具有胺基酸序列SEQ ID N0:9或與其具有至少85%序列同源性的胺基酸序列。在某些實施方案中，所述嵌合抗體包含重鏈，所述重鏈具有選自以下的胺基酸序列:SEQ ID NO:20,SEQ ID N0:21和SEQ ID NO:22或與所述胺基酸序列具有至少85%、90%或95%序列同源性的胺基酸序列。
[0075]在某些實施方案中，免疫介導的病症是慢性炎性疾病。所述慢性炎性疾病可以選自以下:風溼性關節炎(RA)、骨關節炎和其他多發性關節炎、強直性脊椎炎(AS)、克羅恩病和潰瘍性結腸炎、銀屑病和銀屑病性關節炎(PsA)、系統性血管炎、異位性皮炎、充血性心力衰竭(CHF)、難治性葡萄膜炎、支氣管哮喘和過敏病症，但不限於此。炎性介導的病症還可以包括敗血症和休克、糖尿病和神經退化性病症如阿茲海默病、帕金森氏病、中風和肌萎縮性脊髓側索硬化症。針對TNF-α的單克隆抗體還可以用於預防或治療癌症惡病質、皮膚腫瘤如基底細胞癌、結腸直腸癌和卵巢癌。
[0076]在某些其他的實施方案中，免疫介導的病症可以是TNF-α相關病症(disorder)或其中TNF-α是關鍵炎性介質的病症。這類病症包括但不限於:白塞氏病、大皰性皮炎、嗜中性皮炎、中毒性表皮壞死松解症、系統性血管炎、壞疽性膿皮病、化膿性皮炎、酒精性肝炎、腦型瘧、溶血性尿毒綜合症、先兆子癇、同種異體移植排斥、中耳炎、蛇咬傷、結節性紅斑、骨髓增生異常綜合症、移植物抗宿主疾病、皮肌炎和多肌炎。
[0077]根據本發明的又一方面，提供了治療有需要的犬個體的關節炎或關節炎病症的方法，所述方法包括以下步 驟:
[0078]提供治療有效量的本發明的抗犬TNF抗體或其抗原結合片段；以及
[0079]將所述抗犬TNF抗體或其抗原結合片段施用至犬。
[0080]在某些實施方案中，該抗體是犬源化抗體。在某些實施方案中，該犬源化抗體包含輕鏈可變結構域和/或重鏈可變結構域，所述輕鏈可變結構域包含胺基酸序列SEQ ID NO:1或與所述胺基酸序列具有至少85%同一性的序列，所述重鏈可變結構域包含胺基酸序列SEQ ID N0:2或與所述胺基酸序列具有至少85%序列同源性的胺基酸序列。
[0081]在某些實施方案中，關節炎或關節炎病症包括選自以下的病症:免疫介導的多發性關節炎、風溼性關節炎、骨關節炎、銀屑病性關節炎、幼年特發性關節炎、強直性脊椎炎和相關病症。
[0082]通常，關節炎或關節炎病症的治療包括減輕、抑制、降低或壓制導致關節炎病症、與其相關的或由其引起的免疫反應。
[0083]本發明的又一方面提供了治療有需要的犬中由犬TNF表達增加或對TNF敏感性增加引起的或與其相關的或導致其的病症的方法，所述方法包括以下步驟:
[0084]提供治療有效量的本發明的抗犬TNF抗體或其抗原結合片段；以及
[0085]將所述抗犬TNF抗體或其抗原結合片段施用至犬。
[0086]在某些實施方案中，本發明的前述方法進一步包括共施用至少一種另外的藥劑的步驟，該藥劑可以提高和/或補充本發明的抗TNF抗體的功效。例如，該抗體或其抗原結合片段可以與一種或多種額外的藥物組合物共施用，所述額外的藥物組合物包括有助於治療慢性炎性病症尤其是TNF-α相關病症的藥物。特別是，所述額外的藥物組合物可以是氨甲喋呤、可溶的p55或p75TNF受體或其衍生物、針對犬TNF的嵌合抗體或犬抗體、抗犬TNF抗體片段、至少一種鎮痛劑、抑制抗炎性藥物的細胞因子化合物、NSAID、阿片樣物質、皮質類固醇、類固醇或神經生長因子拮抗劑如抗NGF抗體。
[0087]合適的鎮痛劑的實例包括但不限於布託啡喏、丁丙諾啡、芬太尼、氟尼辛葡甲胺(flunixin meglumine)、哌替唳、嗎啡、納布啡及其衍生物。合適的NS A ID包括但不限於對乙醯氨基酚、乙醯水楊酸、卡洛芬、依託度酸、酪洛芬、美洛昔康、非羅考昔、羅貝考昔(robenacoxib)、德拉昔布等。
