在受治療組織中展現高停留時間的氧化的抗生物素蛋白的製作方法

2023-07-03 17:34:51 3

專利名稱：：在受治療組織中展現高停留時間的氧化的抗生物素蛋白的製作方法
技術領域：
：本發明涉及可在活體內與組織交互作用的經化學氧化的抗生物素蛋白，其是透過可逆的共價化學鍵以延遲其擴散的方式作用。這類氧化的抗生物素蛋白是在外科手術步驟或經由注射投與至需要治療的選定的器官或組織。藉由10mM過碘酸鈉進行的抗生物素蛋白的氧化作用最近有報導(US20020137125)。後者中，作者將氧化的抗生物素蛋白與磷酸五甘露糖_肼偶合，以取得高度磷酸化的亞胺衍生物，然後可將其給予患者，以修改溶酶體酶，如此可加強溶酶體病的酶替代療法的效力。值得注意的是，亞胺形成作用並未在活體內發生。也需注意，該申請案中並未報導這類經改質的抗生物素蛋白的活性。尤其是，本發明是關於經由將糖蛋白的糖部分氧化來取得氧化的抗生物素蛋白，與野生型抗生物素蛋白(WTavidin)相比較，其顯示出在組織中有更高的持久性，同時也將在使用先前報導的經改質的抗生物素蛋白時所面臨的副作用減至最低。氧化的抗生物素蛋白的組織結合作用為高度同質性且不像在IART中般依賴帶正電的抗生物素蛋白在腫瘤及發炎組織中定位的能力。因此，氧化的抗生物素蛋白的作用並不局限於與腫瘤細胞的特殊交互作用，如此，可將圍繞在經手術移除的腫瘤周圍的組織(已知其含有以野生型抗生物素蛋白靶向時不易接近的多餘的腫瘤細胞)抗生物素蛋白化。本發明的第一種優選實施方式是關於藉由吡喃糖苷糖的氧化開環來化學改質的野生型抗生物素蛋白，如此可產生可與存在於所關注的組織中的氨基殘基交互作用的醛部分。由於存在質子化NH3+形式，CHO基團在酸性pH(低於6.0)下對蛋白質NH2大體上為惰性。然而，在pH^7下，CH0基團與蛋白質NH2殘基反應以形成希夫氏鹼。圖表l中呈現野生型抗生物素蛋白的代表性甘露糖殘基的化學氧化作用以及接下去新形成的CHO基團與氨基團(R-N^，其中R為組織蛋白質殘基)的反應的實例。圖表1formulaseeoriginaldocumentpage6此糖氧化作用是根據為人熟知的基於天然抗生物素蛋白與過碘酸鈉的反應的方法來獲得(Zaborsky，0.R.，etal.，Biochem.Bioph.Res.Comm.，1974，61，1，210;Green，N.M.，Biochem.J.，1963，89，599)。然而，已知抗生物素蛋白的氧化作用會對某些蛋白質氨基-酸性殘基造成損害(即，涉及生物素結合部位的色胺酸的氧化)，使得對生物素及/或生物素衍生物的親和力較低(US20040191832;Green，N.M.，Biochem.J.，1963，89，599)。現已發現抗生物素蛋白在氧化步驟前結合至低親和性配體4-羥基偶氮苯-2'-甲酸(HABA)時可提供前者防止色胺酸殘基氧化的構型，此點可由這類衍生物的UV光譜揭露出。UV光譜中，282nm及291nm處的獨特曲折減低是與色胺酸氧化程度嚴格相關；同時，250-260nm區中吸收的增加為形成經取代的羥吲哚的特徵。與野生型抗生物素蛋白(WTavidin)的吸收光譜相比較，氧化的抗生物素蛋白(OXavidin)及HABA-飽和的氧化的抗生物素蛋白(0XavidinHABA)的吸收光譜指出在氧化期間使用HABA來保護生物素結合部位可大為降低色胺酸的損害率(圖1)。本發明的一種優選實施方式為氧化的抗生物素蛋白，其UV光譜中在282nm及291nm處的吸收與所觀察到的WTavidin的吸收相比較並未呈現色胺酸殘基氧化的彎曲特徵。本發明的另一優選實施方式為氧化的抗生物素蛋白，其UV光譜中該250nm至260nm處的吸收與所觀察到的WTavidin的吸收相比較並未出現任何增加。本發明的又一優選實施方式是在配體HABA(由於氧化表現出色氨酸殘基)的存在下氧化抗生物素蛋白和/或抗生物素蛋白衍生物的方法。與HABA的保護作用完全一致，0XaVidinmBA顯示出與WTavidin非常類似的構造及熱動力學性質。