一種含cmp激酶和cdp激酶的啤酒酵母菌的篩選及應用的製作方法

2023-07-03 03:06:06

專利名稱：：一種含cmp激酶和cdp激酶的啤酒酵母菌的篩選及應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種含高活力CMP激酶和CDP激酶的啤酒酵母菌的篩選以及該啤酒酵母菌在生產胞苷三磷酸中的應用，屬於生物工程
技術領域：
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背景技術：
：胞苷三磷酸(簡稱CTP)是機體細胞內的一種正常成分，它在體內參與核酸和磷脂類的合成代謝，促進蛋白質的合成，並提供能量，還可以調節和促進神經細胞、神經膠質細胞及血管壁細胞膜性結構的合成與構建，能夠對抗由興奮性胺基酸、自由基引起的神經細胞損傷，從而起到抗血管硬化的作用。而胞苷一磷酸激酶(CMPkinase)和胞苷二磷酸激酶(CDPkinase)的主要作用是負責激活胞苷三磷酸合成酶(CTPsynthetase),激活胞苷三磷酸合成酶能降低胞苷一磷酸(簡稱CMP)水平，使CMP合成CTP。目前已有廠家生產CTP注射液製劑，臨床上主要用於治療多種原因引起的神經系統及心血管類疾病，如腦血管意外及其後遺症；腦震蕩、外傷性昏迷、顱腦手術後功能障礙；神經官能症；腦血管硬化、老年性痴呆；外周神經損傷；兒童腦發育不全等。(IshigeKazuya，2002)枯草芽孢桿菌jofC編碼CMP激酶，啤酒酵母中URA6編碼CMP激酶(ShinyaKaneko，1998)。大腸桿菌中mssA基因編碼CMP激酶已被Fricke等人證實，雖然CMP激酶不是大腸桿菌所必需，但CMP激酶在ATP提供磷醯基情況下，可逆催化CMP轉化CDP,進而生成CTP:ATPMg2++CMP—ADPMg2++CDPATP-Mg2++CDP—ADPMg2++CTPCTP的合成工藝方法主要包括化學法、生物合成法、光合磷酸法等。由於底物價格的原因，國內外對CTP工業化生產的研究甚少，在我國真正生產CTP的企業基本上沒有，但自發現可作為藥物以後，市場需求逐年增大，隨著CMP價格的逐年下降，生產前景十分看好。CTP在上世紀80年代國內的生產方法主要都是通過分離出酵母體內的自身酶系對CMP進行轉化，生產工藝比較成熟，但該工藝不能完全分離出糖酵解系統中的所有酶，酶失活率高，轉化率低，(EthanSSimon，1990)。應國清等人(2004)利用游離的啤酒酵母將CMP合成為CTP，CTP的轉化率可維持在80。/。左右，詹谷字等人(1997)用菠菜葉綠體通過光合磷酸化反應將CMP合成為CTP,轉化率為85%。
發明內容本發明的目的是公開一種含高活力CMP激酶和CDP激酶的啤酒酵母菌。本發明的另一個目的是提供篩選該啤酒酵母菌的方法。本發明的再一個目的是公開該啤酒酵母菌在生產胞苷三磷酸中的應用。本發明通過以下技術方案達到以上目的一種含有CMP激酶和CDP激酶的啤酒酵母菌(^cc力"湖/cescei"en、/ae)菌才朱，菌落為乳白色，有光澤，平坦，邊緣整齊，其在2008年4月IO日保藏於中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏號是CGMCCNO.2448。