[0088]在某些另外的實施方案中，所述至少一種另外的藥劑可以是活性治療劑，其可以是選自抗生素、抗真菌劑、抗原生動物劑、抗病毒治療劑或類似治療劑中的一種或多種。而且，所述至少一種另外的藥劑可以是炎症介質(mediator)的抑制劑,例如PGE受體拮抗劑，免疫抑制劑例如環孢黴素，或抗炎糖皮質激素。在某些另外的方面中，所述至少一種另外的藥劑可以是用於治療認知功能障礙或損傷的藥劑，例如老齡犬中可能日益普遍的失憶或相關病症。而且，所述至少一種另外的藥劑可以是用於治療心血管疾病的抗高血壓藥劑或者其他化合物，例如以治療高血壓、心肌缺血、充血性心力衰竭等。此外,所述至少一種另外的藥劑可以是利尿劑、血管擴張劑、β腎上腺素受體拮抗劑、血管緊張肽II轉化酶抑制劑、鈣通道阻滯劑或HMG-Co A還原酶抑制劑。
[0089]在某些實施方案中，作為前述方法的一部分，將抗體或抗原結合片段以從約0.01mg/kg體重至約3mg/kg體重,特別是從約0.03mg/kg體重至約3mg/kg體重的劑量施用至犬。
[0090]在各種其它方面，本發明延及包含本發明任何前述方面的抗體或其結合片段的組合物。在某些實施方案中，所述組合物進一步包含至少一種藥學上可接受的載體。
[0091]本發明的另一方面提供了用於治療導致犬慢性疼痛或由犬的慢性疼痛引起的疼痛或病症的藥物組合物，其包含藥學有效量的本發明的抗犬TNF犬源化抗體，以及至少一種藥學上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑。
[0092]在某些實施方案中，所述組合物可以進一步包括氨甲喋呤或至少一種鎮痛劑、NSA ID、阿片樣物質、皮質類固醇、類固醇或神經生長因子的拮抗劑。
[0093]在各種其它方面，本發明延及編碼本發明的抗體或抗體結合片段的分離的核酸。
[0094]因此，本發明的另一方面提供了編碼根據本發明任意前述方面的抗體或抗原結合片段的分離的核酸或多核苷酸。在某些實施方案中，核酸或多核苷酸編碼具有胺基酸序列SEQ ID NO:1的抗犬TNF犬源化抗體或抗體片段的輕鏈可變結構域或具有胺基酸序列SEQID NO:3的輕鏈。在某些另外的實施方案中，多核苷酸編碼具有胺基酸序列SEQ ID N0:2的抗犬TNF犬源化抗體或抗體片段的重鏈可變結構域或具有選自胺基酸序列SEQ ID NO: 4,SEQ ID NO:5, SEQ ID N0:6 和 SEQ ID N0:7 的重鏈。 [0095]在某些另外的實施方案中，多核苷酸編碼具有胺基酸序列SEQ ID NO: 8的抗犬TNF嵌合抗體或抗體片段的重鏈可變結構域或具有胺基酸序列SEQ ID N0:9的重鏈。
[0096]在某些實施方案中，所述分離的核酸還編碼與其可操作地連接的一個或多個調控序列。在另一方面，提供了包含多核苷酸的表達載體，該多核苷酸編碼本發明的重鏈可變結構域和/或輕鏈可變結構域，或重鏈恆定結構域和/或輕鏈恆定結構域。在某些實施方案中，所述表達載體進一步包含一個或多個調控序列。在某些實施方案中，所述載體是質粒或逆轉錄病毒載體。本發明的另一方面提供了包括本發明的前述方面的表達載體的宿主細胞。本發明的又一方面提供了產生本發明的任意前述方面的抗體的宿主細胞。
[0097] 本發明的又一方面提供了產生犬源化抗犬TNF中和抗體的方法，該方法包括以下步驟:培養本發明前述方面的宿主細胞以允許該細胞表達犬源化抗犬TNF中和抗體。
[0098]本發明的又一方面提供了產生本發明的抗犬TNF犬源化抗體的方法，包括以下步驟:在合適的宿主細胞內表達本發明前述方面的一個或多個多核苷酸/核酸或載體，其表達本發明抗體的輕鏈和/或重鏈；回收表達的多肽，其可以在一個宿主細胞內一起表達或者在不同的宿主細胞內單獨表達；以及分離抗體。
[0099]本發明的又一方面提供了治療、減輕或抑制犬的疼痛的方法，所述方法包括:將有效量的本發明任意前述方面的多核苷酸、抗體或片段施用至犬。
[0100]本發明的又一方面提供了本發明的任意前述方面的抗體或抗體結合片段，或者本發明前述方面的藥物組合物，或者核酸，或者包含本發明任意前述方面的核酸的載體，用於治療或預防犬的疼痛。
[0101]在某些實施方案中，疼痛是急性疼痛。在某些另外的實施方案中，疼痛是慢性疼痛。而且，疼痛可以是手術後疼痛或者由犬的任何手術方案造成的疼痛，其包括但不限於矯形外科手術、軟組織外科手術、卵巢子宮切除術、閹割手術等。在某些另外的實施方案中，疼痛是與癌症或癌性病症相關的慢性疼痛。在某些另外的實施方案中，疼痛與風溼性關節炎或骨關節炎相關或由其引起。