熱穩定性及構形改變是在氧化前及氧化後，有或無4當量的生物素的情況下藉由圓二色譜測定。經由追蹤在25-95°C的溫度範圍內，225nm處的二色性信號減少來記錄熔解曲線。借0rigin7.0軟體，Boltzman配合模型來計算S型曲線的拐點和斜率(P)，其代表通過變性條件的轉變點。對各特定化合物而言，熱穩定性相當於在25_95°C的溫度範圍內，該配合對應曲線中的拐點的溫度。由於確定了OXavidin的熔解溫度(Tm)及S型曲線的斜率(p)與WTavidin相比較較低(分別為74.3t:對79.(TC及8.9對14.7)，數據(表1)指出氧化作用將降低熱穩定性。令人驚訝地，當氧化作用是在經HABA保護的抗生物素蛋白上進行時幾乎可以忽略該不穩定化作用(由0XavidinHABA及抗生物素蛋白的Tm及p值確認，分別為78.rC對79.(TC及11.2對14.7)。表1Tm(。C)P*抗生物素蛋白79.0±0.114.7±0.3抗生物素蛋白+4當量生物素>95n.a.OXavidin74.3±0.18.9±0.10Xavidin+4當量生物素86.3±0.220.7±1.1OXavidin,78.1±0.311.2±0.40Xavidin咖A+4當量生物素>95n.a.AS型曲線的斜率；n.a.=不適用雖然在加熱時未加入生物素時熱變性對OXavidinHABA及OXavidin二者均為不可逆，但當在生物素的存在下加熱/冷卻時僅OXaVidinmBA可回復其二極構造，類似於WTavidin(其數據未顯示)。這些發現可確認HABA飽和作用為抗生物素蛋白進行化學氧化時用來保存其構形的一種非常有效的方式，並且解釋了因此保留的生物素結合能力。本發明的另一優選實施方式為呈現高於或等於78t:的熱穩定性的氧化的抗生物素蛋白。本發明的一種更佳實施方式為呈現高於或等於78t:的熱穩定性且S型曲線的斜率大於10的氧化的抗生物素蛋白。先前的發現也藉由氧化的抗生物素蛋白(0XaVidinHABA)對生物素化的加合物ST2210的結合力(如表2中所示，其類似於WTavidin)得到證實。表27tableseeoriginaldocumentpage8n=獨立實驗的數目；SD=標準偏差；NT=未測試@藉由HABA分析與游離生物素相比較時，以生物素D0TA(ST2210)取得的實驗值97.4±0.5是被假定為100%來作為改質的抗生物素蛋白的參考值；*p<0.05對lOmM;#p<0.01對lOmM(單向Anova，再接續Student-Newman-Keuls);**p<0.001對相同物但無廳A(雙向A麗a，再接續Bonferroni)根據最優化的方法所取得的氧化的抗生物素蛋白(OXavidin皿)與無HABA保護作用時所製得的氧化的抗生物素蛋白相比較，其在結合ST2210方面顯示出改良的性質，但在受治療的組織(經肌肉內注射後的小鼠肌肉肢體)中仍維持高持久性。確實，若在氧化作用前加入HABA，則當以lOmMNaI04將抗生物素蛋白氧化後，其在結合ST2210方面的能力增加(86.3X，相對於無HABA存在時，對應的氧化的抗生物素蛋白僅為50.9%)。當氧化作用是在較高濃度(20mM)的過碘酸鈉的存在下發生時可取得類似的結果(81.4%對49.1%)。本發明的另一優選實施方式為一種氧化的抗生物素蛋白，相關於WTavidin與ST2210結合的程度為97.4%，其呈現出與ST2210的結合程度是高於或等於75%。再者，不管這類氧化作用是否是在HABA的存在下發生，在小鼠後肢中的氧化的抗生物素蛋白的組織持久性較WTavidin高出很多。此行為與抗生物素蛋白的糖基化側鏈內存有CHO基團絕對相關。在本發明的一更佳實施方式中，以10和20mMNaI04氧化後可產生每一抗生物素蛋白約帶有8至15個CHO殘基(此是借Purpald氏方法估計)。