所述菌^^朱的篩選方法的步驟包括(1)製作酵母菌懸液，將酵母經培養基活化後放入搖床振蕩培養到細胞處於對數生長期後離心回收菌體，加入磷酸鹽緩衝液製成菌懸液；(2)將上述菌懸液與誘變劑按l:l容量比混合，3(TC恆溫水浴10-50分鐘後，混合液稀釋至10—3倍-10—6後塗布平板，得到抗性菌抹；(3)將上述抗性菌抹經搖床培養24-36小時，用高效液相色譜法檢測並篩選出含高活力CMP激酶和CDP激酶的啤酒酵母菌抹；其中，搖床的溫度為26-36°C，轉速為160-300rpm，所述步驟(2)中的誘變劑是2mg/ml的亞硝基胍；所述平板中的培養基含有300]ug/ml胞苷三磷酸結構類似物胞苷二磷酸-乙醇胺，所述抗性菌株為胞普二磷酸-乙醇胺抗性突變抹，。本發明的啤酒酵母菌菌抹在生產胞苷三磷酸中的應用包括利用包埋法以卡拉膠-魔芋多糖復配膠為載體將所述菌種製成固定化細胞後加入合成胞苦三磷酸的反應體系中，再利用離子交換分離純化的方法分離純化反應液，最後結晶得到胞苷三磷酸。其具體步驟是(1)將卡拉膠鈉鹽和魔芋粉溶於去離子水中，蒸汽加熱到121°C後保溫4070分鐘，倒入反應釜中自然冷卻到40°C,膠液保溫，其中k-卡拉膠鈉鹽與魔芋粉的重量比為2:1;(2)將生理鹽水加入洗滌好的啤酒酵母溼菌體中攪拌均勻製成酵母懸液，35。C保溫，其中生理鹽水和啤酒酵母溼菌體的重量比為1:4;(3)將步驟(2)中的酵母懸液倒入步驟(1)的膠液中，於40°C下攪拌20~40分鐘，使之混勻得到混合物；(4)在帶攪拌的反應釜中加入溶劑預熱至4(TC，將步驟(3)得到的混合物倒入反應蚤，攪拌2G~40分鐘待混合物形成顆粒，過濾，其中攪拌速度為50-150rpm;(5)將步驟(4)中過濾後的顆粒在氯化鉀溶液中浸泡30~90分鐘，過濾，再用戊二醛浸泡30~90分鐘，用篩網瀝盡顆粒表面水分後，裝袋至冰箱冷藏。其中步驟(4)中採用的溶劑為豆油，所述固定化細胞為球狀。所述離子交換分離純化的方法分離純化反應液的步驟中釆用HZ-1離子交換樹脂進行離子交換色譜，並用1.Omol/L氯化鈉溶液每小時以0.2-0.5柱體積進行梯度洗脫，得到胞苷三磷酸洗脫液。所述結晶的步驟中將洗脫液在50-7(TC水浴下減壓濃縮，加入3倍體積的95%乙醇，於冰箱靜置過夜後抽濾，將濾餅乾燥得到胞苷三磷酸。本發明採用包埋法以卡拉膠為載體自動生成球形顆粒固定化細胞，可以方便的製備各種粒徑的球形顆粒，與手工切割相比，細胞滲漏少，顆粒規則，強度高，勞動強度小，造粒程序簡單，無須複雜的設備和儀器。其優點在於所使用的溶劑為豆油，安全無毒，獲取方便，適合各種要求，並且易於回收；該工藝穩定，操作簡便，產品後處理簡單，易於工業化生產。應用本發明球形固定化酵母顆粒催化反應合成CTP，維持時間長，並可以方便固液快速分離，降低所生成的CTP進一步降解；球形顆粒可以反覆使用十批以上且不降低CTP轉化率，其反應液清亮，無須進一步複雜的顆粒回收操作，反應批次明顯高於游離酵母和手工切割顆粒；反應液經離子交換分離，所得CTP濃溶液純度達到94%以上，柱上收率均在80%以上；而游離酵母反應液所得的CTP離子交換液純度差，收率低；結晶後，由於CTP濃溶液純度高，所得晶體結晶容易，晶體純度達到97%以上，晶體含量達到94%以上，明顯高於游離酵母和手工切割的顆粒反應，CTP轉化率可達到97%。以下結合附圖對本發明作進一步的說明。圖1為本發明啤酒酵母菌抹。圖2為本發明製備的球形固定化顆粒的重複反應示意圖，圖中-令_表示球形顆粒；-〇-表示游離酵母；-a-表示手工切割。