[0102]本發明的另一方面提供了本發明任意前述方面的抗體或抗體結合片段，或者本發明前述方面的藥物組合物，或者核酸，或者包含本發明任意前述方面的核酸的載體，用於治療關節炎，尤其是免疫介導的多發性關節炎、風溼性關節炎、骨關節炎、銀屑病性關節炎、幼年特發性關節炎或強直性脊椎炎。
[0103]本發明的另一方面提供了本發明任意前述方面的抗體或抗體結合片段，或者本發明前述方面的藥物組合物，或者核酸，或者包含本發明任意前述方面的核酸的載體，在製備用於治療或預防犬的慢性炎性疾病的藥物中的用途。
[0104]本發明的另一方面提供了本發明任意前述方面的抗體或抗體結合片段，或者本發明前述方面的藥物組合物，或者核酸，或者包含本發明任意前述方面的核酸的載體，在製備用於治療、抑制、減輕或預防犬的風溼性關節炎或骨關節炎的藥物中的用途。
[0105]本發明的另一方面提供了產生本發明的抗犬TNF中和單克隆抗體或其片段的細胞系或其衍生細胞或後代細胞。
[0106]本發明的又一方面提供了用於治療犬的慢性炎性疾病、或者用於治療與疼痛相關的病症、或者用於治療、減輕或抑制骨關節炎或風溼性關節炎的試劑盒，所述試劑盒包含本發明任意前述方面的抗犬TNF抗體以及其使用說明。
[0107]本發明的又一方面提供了用於檢測體外、離體和體內的流體中抗犬TNF單克隆抗體的診斷試劑盒，用於確定所述抗體的濃度。該試劑盒可以包含本發明的任意抗體或其結合片段。該試劑盒可以包含其使用說明。
【專利附圖】

【附圖說明】[0108]圖1示出本發明的犬源化抗體的輕鏈可變結構域的胺基酸序列SEQ ID NO:1。
[0109]圖2示出本發明的犬源化抗體的重鏈可變結構域的胺基酸序列SEQ ID NO:2。
[0110]圖3示出本發明的犬源化抗體的輕鏈的胺基酸序列SEQ ID NO:3。
[0111]圖4示出犬源化抗TNF重鏈可變結構域犬IgG-A重鏈(caN_HC A)的胺基酸序列(SEQ ID N0:4)。可變結構域殘基用黑體表示。
[0112]圖5示出犬源化抗TNF重鏈可變結構域犬IgG-B重鏈(caN_HCB)的胺基酸序列(SEQ ID N0:5)。可變結構域殘基用黑體表示。
[0113]圖6示出犬源化抗TNF重鏈可變結構域犬IgG-C重鏈(caN_HCC)的胺基酸序列(SEQ ID N0:6)。可變結構域殘基用黑體表示。
[0114]圖7示出犬源化 抗TNF重鏈可變結構域犬IgG-D重鏈(caN_HCD)的的胺基酸序列SEQ ID NO:7。可變結構域殘基用黑體表示。
[0115]圖8示出嵌合抗TNF抗體的犬K輕鏈的胺基酸序列(SEQ ID N0:8)。可變結構域用黑體表示。
[0116]圖9示出嵌合抗體重鏈可變結構域犬IgG-B重鏈(caN-HCB)的胺基酸序列(SEQID N0:9)。可變結構域用黑體表示。
[0117]圖10(A)示出使用蛋白A純化且通過SDS-PAGE分析的犬源化抗體(SEQ ID NO: 3加上SEQ ID NO: 5)和嵌合抗體(SEQ ID N0:8加上SEQ ID NO:9)共表達的結果；而圖10 (B)示出顯示表達重組蛋白與犬TNF-α結合的ELISA的結果。示出從5ug/ml至0.05ug/ml不同稀釋度的抗體的結果。
[0118]圖11示出使用NF-kB-EGFP報導構建體pTRHl轉染的293-HEK細胞對犬TNF生物活性的抑制。這些細胞通過螢光響應犬TNF。犬源化(SEQ ID N0:3加上SEQ ID N0:5)(圖11A)和嵌合(SEQ ID N0:8加上SEQ ID N0:9)(圖llB)MAb均同樣良好地抑制TNF誘導的螢光(其在圖1lC中量化)。
[0119]圖12(a)示出與基於CHO細胞中表達的抗TNF MAb克隆148且使用蛋白A層析純化的另一犬源化MAb (A圖，左泳道)的比較。與來自圖10的基於犬源化(Ca)和嵌合(Ch)D2E7的MAb比較，測試了 MAb與人TNF(B圖)和犬TNF(C圖)的結合(背景陰性對照結合用箭頭表示)。由該圖可知，基於D2E7的犬源化MAb和嵌合MAb以及本發明的主題顯示出乎意料的與犬TNF的強結合，其相當於與人TNF的結合，而犬源化MAbl48顯示僅與人TNF
結合 ?