再於本發明的一更佳實施方式中，"經HABA保護"的氧化的抗生物素蛋白衍生物(0XavidinmBA)在注射後24小時及一周時仍維持高ST2210結合能力並展現出組織持久性，這與CHO基團數目相關。藉由等溫滴定量熱法(ITC)測得的這類抗生物素蛋白/生物素交互作用的物化特性揭露出ST2210能夠以可相比擬的方式與WTavidin和OXavidinHABA結合，此可由結合常數(KA)及熱函變化(AH)證實(分別為3.45對2.50X106M—1及-1.48對-1.71X104千卡摩爾—0。相反地，ST2210/0Xavidin交互作用顯示出較低的KA(6.45X105M—0及較高的AH(-0.79X104千卡摩爾—0。根據ST2210結合氧化的抗生物素蛋白的數據，在實驗誤差內，該測得的交互作用的化學計量為每分子WTaVidin、OXavidinHABA及OXavidin分別結合3.0、1.7及1.2個分子的ST2210。表3tableseeoriginaldocumentpage9根據本發明的氧化的抗生物素蛋白大體上維持野生型抗生物素蛋白的生物素結合能力，但取得以可逆方式與組織蛋白質交互作用的性質，如此可產生用於近距離放射治療中(如用於IAIO^中)的理想的候選作用劑。於本發明的一種優選實施方式中，氧化的抗生物素蛋白是在手術間階段投與以產生用於接下去的抗癌劑的"人工受體"。本發明的一更佳實施方式是提供作為第一種近距離放射治療劑的以化學方式氧化的抗生物素蛋白(其在受治療的組織中具有高持久性)與對所述第一種氧化的抗生物素蛋白具親和性的第二種作用劑。本發明的一甚至更佳的實施方式是提供作為第一種近距離放射治療劑的以化學方式氧化的抗生物素蛋白(其在受治療的組織中具有高持久性)與對所述第一種氧化的抗生物素蛋白具親和性的第二種抗癌劑。本發明的另一優選實施方式為一種藥學組合物，其含有該經化學改質的抗生物素蛋白作為第一種成分及生物素化的治療劑作為第二種活性成分。於本發明的一優選體現中，上述藥學組合物的第二種活性成分為生物素化的抗癌劑。抗癌劑意指可對抗腫瘤的試劑。抗癌劑的非詳盡列表中包含化療藥物、經放射標示的化合物、效應細胞、毒素、細胞因子及抗癌細胞。於本發明的另一優選體現中，該療法採用放射治療的形式。本發明的另一優選實施方式包含用於乳房、肌肉、肝臟、胰臟、膀胱、腦、肺、前列腺、卵巢、眼及其他器官的近距離放射治療的試劑盒的製備方法。於該試劑盒的優選體現中，所述二種成分是在二個分開的容器中。於一更佳的實施方式中，該經化學改質的抗生物素蛋白的容器中包含適量的產物，此產物是在可相容的酸性溶液中配製或與合適的賦形劑一起凍幹以形成凍幹塊。於一特佳的實施方式中，上述容器將為特定的針筒形式，此針筒形式可適合連續投與數個精準體積至由於重要器官浸潤而無法藉手術移除的生病組織的切除邊緣或殘餘部分。較合宜地，該容器也可為適合以噴霧形式給予經化學改質的抗生物素蛋白的形式。優選地，該已含有個別成分的劑量的不同容器是製成攜帶用於該投與模式的規格的單一包裝。更佳地，所述各種容器為針筒的形式。於另一特佳實施方式中，該用於近距離放射治療中(如用於IART⑧中)的試劑盒適合用於依序局部投與第一種成分及接下去的系統性或局部投與第二種成分。本發明組合物的第二種成分可借任何數目的途徑投與，包括，但不限於口服、靜脈內、肌肉內、動脈內、髓內、鞘內、室內、皮內或透皮施用、皮下、腹膜內、鼻內、腸內、局部、舌下、陰道內、直腸裝置或在生病組織上局部投與。有些臨床病例的近距離放射治療是藉由直接將放射同位素直接投至腫瘤塊體(即，JulowJ.，etal.，Prog.Neurol.Surg.，2007，20，303中所描述的不宜手術的腦腫瘤)或腫瘤影響器官(即，SaitoS，etal.，Int.J.Clin.Oncol.，2007,12,395中所描述的前列腺)中來進行。在這類病例中，理想的近距離放射治療設備為在受治療部位中顯示出均勻分布及穩定性的設備。根據實驗數據，現已發現組織抗生物素蛋白化可在不同組織中出現，如在肌肉、乳腺(顯示於此處的實施例中)及腦組織中。