一種在同一體系中檢測IgM抗體和IgG抗體的方法

2023-06-01 16:22:56

專利名稱：一種在同一體系中檢測IgM抗體和IgG抗體的方法
技術領域：
本發明涉及體外檢測技術領域，具體地涉及一種在免疫檢測樣本時在同一反應體系中測定樣本中針對某種抗原的IgM抗體和IgG抗體的方法和相應的試劑盒。
背景技術：
在臨床實驗室診斷中，有很多是通過檢測機體產生的針對某種細菌或病毒IgM抗體和IgG抗體來確認其感染或曾經感染，比如弓形蟲，巨細胞病毒(CMV)等。目前檢測人體針對某種病原體的IgM抗體和IgG抗體，是通過兩個試劑盒來實現的，這樣在臨床使用過程中，試劑的消耗量，所需病人的樣本量及檢測工作量都較大。因此，本領域的這項在同一反應體系中測定樣本中IgM抗體和IgG抗體的方法，能大大降低目前的人力物力財力。

發明內容
本發明的目的就是提供一種能在同一反應體系中測定樣本中針對某種抗原的IgM 抗體和IgG抗體的方法，從而節省臨床檢測更為簡便的、更為省時，也更為經濟。在本發明的第一方面，提供了一種在同一體系中檢測IgM抗體和IgG抗體的方法， 包括以下步驟(a)將待測樣品與第一抗原溶液混合，其中所述的第一抗原溶液含有1-50種不同的抗原，所述的每一種抗原偶聯於不同的微球而形成式I所示的第一抗原-微球的二元複合物，Ag-bead (I)式中，Ag表示抗原，bead表示微球，-表示抗原與微球之間的共價鍵；從而使待測樣品中的抗體與所述抗原形成「抗體_抗原_微球」三元複合物，其中所述的「抗體_抗原_微球」三元複合物包括「 IgM抗體-抗原-微球」三元複合物」和「 IgG 抗體_抗原_微球」三元複合物；(b)將步驟(a)形成的溶液與第二抗體溶液混合，其中所述的第二抗體溶液含有 1-50種不同的帶有可檢測信號的第二抗體，所述的每一種第二抗體分別是針對該抗原的 IgM抗體的抗體，從而形成「第二抗體-IgM抗體-抗原-微球」的IgM抗體四元複合物；(c)檢測IgM抗體四元複合物中不同微球的可檢測信號，從而確定待檢測樣品中各IgM抗體的存在與否，附加條件是待測樣品與第一抗原溶液和第二抗體溶液的混合，可依次進行，也可同時進行；(d)將步驟(C)檢測後的形成的溶液與第三抗體溶液混合，其中所述的第三抗體溶液含有1-50種不同的帶有可檢測信號的第三抗體，所述的每一種第三抗體分別是針對該抗原的IgG抗體的抗體，從而形成「第三抗體-IgG抗體-抗原-微球」的IgG抗體四元複合物；
(e)檢測IgG抗體四元複合物中不同微球的可檢測信號，從而確定待檢測樣品中各IgG抗體的存在與否。在另一優選例中，所述的第二抗體帶有的可檢測信號和第三抗體帶有的可檢測信號是相同的或不同的。在另一優選例中，所述的可檢測信號是螢光信號。在另一優選例中，所述的微球是平均粒徑為2-10 μ m、且染上不同螢光的聚苯烯微球。在另一優選例中，所述的抗原包括病毒抗原、腫瘤抗原、細菌抗原、寄生蟲抗原等。在另一優選例中，所述的抗原包括弓形蟲抗原、風疹病毒抗原、巨細胞病毒抗原、 A肝病毒抗原、B肝病毒抗原、C肝病毒抗原、單純皰疹病毒抗原。在另一優選例中，所述的第一抗原溶液含有2-30種不同的抗原，更佳地含有3-20 種不同的抗原。在另一優選例中，在所述的第二抗體溶液和第三抗體溶液中，各第二抗體和第三抗體的濃度為0. l-200ug/ml。在另一優選例中，步驟(c)和(e)中用Luminex xMAP法進行檢測。在另一優選例中，在步驟(c)和(e)中包括將測定的可檢測信號與質控或標準曲線進行比較，從而確定待檢測樣品中抗體的存在與否，和/或數量。