[0120]圖12(b)示出犬源化MAbl48的重鏈的胺基酸序列SEQ ID NO: 18。
[0121]圖12(c)示出犬源化MAbl48的輕鏈的胺基酸序列SEQ ID NO: 19。
[0122]圖13示出通過共表達SEQ ID N0:3和SEQ ID NO:5構建的犬源化抗TNF單克隆抗體能夠誘導補體介導的TNF表達細胞的裂解。
[0123]發明詳述
[0124]通過大量的試驗，發明人獲得了 D2E7抗人TNF抗體，之前並不知道該抗體結合犬TNF，並且出乎意料地用其作為基礎產生了特異性結合犬TNF-α的拮抗性抗體。所得到的非免疫原性抗體，其並不是使用標準CDR移植技術產生的，經證明，其顯示了結合犬TNF的高親和性。抗體中和了犬TNF生物功能，最具體的是通過抑制TNF與細胞膜相關的受體TNFRl的結合。而且，還設計成使框架區和恆定區包含僅存在於犬IgG分子中的殘基，從而使得當施用至犬時，不大可能產生針對它的異種抗體。因此，本發明的犬源化抗體適合於長期施用以治療犬的慢性炎性疾病。
[0125]本發明人已使用的產生本發明抗體的重鏈可變結構域和輕鏈可變結構域的方法，導致已知非犬原有的特定供體的胺基酸殘基在該位置被犬殘基取代，基於本發明人的分析，這種取代會在保留CDR區的構象，並因此保留結合特異性和親合力，同時減少免疫原性表位的存在，如果將抗體以不變的形式施用至犬，所述免疫原性表位可能導致針對該抗體的中和抗體的產生。具體而言，製備本發明抗體的方法(被稱為PET化(PETisation))包括:通過將供體抗體框架區的序列與衍生自犬的抗體或抗體庫的序列進行比較，評價供體(例如人)抗體框架區的序列施用至犬的適宜性。儘管該比較是在供體序列與靶序列的單個成員之間進行，但是顯而易見的是，與靶序列庫進行比較是優選的，因為這將擴大靶標種類中每一卡巴特(Kabat)位置的自然選擇的數目。這不但將增加供體與靶標之間匹配的可能性，而且還將擴大不存在匹配的取代的選擇。因此，將能夠選擇出與供體特徵儘可能相近的取代。當供體序列與犬序列在任何卡巴特編號或對應的位置不同時，修飾供體序列以用犬中該位置的天然的胺基酸殘基來取代所提及的胺基酸殘基。
[0126]如果需要取代供體免疫球蛋白框架區中存在的胺基酸殘基，通常採用保守取代的原則來進行，其中胺基酸殘基是用天然位於犬卡巴特位置並且在大小、電荷、疏水性方面與供體序列中被取代的胺基酸儘可能密切相關的胺基酸殘基來取代。目的是選擇不會引起供體抗體的三維結構擾動或破壞或僅引起至少最低程度的擾動或破壞的取代。在某些情況下，將沒有清楚的選擇，並且每一選擇都有利弊。最終的決定可能需要各種備選序列的三維建模甚至表達。然而，通常利用明顯的偏好。作為該步驟的結果，當殘基在靶中是外來的並且該取代胺基酸與被其取代的胺基酸儘可能密切相關時，僅對供體序列作出改變。因而，避免了外來表位的產生，但是由於維持了整個三位結構，因此，還維持了親和性和特異性。
[0127]輕鏈恆定區和重鏈恆定區通常衍生自犬(靶)衍生的抗體。如果希望短期抑制TNF,則將重鏈恆定結構域篩選或修飾成使它們不介導下遊的效應子功能，即HC A、HCD或非糖基化HCB或HCC。如果希望長期抑制TNF，則將重鏈恆定結構域篩選或修飾成使它們介導下遊的效應子功能，即HCB或HCC。而且，在以不影響CDR區的三維構造的方式進行框架殘基取代時，其與期望的靶標的結合特異性將不會改變。
[0128]在人類和小鼠中存在四種主要的IgG同種型，雖然術語是類似的，但它們在行為和功能上是不同的，包括對細菌產物例如蛋白A和蛋白G的親和性，激活補體依賴性細胞溶解(⑶C)的能力以及通過抗體依賴性細胞毒性(ADCC)誘導殺死靶細胞的能力。當將抗體設計為清除具有它們的同源抗原的靶細胞時，用CDC和ADCC活性或「防護的」恆定結構域選擇IgG同種型在臨床上被認為是有益的，例如在腫瘤控制、長期炎性控制或感染控制方面(例如，為了上述目的，在人類醫學應用中優選人IgGl同種型)。相比之下，在其他情況中，例如緩解炎症、疼痛或自身免疫中，激活免疫系統被認為是不可取的，因此優選具有最小⑶C和ADCC活性的人IgG同種型(例如，在這樣的人類醫學應用中，常常優選IgG4同種型)。已經描述了犬免疫系統中的四個不同的免疫球蛋白Y (IgG)重鏈恆定結構域同種型(美國專利號 5852183, Tang L.et al.2001.Veterinary Immunology andImmunopathology, 80.259-270)以及單個κ和λ恆定結構域序列。並沒有按照由其介導的功能活性來表徵四個犬重鏈恆定結構域A、B、C和D。不管與IgG家族的總體同源性如何，與來自其它物種的家族成員相比，編碼犬IgG的蛋白彼此更相關，因此如果將任一種認為是四種犬同種型的每一種，那麼僅通過同源性來限定是上述哪一個發揮功能是不可能的。