於另一特佳實施方式中，該複合的氧化的抗生物素蛋白_生物素化的治療劑可經由將二種成分混合來取得，再接著投給患者。本發明的組合物構成用於可手術或不可手術或不可完全移除的實體腫瘤的治療的藥物，這些腫瘤是諸如，但不只限於乳癌、胰臟癌、肺癌、胸膜癌、腹膜癌、面頸癌、膀胱癌、腦癌、前列腺癌、卵巢癌、眼癌及其他器官的癌(如以本申請人的名義申請的專利申請案W02004/093916中所描述者)。根據本發明的優選實施方式，該藉由本發明的方法所取得的氧化的抗生物素蛋白可定義為經化學改質的抗生物素蛋白，該經化學改質的抗生物素蛋白中至少一甘露糖殘基已被下列式(I)的殘基取代式I本發明的另一目的為先前描述的藥學組合物加上賦形劑及/或藥學上可接受的稀釋劑。本發明的另一優選實施方式為用於製備藥學組合物的方法，該方法的特徵為將該經化學改質的抗生物素蛋白與合適的賦形劑、穩定劑及/或藥學上可接受的稀釋劑混合。賦形劑為加入藥物中以提供體積的惰性物質。該藥學組合物也可含有為投與治療劑的藥學上可接受的載體。這類載體包括抗體及其他多肽、基因和其他治療劑(諸如脂質體)，其先決條件為投與該載體時不會產生不當的毒性。合適的載體可為大的、慢慢代謝的巨分子，諸如蛋白質、多醣、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合的胺基酸、胺基酸共聚物及非活性的病毒顆粒。藥學上可接受的載體的詳盡討論可在Remington'sPharmaceuticalSciences(MackPub.Co.，N.J.1991)中找到。治療組合物中的藥學上可接受的載體可另外含有液體，諸如水、生理食鹽水、甘油及乙醇。另外，這類組合物中也可存有輔助性物質，諸如溼潤或乳化劑、pH緩衝物質等。這類載體使藥學組合物可配製成凍幹塊、片劑、藥丸、糖衣錠、膠囊、液體、凝膠、糖漿、漿體、混懸液等形式以供患者食入。欲治療的個體可為動物；尤其是可用來治療人類個體。配藥治療可為單劑量用藥或多劑量用藥。該劑量可由該領域的技術人員決定，以遞送展現有效的治療作用的量至標靶組織。—般的劑量範圍可介於10-100毫升的濃度為3-5毫克/毫升的氧化的抗生11物素蛋白溶液。劑量體積是取決於欲治療的標靶組織的體積，即，乳房四分之一切除術(quadrantectomy)的部位周圍的乳房區域的典型治療中是使用30毫升(PaganelliG.，etal.，TheBreast,2007，16，17)或治療腹膜腔中是使用至多100毫升。氧化的抗生物素蛋白的生化特徵包括藉由本領域的技術人員已知的比色Plirpald⑧法(AvigadG.，Anal.Biochem.，1983，134，2，499)，使用丙醛作為標準來估計CHO基團。附圖簡要說明圖1:其顯示三種不同形式的抗生物素蛋白的UV光譜。圖2:曲線A、B及C分別關於在體積排阻色譜法(Bios印-SEC-S3000柱(PhenOHieneX,300x7.8毫米，體積14.3毫升))上的WTavidin、0XavidinHABA及OXavidin的洗脫變化形廓，該層析法是利用恆組成溶劑洗脫條件，以lOOmM醋酸鈉緩衝液pH5.5及0.15MNaCl，流速1毫升/分鐘，在室溫下進行。後二者是利用NaI04(20mM)，借氧化作用自WTavidin取得。280/260比是關於抗生物素蛋白在色胺酸殘基的氧化及羥吲哚的形成方面的完整性。圖3:其顯示經肌肉內給予後，在受治療的小鼠中的氧化的抗生物素蛋白的生物分布。尤其是，圖3a指出注射後1小時，在受治療的肢體中氧化的抗生物素蛋白的量超過二倍的天然抗生物素蛋白。其差異隨時間增加天然抗生物素蛋白在24和48小時後幾乎測不到，而氧化的抗生物素蛋白分別代表約22%及15%注射劑量/100毫克組織。因此，如圖3b、c及d中分別顯示的血液、腎臟及肝臟的結果，在受治療的肢體中，與野生型抗生物素蛋白相比較，較高濃度的氧化的抗生物素蛋白是與非標靶器官中氧化的抗生物素蛋白的分布較少及野生型抗生物素蛋白的分布較多有關，尤其是在第1小時中。