在另一優選例中，所述的第二抗體帶有的可檢測信號和第三抗體帶有的可檢測信號是相同的，並且在步驟(e)中包括步驟將步驟(e)中測得的可檢測信號的讀數減去步驟 (c)中測得的可檢測信號的讀數，作為判斷IgG抗體存在與否，和/或數量的依據。在本發明的第二方面，提供了一種用於在同一體系中檢測IgM抗體和IgG抗體的試劑盒，它包括以下組分(a』)第一容器以及裝於該容器中的第一抗原溶液，其中所述的第一抗原溶液含有 1-50種不同的抗原，所述的每一種抗原偶聯於不同的微球而形成式I所示的第一抗原_微球的二元複合物，Ag-bead (I)式中，Ag表示抗原，bead表示微球，-表示抗原與微球之間的共價鍵；(b』)第二容器以及裝於該容器中的第二抗體溶液，其中所述的第二抗體溶液含有 1-50種不同的帶有可檢測信號的第二抗體，所述的每一種第二抗體分別是針對該抗原的 IgM抗體的抗體，從而形成「第二抗體-IgM抗體-抗原-微球」的IgM抗體四元複合物；(c』)第三容器以及裝於該容器中的第三抗體溶液，其中所述的第三抗體溶液含有 1-50種不同的帶有可檢測信號的第三抗體，所述的每一種第三抗體分別是針對該抗原的 IgG抗體的抗體，從而形成「第三抗體-IgG抗體-抗原-微球」的IgG抗體四元複合物。在另一優選例中，所述的試劑盒還包括(d』 )用作質控的標準液、或質控液。應理解，在本發明範圍內中，本發明的上述各技術特徵和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特徵可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限於篇幅，在此不再
--累述。
具體實施例方式本發明人經過廣泛而深入的研究，首次在同一反應體系中通過兩種帶可檢測信號的抗體抗IgM抗體的抗體和抗IgG抗體的抗體，並且通過兩次採集可檢測信號，實現了在同一反應體系中測定樣本中針對某種抗原的IgM抗體和IgG抗體。本發明方法可以大大降低目前的人力物力財力，並且操作簡單，適應面廣。本發明方法也適用於同時針對多個抗原的IgM抗體和IgG抗體。如本文所用，術語「抗IgM抗體的抗體」，指可特異性結合於IgM抗體的一種抗體。如本文所用，術語「抗IgG抗體的抗體」，指可特異性結合於IgG抗體的一種抗體。如本文所用，術語「抗原」指具有免疫原性的物質，例如蛋白質、多肽。代表性的抗原例子包括(但並不限於)病毒抗原、腫瘤抗原、細菌抗原、寄生蟲抗原等。例如，弓形蟲抗原(如弓形蟲外殼蛋白)、風疹病毒抗原、巨細胞病毒抗原(巨細胞病毒的外殼蛋白)、A肝病毒抗原、B肝病毒抗原、C肝病毒抗原、單純皰疹病毒抗原。基本原理(a)免疫夾心法的原理免疫夾心法的原理是本領域技術人員所熟知的。在檢測針對某種抗原的IgM抗體和IgG抗體時，通常分為兩個試劑盒。檢測針對某種抗原的IgM抗體時，常規的做法是將抗原固定於固相載體，然後加入待測樣本，待測樣本中的IgM抗體會與固定於固相載體上的抗原結合，洗滌後再與標有酶的抗IgM抗體的抗體反應，洗滌，最後進行化學發光或酶聯顯色反應檢測信號。檢測針對某種抗原的IgG抗體時，常規的做法是將抗原固定於固相載體，然後加入待測樣本，待測樣本中的IgG抗體會與固定於固相載體上的抗原結合，洗滌後再與標有酶的抗IgG抗體的抗體反應，洗滌，最後進行化學發光或酶聯顯色反應檢測信號。(b) Luminex xMAP 法的原理Luminex xMAP是一個非常靈活的多功能技術平臺。其原理是把微小的乳膠顆粒 (Beads，簡稱為「微球」)分別染成不同的螢光色，然後再把針對不同檢測物的蛋白(如抗原抗體)以共價方式結合到特定顏色的微球上。