[0129]本發明的抗體包含犬來源的重鏈恆定結構域和犬來源的輕鏈恆定結構域。而且，互補決定區衍生自D2E7抗體。D2E7抗體描述於Salfeld et al.，2000和美國專利6090382中。
[0130]將衍生自D2E7抗體的⑶R區與本發明人確定的框架區序列合併來維持⑶R的三級結構，因此維持了結合特異性，同時當將抗體施用至犬時，阻止針對所述抗體產生異種抗體。
[0131]每一輕鏈可變區和重鏈可變區都包含四個框架區，稱為FR1-FR4。對於這些框架區中的每一個，本發明人已經鑑定出每一特定位置的優選胺基酸殘基(所謂的優選殘基)，和還可能在該位置接受的另外可選的胺基酸殘基。表1至表8示出每一重鏈和輕鏈的四個框架區。這些表提供了胺基酸位置，其相對特定框架區，並且還符合用於識別沿完整的重鏈可變結構域或輕鏈可變結構域的長度上特定殘基位置的卡巴特編號系統。使用單字母系統識別氣基酸殘基。 [0132]表1-輕鏈可變結構域FRl殘基
[0133]
【權利要求】
1.犬源化抗體或其抗原結合片段，其特異性結合犬腫瘤壞死因子。
2.如權利要求1所述的犬源化抗體或其抗原結合片段，其中通過以下方法製備所述抗體，所述方法包括下列步驟: 提供來自犬之外的物種的供體抗體，其中所述供體抗體對腫瘤壞死因子具有結合特異性； 將所述供體抗體框架區胺基酸序列的每一胺基酸殘基與存在於一個或多個犬抗體框架區胺基酸序列中對應位置的每一胺基酸殘基進行比較，以鑑別出所述供體抗體框架區的胺基酸序列內與所述一個或多個犬抗體框架區的胺基酸序列內對應位置的一個或多個胺基酸殘基不同的一個或多個胺基酸殘基；以及 用所述一個或多個犬抗體中對應位置存在的一個或多個胺基酸殘基取代所述供體抗體中的一個或多個鑑別出的胺基酸殘基。
3.如權利要求2所述的抗體或其抗原結合片段，其中取代所述一個或多個鑑別出的胺基酸殘基的步驟包括:用所述對應位置存在的與一個或多個被取代的胺基酸殘基具有最高同源性的一個或多個胺基酸殘基取代所述一個或多個鑑別出的胺基酸殘基。
4.如權利要求2或3所述的抗體或其抗原結合片段，其中所述方法進一步包括下述步驟:用犬抗體的重鏈和/或輕鏈恆定結構域取代所述供體抗體的重鏈和/或輕鏈恆定結構域。
5.如權利要求1-4中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變區和/或重鏈可變區，所述輕鏈可變區包含胺基酸序列SEQ ID NO:1或者與所述胺基酸序列具有至少85%同一性的胺基酸序列，所述重鏈可變區包含胺基酸序列SEQ ID N0:2或者與所述胺基酸序列具有至少85%同一性的胺基酸序列。
6.如權利要求5所述的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體包含輕鏈和/或重鏈，所述輕鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO: 3或者與所述胺基酸序列具有至少85%同一性的胺基酸序列，所述重鏈包含選自SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID N0:6和SEQ ID N0:7的胺基酸序列，或與所述胺基酸序列具有至少85%序列同一性的胺基酸序列。
7.如權利要求1-5中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體包含重鏈，所述重鏈包含選自SEQ ID N0:4、非糖基化SEQ ID N0:4、非糖基化SEQ ID N0:5、非糖基化SEQ ID N0:6、非糖基化SEQ ID N0:7和SEQ ID NO:7的胺基酸序列，或與所述胺基酸序列具有至少85%序列同一性的胺基酸序列。
8.如權利要求1-5中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體包含重鏈，所述重鏈包含選自SEQ ID N0:5和SEQ ID NO:6的胺基酸序列，或與所述胺基酸序列具有至少85%序列同一性的胺基酸序列。
9.如權利要求1-4中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變區和/或重鏈可變區，其中所述輕鏈可變區包含以下中的至少一個: 由胺基酸序列SEQ ID NO: 10組成或包含所述胺基酸序列的FRl框架區； 由胺基酸序列SEQ ID NO: 11組成或包含所述胺基酸序列的FR2框架區； 由胺基酸序列SEQ ID NO: 12組成或包含所述胺基酸序列的FR3框架區；以及 由胺基酸序列SEQ ID NO: 13組成或包含所述胺基酸序列的FR4框架區； 所述重鏈可變區包含以下中的至少一個:由胺基酸序列SEQ ID NO: 14組成或包含所述胺基酸序列的FRl框架區； 由胺基酸序列SEQ ID NO: 15組成或包含所述胺基酸序列的FR2框架區； 由胺基酸序列SEQ ID NO: 16組成或包含所述胺基酸序列的FR3框架區；以及 由胺基酸序列SEQ ID NO: 17組成或包含所述胺基酸序列的FR4框架區。