圖3e顯示對側肢體中氧化的抗生物素蛋白及野生型抗生物素蛋白的分布情形。圖4:其顯示經1251-放射性標記的WTavidin及0XaVidinHABA在受治療及對側肢體中至多14周的組織持久性。參考第1小時的水平時，這類圖形指出相對於WTavidin的組織半衰期為2小時，0XavidinHABA的組織半衰期為約2周。圖5:其顯示以配製在100mM醋酸鹽緩衝液pH5.5中的45微克(在15微升體積中)經1251_標記的WTavidin、PEGavidin或OXavidin注射Balb/c小鼠的一邊後肢後24小時，WTavidin、PEGavidin及0XavidinHABA的組織持久性。在受治療的肢體中的放射活性是藉由Y計數器測量(CamberraPackard,SchwadorfAustria)。圖6:其顯示取自注射WTavidin(板面a)或0XavidinmBA(板面b)的Balb/c小鼠肌肉的切片，該切片是先以用於免疫螢光的抗-抗生物素蛋白抗體小鼠抗-抗生物素蛋白腹水(A5680批次064K4826,SigmaAldrich)，再以抗小鼠AlexaFluor488(批次99E2.2，分子探針)染色。板面a顯示微弱的局部點狀，而來自注射OXavidiriH艦的肌肉的切片顯示強而12均勻的分布。二種情況中抗生物素蛋白均定位在間質。圖7:其顯示在經i.v.，注射mIn-ST2210的Balb/c小鼠後肢中於不同時點的持久性，該Balb/c小鼠是在48小時前以WTavidin或0XavidinHABA(板面a)處理。板面b、c及d是分別指經i.v.注射mIn-ST2210後肝臟、腎及脾臟中所捕集的mIn-ST2210。板面e顯示組織抗生物素蛋白化48小時後所捕集的mIn-ST2210。在第二個案例的情況中(重複min-ST2210)，所述動物空腹接受一個冷ST2210(coldST2210)劑量，24小時後再給予第二個mIn-ST2210劑量。圖8:其顯示注射在一隻後肢中1周後，與ST2210複合的WTavidin或OXavidinH艦的組織停留時間。圖9:其顯示注射入頭骨左側後24小時，OXaVidinHABA的腦組織停留時間。下列實施例進一步說明本發明而非限制本發明。實施例實施例1:氧化的抗生物素蛋白的合成方法及生化特徵該氧化程序的方法包含下列連續步驟a)將預先與一摩爾過量的HABA混合的野生型抗生物素蛋白與氧化劑(諸如在pH值低於6.0的50-100mM醋酸鹽緩衝液中的10-20mM過碘酸鈉)於4。C或室溫下培養1_5小時；b)阻斷反應，並藉由色譜法、超濾作用、透析作用或其他本領域的技術人員所已知的純化方法移除氧化劑及HABA，以進行純化；及c)在酸性pH下進行凍幹或製劑。將氧化的抗生物素蛋白在Bios印-SEC-s3000柱(Phenomenex,300x7.8毫米，體積14.3毫升)上，利用恆組成溶劑洗脫條件，以lOOmM醋酸鈉緩衝液pH5.5及0.15MNaCl，流速1毫升/分鐘，在室溫下利用體積排阻色譜法，以進一步分析分子尺寸。如圖2所示，氧化的抗生物素蛋白的洗提液顯示出與天然抗生物素蛋白相比較稍有些延遲。實施例2:氧化的抗生物素蛋白在受治療的小鼠中的生物分布在小鼠模型的剌激性IART⑥中評估與野生型抗生物素蛋白(WTavidin)相比較，氧化的抗生物素蛋白(Oxavidin)在受治療的組織中的持久性、其在未受治療的器官中的生物分布及其捕捉mIn-ST2210的能力。手術切開一小鼠後肢以建立IART逸的動物模型，令經放射性標記的抗生物素蛋白浸潤手術邊緣和周圍組織並在投藥後於不同時間點測量受治療肢體中的放射活性。在小鼠的平行組中令放射活性的抗生物素蛋白浸潤未手術的肢體中。在投藥後的1及24小時，經手術治療及未經手術治療的動物中的放射活性量類似。因此，通過浸潤抗生物素蛋白而不手術來進行進一步研究。根據IodoGen方法(伊利諾州(IL)Rockford市，Pierce)，以^I(義大利，PerkinElmer)標示WTavidin。