應用時，先把針對不同檢測物的、用不同顏色編碼的微球混合，再加入被檢測物(被測物可以是血清中的抗原、抗體、或酶等)。在懸液中的微球與被檢測物特異性地結合，並加上螢光標記。然後，微球成單列通過兩束雷射，一束判定微球的顏色從而決定被測物的特異性(定性)；另一束測定微球上的螢光標記強度從而決定被測物的量(定量)，所得到的數據經電腦處理後可以直接用來判斷結果。在一個優選例中，充分利用了抗原固定在不同流動微球(Beads)的特點，同時優化藻紅蛋白(PE)標記的抗IgM抗體的抗體或抗IgG抗體的抗體的濃度，將交聯了抗原的微球溶液與血清樣本或標準質控品液、PE標記的抗IgM抗體的抗體抗IgG抗體的抗體溶液依次或同時一併加入反應容器中，從而發生以下反應①微球上的抗原與血清或標準質控品液中針對該抗原的IgM抗體和IgG抗體結合，形成「 IgM抗體-抗原-微球」複合物或「 IgG抗體-抗原-微球」複合物；②PE標記的抗IgM抗體的抗體或抗IgG抗體的抗體與血清或標準質控品液中相應的IgM抗體或IgG抗體結合，最終形成「PE標記的抗IgM抗體的抗體-IgM抗體-抗原-微球」複合物或「ΡΕ標記的抗IgG抗體的抗體-IgG抗體-抗原-微球」複合物。在液相中即可通過Luminex χΜΑΡ檢測複合物的螢光，進行定性或定量分析。在Lumin ex檢測儀上，這些微球被微量液體傳送系統排成單列，通過兩束雷射，一束判定微球的編碼從而決定被測IgM抗體或IgG抗體是針對何種抗原的；另一束測定微球上PE的螢光強度，經數據處理得出被測IgM抗體或IgG抗體的含量。關於Luminex χΜΑΡ的技術平臺詳細資料，請參見相關文獻(1) Journal ofImmunological Methods, 227 :41_52 ； (2)www. luminexcorp. com。(c)同一體系中檢測IgM抗體和IgG抗體方法的原理在本發明方法中，首先在1種螢光編碼的微球(稱為1號球)上以共價鍵方式交聯某種抗原；加入血清樣本或標準質控品液後，1號微球上的抗原與血清或標準質控品液中相應的IgM抗體和IgG抗體結合。這時，再加入PE標記的抗IgM抗體的抗體，此時1號微球上的抗原與IgM抗體結合部分形成「 1號螢光編碼微球_抗原_血清相應IgM抗體-PE標記的抗IgM抗體的抗體」 四元複合物。在Luminex檢測儀上，螢光編碼的微球被微量液體傳送系統排成單列，通過兩束雷射，一束判定微球的編碼從而決定被測IgM抗體是針對哪種抗原的；另一束測定微球上 PE的螢光強度，經數據處理得出被測IgM抗體的含量。隨後，再在反應體系中加入PE標記的抗IgG抗體的抗體，此時1號微球上的抗原與IgG抗體結合部分形成「 1號螢光編碼微球_抗原_血清相應IgG抗體-PE標記的抗IgG 抗體的抗體」四元複合物。在Luminex檢測儀上，螢光編碼的微球被微量液體傳送系統排成單列，通過兩束雷射，一束判定微球的編碼從而決定被測抗體是針對哪種抗原的；另一束測定微球上PE的螢光強度。該螢光強度減去前次測IgM抗體時的螢光強度，即為IgG抗體的螢光強度。經數據處理得出被測IgG抗體的含量。值得注意的是，以上給出的是第二抗體(抗IgM抗體)和第三抗體(抗IgG抗體) 帶有的相同的可檢測信號(即PE標記)的情況。顯然，當第二抗體(抗IgM抗體)和第三抗體(抗IgG抗體)帶有的不同的可檢測信號時，可以直接根據第三抗體的可檢測信號的讀數來判斷抗IgG抗體的存在與否和/或數量。以下，以檢測風疹病毒抗體為例，進一步說明本發明的相關操作細節。抗原-微球複合物在本發明中，抗原_微球複合物具有式(I)結構Ag-bead (I)式中，Ag表示抗原，bead表示微球，-表示第一抗體與微球之間的共價鍵；抗原與微球的偶連不同抗原與微球共價交聯的詳細操作程序可用常規方法，例如按照Luminex公司的產品說明書或網站=WWW. luminexcorp. com中所述的方法進行偶連，從而得到不同微球與相應抗原形成偶連物Ag-Bead。取一定量的Ag-Beads，稀釋至一定濃度就可得到抗原-微球懸液(簡稱為A液)。抗IgM抗體的抗體和抗IgG抗體的抗體的標記(二抗的標記)