10.如權利要求9所述的抗體或其抗原結合片段，其包含具有SEQID NO: 10的FRl區的輕鏈可變結構域，所述FRl區已通過選自以下的一個或多個胺基酸取代得以修飾:位置.5(T5)的胺基酸殘基T被胺基酸殘基M或I取代，S7是T，A 9是L或P，S12是A，L13是V, S14 是 T 或 R，Q15 是 P 或 R，E16 是 D，K18 是 E、A、P、T 或 L，V19 是 A，T20 是 S，T22 是S或Y，以及C23是Y。
11.如權利要求9或10所述的抗體或其抗原結合片段，其包含具有SEQID NO: 11的FR2區的輕鏈可變結構域，所述FR2區已通過被選自以下的一個或多個胺基酸取代得以修飾:Y2 是 F，I 或 L，Q3 是 R、L 或 I，Q4 是 H，K5 是 R，P6 是 S 或 A，G7 是 D，A 9 是 S、T 或 P，Kll 是 Q、E 或 R，L12 是 R、P、G、A 或 S，114 是 L，以及 Y15 是 F、N、S、E 或 V。
12.如權利要求9-11中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其包含具有SEQIDNO: 12的FR3區的輕鏈可變結構域，所述FR3區已通過被選自以下的一個或多個胺基酸取代得以修飾:Gl是A，V2是A，P3是S，S4是D，F6是L或V，S7是I，G8是A，T13是A，D14 是 E，T16 是 S 或 R，L17 是 F，T18 是 R 或 K，S21 是 R，G 或 T，L22 是 V，P24 是 A，E25 是D、G、I 或 N，V27 是 A、T、G 或 S，A 28 是 G，以及 V29 是 I 或 L。
13.如權利要求9-12中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其包含具有SEQIDNO: 13的FR4區的輕鏈可變結構域，所述FR4區已通過選自以下的一個或多個胺基酸取代得以修飾:G2是S，Q3是A，P或T，G4是E，T5是P，K6是Q或S，V7是L或W，E8是D或R，以19是L。
14.如權利要求9-13中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其包含具有SEQIDNO: 14的FRl區的重鏈可變結構域，所述FRl區已通過選自以下的一個或多個胺基酸取代得以修飾:E1 是 D 或 G，V2 是 G、L、E、I 或 M，Q3 是 H、R、A、V、E、K、L、P 或 S，L4 是 V 或 P，V5是 A、L、E 或 M，E6 是Q或 A，S7 是F、L或T，G9 是E，G10 是 D、A、N、E或T，L11 是Q、R、V或 W，V12 是 A、I 或M，Q13 是K、R或N，P14 是F 或T，G15 是 A、E 或 T，G16 是E 或 A，S17是 T 或 P，L18 是 R，R19 是 K、T、G 或 V，L20 是 I 或 V，S21 是 Y，A 23 是 V、L、I 或 E，A 24 是T、V、G、I 或 S，S25 是 P、G 或 T，G26 是 D、R 或 T，以及 F27 是 L、1、S、D、T 或 V。
15.如權利要求9-14中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其包含具有SEQIDNO: 15的FR2區的重鏈可變結構域，所述FR2區已通過選自以下的一個或多個胺基酸取代得以修飾:W1 是 C，V2 是 I，A，F 或 L，Q4 是 L 或 H，A 5 是 S、T、G、P、V 或 D，P6 是 L，G7 是 E、R 或 L，K8 是 R、E、G、A、M 或 Q，G9 是 E、R、D、T 或 V，LlO 是 T、P、F 或 M，Ell 是 Q、H、D、L、P 或 R，W12 是 L、C、S、Y、F 或 M，V13 是 L、I 或 F，以及 S14 是 A、T、G*L。
16.如權利要求9-15中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其包含具有SEQIDNO: 16的FR3區的重鏈可變結構域，所述FR3區已通過選自以下的一個或多個胺基酸取代得以修飾:R1是Q，F2是V或L，T3是A，I或S，14是V、L、M或T，S5是A、F或T，R6是K，D7 是 E 或 N，N8 是 D、T、S、I 或 G，A 9 是 G、V、S、D、P 或 T，KlO 是 R、E、N、Q、G 或 M，Nll 是D、S、K、H*R，312是1\]\1、1或人，1^13是￥、]\1、人或 I，Y14 是 F、H、S 或 T，L15 是 I，Q16是 H、E、D、R 或八，]\117是1^，附8是0、5、1\!1、1(、？或1?，319是6、0、1?』或1'，1^20是￥，1?21是 T、G、K、S 或 I，A 22 是 V、D、T、S、G 或 P，E23 是 D、A 或 V，T25 是 A、S 或 M，A 26 是 G或 V, V27 是 M、1、L、F、T、K 或 Q，Y28 是 H，Y29 是 F 或 H，A 31 是 V、T、G、M、R、S、C 或 L，以及 K32 是 R、S、N、G、A、T、P、D、Q、V、E、I 或 M。