在PD-1013柱(瑞典Uppsala，AmershamBiosciences)上藉由色譜法將經標記的抗生物素蛋白自游離碘分離出並依先前實施例1中的描述進行氧化，無任何預先的HABA保護。根據先前描述的方法(UrbanoN.，etal.，Eur.JNucl.Med.Mol.Imaging,2007,34,68)，以min(義大利，PerkinElmer)標示專利申請案WO02/066075中所描述的ST2210(第18頁，l-[2-[6-[5-[(3aS，4S，6aR)-六氫-2-氧代-lH-噻吩並[3，4_d]咪唑-4-基]-l-五氨基]-l-六氨基]-2-氧代乙基]-l，4，7，10-四氮雜環十二烷-4，7，10-三醋酸五鹽酸鹽)。將Balb/c皿/皿小鼠(義大利，HarlanUdine)分成8組，每組5隻。經由肌肉內途徑(i.m.)在每隻小鼠的一隻後肢中給予以1251標示的WTavidin或0Xavidin(400微克/小鼠，在40微升的體積中)並在1、24或48小時後經由靜脈內途徑(i.v.)給予小鼠16微克的mIn-ST2210。投與mIn-ST2210後的1、24或48小時處死小鼠並收集受治療及對側的肢體、腎臟、肝臟及血液樣本，在Y-計數器(奧地利Schwadorf，CamberraPackard)中計算。如圖3a中所示，注射1小時後，受治療的肢體中，氧化的抗生物素蛋白的量超過二倍的抗生物素蛋白。其差異隨時間增加WTavidin在24及48小時後幾乎測不到，而0Xavidin分別為約22X及15X的注射劑量/100毫克組織。因此，如圖3b、c及d中的血液、腎臟及肝臟的結果所示，在受治療的肢體中，與野生型抗生物素蛋白相比較，較高濃度的氧化的抗生物素蛋白是與非標靶器官中氧化的抗生物素蛋白的分布較少及野生性抗生物素蛋白的分布較多有關，尤其是在第1小時中。圖3e顯示對側肢體中OXavidin及WTavidin的分布情形。如專利申請案WO2004/093916中所描述，由於IART⑧預先局部投與WTavidin(手術間注射)，4-72小時後再經由靜脈內途徑注射抗癌劑，顯然地，使用經化學改質的抗生物素蛋白(如本發明的實施例中)可提供很好的助益。實施例3:野生型及氧化的抗生物素蛋白的長期組織持久性在Balb/c皿/皿小鼠(義大利Lecco，CharlesRiver)的一隻後肢中注射體積為15微升的配製在pH5.5的lOOmM醋酸鹽緩衝液中的45微克以1251標示的WTavidin或以125I標示的OXavidin並在指出的時間點處死小鼠，借Y_計數器(奧地利Schwadorf，CamberraPackard)測量受治療的肢體及其他非標耙器官中的放射活性。監測WTavidin及OXavidinH艦的組織持久性至多14周。當指1小時的水平時，相對於WTavidin的組織半衰期為2小時，OXavidin的組織半衰期為約2周(圖4)。實施例4:氧化的抗生物素蛋白在乳房組織中的生物分布評估與WTavidin相比較，0XaVidinHABA在乳房組織中的持久性。將依實施例1中所描述的一般方法製備的50微克(在15微升體積中)的以125I標示的WTavidin或OXavidinnABA投至兔子(義大利Rieti，FrancucciEnzo)乳頭下方的乳房區域(每一抗生物素蛋白3個乳房)。注射後24小時處死動物並自注射區收集約200毫克的組織樣本，依前述那樣在Y-計數器中計算。該數據為3個測定值的平均值(+/-SD)。表4中的數據顯示出24小時後乳房組織中的WTavidin及0XaVidinmBA分別為8.5%及65.8%ID。這些數據確認與先前在小鼠的肌肉組織中所觀察到的WTavidin相比較，兔子乳房組織中的0XaVidinHABA具較高的持久性。14[one]表4:兔子乳房組織中WTavidin及0XaVidinHABA的24小時持久性tableseeoriginaldocumentpage15實施例5:野生型、聚乙二醇化或氧化的抗生物素蛋白的組織持久性其他科學小組先前曾描述意圖改良抗生物素蛋白在循環系統中的半衰期的經化學改質的抗生物素蛋白(CalicetiP.