圖3為CTP標準品的HPLC圖譜。圖4為CTP樣品的HPLC圖譜。具體實施方式材料和儀器市售的啤酒酵母、搖瓶培養基、斜面培養基、亞硝基胍(簡稱NTG)溶液、底物溶液、搖床、20L帶攪拌反應釜、100L帶攪拌反應釜、高效液相色譜儀。搖瓶培養基的配製40g葡萄糖、15g硫酸銨、9g磷酸二氫鉀、3g磷酸氫二鉀、3g七水硫酸鎂、0.03g七水硫酸亞鐵、3g酵母膏、3g玉米漿,溶於1000ml蒸餾水中，pH4.0-6.5,115。C滅菌20min。斜面培養基的配製40g葡萄糖、15g硫酸銨、9g磷酸二氫鉀、3g磷酸氫二鉀、3g七水硫S吏鎂、0.03g七水硫酸亞鐵、3g酵母膏、3g玉米漿、20瓊脂，溶於1000ml蒸餾水中，pH4.0-6.5。實施例一(1)將待篩選的市售啤酒酵母經斜面培養基活化後轉入搖床培養，搖床溫度30°C，轉速200rpm培養2化後，再取lml培養液轉接於搖瓶培養基中，搖床培養至對數生長期，離心回收菌體，加入5ml、pH7.0的磷酸鹽緩沖液，製成菌懸液。(2)稱取20mg的NTG,用丙酮溶解後，加入蒸餾水定容至10ml，即為2mg/ml的NTG溶液，將lml菌懸液和lml亞硝基胍(NTG)溶液混合，振蕩混勻後，在30。C恆溫水浴鍋水浴30min，然後將混合液稀釋至10_3終止誘變。誘變終止後再將終止液稀釋成l(T5、l(T後塗布加有胞苷三磷酸結構類似物胞苷二磷酸-乙醇胺(3GGng/ml)平板，篩選出胞苷二磷酸-乙醇胺抗性突變株。(3)將篩選出的抗性突變株接入斜面培養基中，3(TC培養24h做為斜面活化種子。將斜面活化種子接入搖瓶，3(TC，200rpm搖床培養至對數生長期，離心回收菌體，並將該菌抹轉接斜面培養基，3(TC培養24小時後至4。C冰箱保存。在25g酵母量中加入20ml底物溶液，其中包括CMP60mmol/L、葡萄糖150mmol/L、磷酸鹽緩衝液(鈉鹽)250mmol/L、氯化4美8mmol/L、pH為6.0，溫度35。C，通過添加O.15ml吐溫80，ATP濃度為3mmol/L，反應時間20h，在此反應體系下，篩選出含高活力CMP激酶、CDP激酶的啤酒酵母菌菌株，見圖l，並用高效液相色譜法檢測。其中，高效液相色譜法的色譜條件為色譜柱漢邦LichrospherO(250mmx4.6mmi.d.，5jum);流動相曱醇6%。(體積分數)，磷酸水溶液(用三乙胺調節pH值至6.6)(體積比為11:89);流速l.OmL/min;4企測波長271nm;柱溫為室溫；進樣體積20)iL。實施例二(1)稱取200gK-卡拉膠鈉鹽，100g精製魔芋粉，溶於5L去離子水中，通蒸汽加熱至12rC,保溫60min後，倒入20L帶攪拌的反應釜中，自然冷即到40°C，膠液保溫備用。(2)稱取洗滌好的啤酒酵母溼菌體4kg並加入lkg生理鹽水，攪拌均勻，35"C保溫備用。(3)將保溫好的酵母懸液傾入膠液中，於40。C攪拌半小時使混合均勻後備用。(4)在100L帶攪拌的反應釜中加入60L大豆油，預熱至4(TC,控制攪拌速度125rpm，將酵母與膠液的混合物倒入大豆油中，攪拌半小時待顆粒成形，過濾，豆油回收後靜置，棄去下層水份後可重複使用。(5)將步驟(4)中過濾後的顆粒用3%的氯化鉀溶液浸泡一小時，過濾，再用1%的戊二醛浸泡一小時，用篩網瀝盡顆粒表面的水份，裝袋置冰箱冷藏備用。