17.如權利要求9-16中任一項 所述的抗體或其抗原結合片段，其包含具有SEQIDNO: 17的FR4區的重鏈可變結構域，所述FR4區已通過選自以下的一個或多個胺基酸取代得以修飾:W1 是 L，G2 是 A 或 S，Q3 是 P、H、R 或 D，T5 是 A、S、I 或 N，L6 是 S、Q、P 或 R，V7是 L、I 或 P，T8 是 F、1、A、S、L、P 或 Y，V9 是 A，SlO 是 A、C、P 或 T，以及 Sll 是 L、A 或P。
18.嵌合抗體或其抗原結合片段，其特異性結合犬腫瘤壞死因子，其中所述抗體或抗原結合片段包含輕鏈，所述輕鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO:8或者與所述胺基酸序列具有至少85%同一性的胺基酸序列。
19.如權利要求18所述的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段包含重鏈，所述重鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO:9或者與所述胺基酸序列具有至少85%同一性的胺基酸序列。
20.如權利要求18所述的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段包含重鏈，所述重鏈包含選自SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22的胺基酸序列，或者與所述胺基酸序列具有至少85%同一性的胺基酸序列。
21.如權利要求1-20中任一項所述的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段以I X 10_8或更小的結合親和性(Kd)與犬TNF結合。
22.如權利要求1-21中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段與犬TNF的結合抑制犬TNF結合TNFRl受體的能力。
23.如權利要求1-22中任一項所述的抗原結合片段，其中所述抗原結合片段選自單鏈Fv(ScFv)抗體片段、Fab抗體片段、Fab』抗體片段和F(ab』)2抗體片段。
24.如權利要求1-22中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體是多價抗體。
25.如權利要求1-22中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體是多特異性抗體。
26.治療、減輕或預防免疫介導的病症的方法，所述方法包括以下步驟: 提供治療有效量的權利要求1-25中任一項所述的抗體或抗原結合片段；以及 將所述抗體或抗原結合片段施用至有需要的犬。
27.如權利要求26所述的方法，其中所述免疫介導的病症是慢性炎性疾病。
28.如權利要求27所述的方法，其中所述慢性炎性疾病選自免疫介導的多發性關節炎、風溼性關節炎、骨關節炎、強直性脊椎炎、克羅恩病、潰瘍性結腸炎、銀屑病和銀屑病性關節炎、系統性血管炎、異位性皮炎、充血性心力衰竭、難治性葡萄膜炎和支氣管哮喘。
29.如權利要求26所述的方法，其中所述免疫介導的病症是TNF-α相關的病症，其選自敗血症、敗血性休克、糖尿病、阿茲海默病、帕金森氏病、中風、缺血性心臟病和肌萎縮性脊髓側索硬化症。
30.如權利要求26-29中任一項所述的方法，進一步包括共同施用至少一種另外的治療劑的步驟。
31.如權利要求30所述的方法，其中所述至少一種另外的治療劑選自:氨甲喋呤、犬TNF融合蛋白、可溶的p55或p75TNF受體或其衍生物、針對犬TNF的嵌合抗體或犬抗體、抗犬TNF抗體片段、鎮痛劑、NSAID、阿片樣物質、皮質類固醇、類固醇和神經生長因子拮抗劑。
32.如權利要求30所述的方法，其中所述至少一種治療劑選自抗生素、抗真菌劑、抗原生動物劑和抗病毒治療劑。
33.如權利要求30所述的方法，其中所述至少一種治療劑選自:炎症介質的抑制劑、PGE受體拮抗劑、免疫抑制劑、環孢黴素、抗炎糖皮質激素、用於治療認知功能障礙或認知損傷的藥劑、抗高血壓藥劑、用於治療心血管功能障礙的化合物、利尿劑、血管擴張劑、β腎上腺素受體拮抗劑、血管緊張肽II轉化酶抑制劑、鈣通道阻滯劑和HMG-CoA還原酶抑制劑。