雖然在這裡所用的抗IgM抗體的抗體和抗IgG抗體的抗體可用各種本領域已知的可檢測信號進行標記。然而，優選的是用螢光信號進行標記，尤其是通過生物素-親和素連接方式標記PE。在一優選例中，抗體的生物素(Biotin)標記方法如下取抗IgM抗體的抗體 (antilgM)透析純化後加入生物素二甲基亞碸(DMSO)溶液，避光反應，透析去除未反應的生物素，保存備用。抗IgG抗體的抗體(anti IgG)也用以上方法標記。然後取一定量的生物素標記的抗IgM抗體的抗體或抗IgG抗體的抗體，加入親和素(Str印tavidin)標記的PE，使生物素與Sti^ptavidin結合，生成帶螢光素標記的抗體 (即PE-antilgM或PE-antilgG，其中PE表示藻紅蛋白)，得到抗體溶液(簡稱為C液)。質控或標準為了消除假陽性和假陰性，宜在檢測過程中設置質控。比如在檢測風疹IgM抗體和風疹IgG抗體的試劑盒中，用風疹IgM抗體和風疹IgG抗體的標準品配製一定濃度範圍內的溶液。此外，為了獲得定量結果，可以在檢測過程中設置含已知濃度的多個風疹IgM抗體和風疹IgG抗體的標準品。例如，風疹IgM抗體和風疹IgG抗體標準(STDn，n = 0 5)和質控品(質控1、質控2)溶液的配製可按下表配製表1 風疹IgM抗體和風疹IgG抗體標準質控品溶液配製表
權利要求
1.一種在同一體系中檢測IgM抗體和IgG抗體的方法，其特徵在於，包括以下步驟(a)將待測樣品與第一抗原溶液混合，其中所述的第一抗原溶液含有1-50種不同的抗原，所述的每一種抗原偶聯於不同的微球而形成式I所示的第一抗原-微球的二元複合物，Ag-bead (I)式中，Ag表示抗原，bead表示微球，-表示抗原與微球之間的共價鍵；從而使待測樣品中的抗體與所述抗原形成「抗體-抗原-微球」三元複合物，其中所述的「抗體_抗原_微球」三元複合物包括「 IgM抗體-抗原-微球」三元複合物」和「 IgG抗體-抗原-微球」三元複合物；(b)將步驟(a)形成的溶液與第二抗體溶液混合，其中所述的第二抗體溶液含有1-50 種不同的帶有可檢測信號的第二抗體，所述的每一種第二抗體分別是針對該抗原的IgM抗體的抗體，從而形成「第二抗體-IgM抗體-抗原-微球」的IgM抗體四元複合物；(c)檢測IgM抗體四元複合物中不同微球的可檢測信號，從而確定待檢測樣品中各IgM 抗體的存在與否，附加條件是待測樣品與第一抗原溶液和第二抗體溶液的混合，可依次進行，也可同時進行；(d)將步驟(c)檢測後的形成的溶液與第三抗體溶液混合，其中所述的第三抗體溶液含有1-50種不同的帶有可檢測信號的第三抗體，所述的每一種第三抗體分別是針對該抗原的IgG抗體的抗體，從而形成「第三抗體-IgG抗體-抗原-微球」的IgG抗體四元複合物；(e)檢測IgG抗體四元複合物中不同微球的可檢測信號，從而確定待檢測樣品中各IgG 抗體的存在與否。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的第二抗體帶有的可檢測信號和第三抗體帶有的可檢測信號是相同的或不同的。