本實施例可以根據需要控制攪拌轉速製備各種粒徑的球形顆粒，攪拌轉速與球形顆粒直徑關係見表1表ltableseeoriginaldocumentpage11tableseeoriginaldocumentpage12其中，*表示要求的直徑顆粒重量比上總顆粒重量不小於90%，由表1可知，該方法可以方^f更的製備顆並立直徑l-5mm的J泉形顆粒，無需複雜的設備及操作條件。本發明造粒方法與手工切割方法形成顆粒的比較見表2表2tableseeoriginaldocumentpage12*表示顆粒與生理鹽水的比例為1:1。由表2可知本發明造粒方法製得的顆粒球形均勻，強度高，細胞滲透少。實施例三固定化酵母合成CTP的反應體系中，除生成大量的CTP外，還存在未反應的CMP及副產物CDP、磷酸鹽等雜質，為將CTP從反應液中分離，採用HZ-1離子交換樹脂進行離子交換色譜，並先用0.4mol/L氯化鈉，再用1.0mol/L氯化鈉溶液每小時以0.2-0.5柱體積進行梯度洗脫。將洗脫液在506(TC水浴下減壓濃縮，加入3倍體積的95%乙醇，於水箱靜置過夜，抽濾，濾餅乾燥，成品用高效液相色譜法檢測，色譜條件與實施例一相同。固定化酵母對CTP的連續反應情況見圖2，由圖可知應用固定化球形顆粒可以連續反應十批以上，反應液清亮，無明顯的細月包脫漏現象；而應用同樣方法手工切割的無定形小方塊，雖然可以連續反應，但第4次以後，反應轉化率明顯降低，且反應液中酵母滲漏嚴重，溶液混濁；游離酵母只能反應一次，第二次以後反應轉化率顯著降低。本實施例中得到CTP的檢測結果見圖3、圖4。離子交換法和結晶方法為實驗室常規方法，此處不再贅述。CTP收率見表3。結晶數據見表4表3tableseeoriginaldocumentpage13其中，*表示游離細胞反應，**表示手工切割顆粒催化反應;表4tableseeoriginaldocumentpage13tableseeoriginaldocumentpage14其中，*表示游離細胞反應，**表示手工切割顆粒催化反應;結果與討論由表3可知，應用球形顆粒催化的反應，CMP和CDP雜質含量少，離子交換收率高，且洗脫液純度很高；而採用游離細胞或手工切割顆粒催化的反應，收率低，且洗脫液純度只有85%左右。由表4可知，應用球形顆粒催化的反應，結晶收率可在90%以上，且晶體的純度高達94%以上，完全符合國家的要求；而採用游離細胞的反應，晶體收率低，結晶過程困難，有較多的油狀物出現；手工切割顆粒催化的反應，雖然結晶不困難，但是因洗脫液中純度本來就不高，造成晶體的純度低下，需要反覆結晶才能達到90%以上。除上述實施例外，本發明還可以有其他實施方式。凡採用等同替換或等效變換形成的技術方案，均落在本發明要求的保護範圍。權利要求1.一種含有CMP激酶和CDP激酶的啤酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae)菌株，其在中國普通微生物菌種保藏管理中心的保藏號是CGMCCNO.2448。2.才艮據權利要求1所述菌株的篩選方法，其特徵是所述方法的步驟包括(l)製作酵母菌懸液，將酵母經培養基活化後放入搖床振蕩培養到細胞處於對數生長期後離心回收菌體，加入磷酸鹽緩衝液製成菌懸液；(2)將上述菌懸液與誘變劑按1:1容量比混合，3(rC恆溫水浴10-50分鐘後，混合液稀釋至10—3倍~l(T後塗布平板，得到抗性菌抹；(3)將上述抗性菌株經搖床培養24-36小時，用高效液相色譜法檢測並篩選出含高活力CMP激酶和CDP激酶的啤酒酵母菌抹。