34.如權利要求26-33中任一項所述的方法，其中將所述抗體以約0.01mg/kg體重至約10mg/kg體重的劑量施用至所述犬。
35.用於治療、減輕或預防免疫介導的病症的藥物組合物，其包含治療有效量的權利要求1-25中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，以及至少一種藥學上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑。
36.如權利要求35所述的藥物組合物，其進一步包括選自以下的至少一種另外的治療劑:氨甲喋呤、犬TNF融合蛋白、可溶的p55或p75TNF受體或其衍生物、針對犬TNF的嵌合抗體或犬抗體、抗犬TNF抗體片段、鎮痛劑、NSAID、阿片樣物質、皮質類固醇、類固醇和神經生長因子拮抗劑。
37.分離的核酸，其編碼權利要求1-25中任一項所述的抗體或抗原結合片段。
38.分離的核酸，其編碼具有胺基酸序列SEQID NO:1的抗犬TNF犬源化抗體或抗體片段的輕鏈可變結構域或具有胺基酸序列SEQ ID NO:3的輕鏈。
39.分離的核酸，其編碼具有胺基酸序列SEQID NO: 2的抗犬TNF犬源化抗體或抗體片段的重鏈可變結構域或具有選自胺基酸序列SEQ ID NO:4,SEQ ID NO: 5,SEQ ID N0:6和SEQ ID NO:7 的重鏈。
40.如權利要求37-39中任一項所述的分離的核酸，其可操作地連接於一個或多個調控序列。
41.表達載體,其包含權利要求37-39中任一項所述的核酸。
42.如權利要求41所述的表達載體，其進一步包含一個或多個調控序列。
43.如權利要求41或42所述的表達載體，其中所述表達載體是質粒或逆轉錄病毒載體。
44.宿主細胞，其包括權利要求41-43中任一項所述的表達載體。
45.產生抗犬TNF中和抗體的方法，所述方法包括以下步驟:培養權利要求44所述的宿主細胞，以使所述細胞表達犬源化抗犬TNF中和抗體。
46.治療、減輕或抑制犬的免疫介導的病症的方法，所述方法包括將治療有效量的權利要求37-39中任一項所述的核酸施用至所述犬。
47.權利要求1-25中任一項所述的抗體或抗原結合片段、權利要求35或36所述的藥物組合物、權利要求37-39中任一項所述的核酸或者權利要求41-43中任一項所述的表達載體，用於治療或預防犬的慢性炎性疾病。
48.如權利要求47所述的抗體或抗原結合片段，其中所述慢性炎性疾病選自:風溼性關節炎、骨關節炎和其他多發性關節炎、免疫介導的多發性關節炎、強直性脊椎炎、克羅恩病和潰瘍性結腸炎、銀屑病和銀屑病性關節炎、系統性血管炎、異位性皮炎、充血性心力衰竭、難治性葡萄膜炎、支氣管哮喘和過敏性症狀。
49.權利要求1-25中任一項所述的抗體或抗原結合片段、權利要求35或36中任一項所述的藥物組合物、權利要求37-39中任一項所述的核酸或者權利要求41-43中任一項所述的表達載體，用於治療關節炎。
50.如權利要求49所述的抗體或抗原結合片段，其中所述關節炎選自骨關節炎、免疫介導的多發性關節炎或風溼性關節炎。
51.權利要求1-25中任一項所述的抗體或抗原結合片段、權利要求35或36所述的藥物組合物、權利要求37-39中任一項所述的核酸或者權利要求41-43中任一項所述的表達載體，在製備用於治療、減輕或預防犬的慢性炎性疾病的藥物中的用途。
52.如權利要求51所述的抗體或抗原結合片段的用途，其中所述慢性炎性疾病選自:風溼性關節炎、免疫介導的多發性關節炎、骨關節炎和其他多發性關節炎、強直性脊椎炎、克羅恩病和潰瘍性結腸炎、銀屑病、銀屑病性關節炎、系統性血管炎、異位性皮炎、充血性心力衰竭、難治性葡萄膜炎、支氣管哮喘和過敏性症狀。
53.權利要求1-25中任一項所述的抗體或抗原結合片段、權利要求35或36所述的藥物組合物、權利要求37-39中任一項所述的核酸或者權利要求41-43中任一項所述的表達載體，在製備用於治療、抑制、減輕或預防犬的關節炎的藥物中的用途。
54.如權利要求53所述的抗體或抗原結合片段的用途，其中所述關節炎選自:骨關節炎、免疫介導的多發性關節炎和風溼性關節炎。
55.細胞系或其衍生細胞或後代細胞，其產生權利要求1-25中任一項所述的抗犬TNF中和單克隆抗體或其片段。
56.用於治療犬的慢性炎性疾病的試劑盒，所述試劑盒包含權利要求1-25中任一項所述的抗犬TNF抗體及其使用說明。
【文檔編號】C07K16/24GK103958545SQ201280052125
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2012年8月29日 優先權日:2011年8月30日
【發明者】大衛·吉爾芮 申請人:Nvip私人有限公司