3.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的可檢測信號是螢光信號。
4.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的微球是平均粒徑為2-10μ m、且染上不同螢光的聚苯烯微球。
5.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的抗原包括病毒抗原、腫瘤抗原、細菌抗原、寄生蟲抗原等。
6.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，在所述的第二抗體溶液和第三抗體溶液中， 各第二抗體和第三抗體的濃度為0. l-200ug/mL·
7.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟(c)和(e)中用LuminexxMAP法進行檢測。
8.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，在步驟(c)和(e)中包括將測定的可檢測信號與質控或標準曲線進行比較，從而確定待檢測樣品中抗體的存在與否，和/或數量。
9.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的第二抗體帶有的可檢測信號和第三抗體帶有的可檢測信號是相同的，並且在步驟(e)中包括步驟將步驟(e)中測得的可檢測信號的讀數減去步驟(c)中測得的可檢測信號的讀數，作為判斷IgG抗體存在與否，和/或數量的依據。
10.一種用於在同一體系中檢測IgM抗體和IgG抗體的試劑盒，其特徵在於，它包括以下組分(a』 )第一容器以及裝於該容 器中的第一抗原溶液，其中所述的第一抗原溶液含有 1-50種不同的抗原，所述的每一種抗原偶聯於不同的微球而形成式I所示的第一抗原_微球的二元複合物， Ag-bead (I)式中，Ag表示抗原，bead表示微球，-表示抗原與微球之間的共價鍵； (b』 )第二容器以及裝於該容器中的第二抗體溶液，其中所述的第二抗體溶液含有 1-50種不同的帶有可檢測信號的第二抗體，所述的每一種第二抗體分別是針對該抗原的 IgM抗體的抗體，從而形成「第二抗體-IgM抗體-抗原-微球」的IgM抗體四元複合物；(C』 )第三容器以及裝於該容器中的第三抗體溶液，其中所述的第三抗體溶液含有 1-50種不同的帶有可檢測信號的第三抗體，所述的每一種第三抗體分別是針對該抗原的 IgG抗體的抗體，從而形成「第三抗體-IgG抗體-抗原-微球」的IgG抗體四元複合物。
全文摘要
本發明公開了一種在同一體系中檢測IgM抗體和IgG抗體的方法。具體地，本發明方法包括步驟(a)將待測樣品與第一抗原溶液混合，形成「抗體-抗原-微球」三元複合物；(b)將步驟(a)形成的溶液與第二抗體溶液混合，形成「第二抗體-IgM抗體-抗原-微球」的IgM抗體四元複合物；(c)檢測並確定待檢測樣品中各IgM抗體的存在與否；(d)將步驟(c)檢測後的形成的溶液與第三抗體溶液混合，形成「第三抗體-IgG抗體-抗原-微球」的IgG抗體四元複合物；(e)檢測並確定待檢測樣品中各IgG抗體的存在與否。本發明方法可簡便、快速、準確地同時定性和定量檢測同一樣品中針對某抗原的IgM抗體和IgG抗體。
文檔編號G01N33/53GK102375052SQ20101025483
公開日2012年3月14日 申請日期2010年8月17日 優先權日2010年8月17日
發明者喬健, 朱冬青, 梁敏銳, 鄒和建, 陳向軍, 顧悅華 申請人:復旦大學附屬華山醫院