3.根據權利要求2所述菌林的篩選方法，其特徵在於搖床的溫度為26~36°C，轉速為160-300rpm;所述步驟(2)中的誘變劑是2mg/ml的亞硝基胍；所述平板中的培養基含有300jug/ml胞苷三磷酸結構類似物胞苷二磷酸-乙醇胺，所述抗性菌林為胞苷二磷酸-乙醇胺抗性突變抹。4.根據權利要求1所述的菌林在生產胞苷三磷酸中的應用，其特徵在於首先利用包埋法以卡拉膠-魔芋多糖復配膠為載體將所述菌種製成固定化細胞後加入合成胞苷三磷酸的反應體系中，再利用離子交換分離純化的方法分離純化反應液，結晶得到胞苷三磷酸。5.根據權利要求4所述的菌株在生產胞苷三磷酸中的應用，其特徵在於所述包埋法以卡拉膠-魔芋多糖復配膠為載體將所述菌種製成固定化細胞的具體步驟是(i)將卡拉膠鈉鹽和魔芋粉溶於去離子水中，蒸汽加熱到i2rc後保溫40~70分鐘，倒入反應蒼中自然冷卻到40°C，膠液保溫，其中k-卡拉膠鈉鹽與魔芋粉的重量比為2:1;(2)另將生理鹽水加入洗滌好的哞酒酵母溼菌體中攪拌均勻製成酵母懸液，35。C保溫，其中生理鹽水和啤酒酵母溼菌體的重量比為1:4;(3)將步驟(2)中的酵母懸液倒入步驟(1)的膠液中，於40°C下攪拌20~40分鐘，使之混勻得到混合物；(4)在帶攪拌的反應釜中加入溶劑預熱至4(TC,將步驟(3)得到的混合物倒入反應釜，攪拌20-40分鐘待混合物形成顆粒，過濾，其中攪拌速度為50-150rpm;(5)將步驟(4)中過濾後的顆粒在氯化鉀溶液中浸泡30~90分鐘，過濾，再用戊二醛浸泡30-90分鐘，用篩網瀝盡顆粒表面水分後，裝袋至水箱冷藏。6.根據權利要求5所述的菌抹在生產胞苷三磷酸中的應用，其特徵在於所述步驟(4)中採用的溶劑為豆油，所述固定化細胞為球狀。7.根據權利要求4所述的菌株在生產胞苷三磷酸中的應用，其特徵在於所述離子交換分離純化的方法分離純化反應液的步驟中採用HZ-1離子交換樹脂進行離子交換色譜，並用0.4~1.0mol/L氯化鈉溶液每小時以G.2-0.5柱體積進行梯度洗脫，得到胞苷三磷酸洗脫液。8.根據權利要求7所述的菌抹在生產胞苷三磷酸中的應用，其特徵在於所述結晶的步驟中將洗脫液在50-7(TC水浴下減壓濃縮，加入3倍體積的95%乙醇，於水箱靜置過夜後抽濾，將濾餅乾燥得到胞苷三磷酸.全文摘要本發明涉及一種含高活力CMP激酶和CDP激酶的啤酒酵母菌的篩選以及該啤酒酵母菌在生產胞苷三磷酸中的應用，屬於生物工程
技術領域：
。本發明啤酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae)菌株，其在中國普通微生物菌種保藏管理中心的保藏號是CGMCCNO.2448。是利用亞硝基胍(NTG)誘變手段篩選出含高活力CMP激酶，CDP激酶的啤酒酵母菌菌株；在生產胞苷三磷酸的應用中，通過包埋法控制不同攪拌速度，製備各種粒徑的以卡拉膠為載體的固定化細胞，與手工切割相比，細胞滲漏少，顆粒規則，強度高，勞動強度小，造粒程序簡單，無須複雜的設備和儀器，所使用的豆油為安全無毒的溶劑，適合各種要求，易於回收，適合工業化生產。文檔編號C12Q1/04GK101265453SQ20081002390公開日2008年9月17日申請日期2008年4月18日優先權日2008年4月18日發明者周長林,羅眾球,邱蔚然,閆蓬勃申請人:中國藥科大學;南通秋之友生物科技有限公司