，etal.，J.Control.Release,2002，83，97;SalmasoS.，etal.，Int.J.Pharm.，2007，340，20)。在C57B1/6小鼠中(義大利Lecco，CharlesRiver)評估WTavidin、根據Caliceti製備的PEGavidin或0XavidinHABA(根據本發明的氧化的抗生物素蛋白)的組織持久性。在動物的一隻後肢中注射(i.m.)體積為15微升的在pH5.5的lOOmM醋酸鹽緩衝液中配製的45微克以125I標示的WTavidin、PEG-avidin或OXavidin咖A。注射後24小時處死小鼠，用Y-計數器(奧地利Schwadorf，CamberraPackard)測量受治療的肢體中的放射活性。PEG-結合作用不會影響WTavidin的組織持久性，但可確認0XaVidinHABA的組織持久性增加(圖5)。實施例6:WTavidin或0XavidinmBA的組織定位在Balb/c裸鼠(義大利Udine，Harlan)的一隻後肢中經肌肉內注射0XavidinHABA及WTavidin後，在抗生物素蛋白化組織的冷凍切片中評估與WTavidin相比較，0XaVidinHABA的組織定位。治療後24小時切開肌肉並自各樣本製備一系列冷凍切片。將各載玻片以蘇木精/洋紅染色以評估組織形態或將其先與小鼠抗-抗生物素蛋白抗體(義大利，SigmaAldrich，A5680)—起培養，再與抗_小鼠Alexafluor488(義大利米蘭，Invitrogen)一起培養。最後，在載玻片上蓋上蓋玻片並在顯微鏡下觀察。如圖6中所示，自注射WTavidin(板面a)的肌肉取得的切片顯示出微弱的局部點狀，而來自注射0XavidinHABA的肌肉的切片(板面b)顯示強而均勻的分布。在二種情況中抗生物素蛋白均定位在間質處。蘇木精/洋紅染色顯示出以WTavidin或0XavidinHABA注射後24小時肌肉並無組織學上的異常(數據未顯示)。實施例7:mIn-ST2210的單次及重複捕集在小鼠模型的剌激性IART中評估與WTavidin相比較，0XavidinHABA捕集mIn-ST2210的能力。在Balb/c皿/皿小鼠(義大利，HarlanUdine)的一隻後肢中注射(i.m.)體積為15微升的配製在pH5.5的lOOmM醋酸鹽緩衝液中的45微克WTavidin或0XavidinHABA。注射後48小時，經由靜脈內途徑(i.v.)給予動物5微克的mIn-ST2210。在指定的時間點處死各為只的動物組並用Y-計數器(奧地利Schwadorf，CamberraPackard)測量受治療的肢體及其他非標耙器官中的放射活性。如圖7a中所示，在i.v.注射2小時後，以0XaVidinHABA治療的組織所特異捕集的mIn-ST2210較以WTavidin治療者高出很多。這些放射活性的持久性差異在i.v.投與mIn-ST2210後的接續時點仍可持續至多24小時，由此可確認以0XavidinHABA取得的長期持續的組織抗生物素蛋白化。以WTavidin及0XaVidinHABA治療時，mIn_ST2210在非標靶器官中的分布類似(圖7b、c、d)。令一組動物先接受5微克冷ST2210的第1個靜脈內劑量後24小時再接受5微克m工n-ST2210的第2個劑量。前者是在抗生物素蛋白化24小時後進行。經i.v.注射經放射性標示的ST2210後2小時處死動物並依上述Y_計數器測量受治療的肢體中的放射活性。如圖7e中所示，以OXaVidinHABA治療的肢體中所捕集的第二個mIn-ST2210劑量的量與以單一劑量所捕集者相當。此結果暗示本研究中所使用的單一ST2210劑量並未使該抗生物素蛋白化組織被浸透飽和，而將給定的所欲劑量分成幾部分是合適的。實施例8:在NeuT轉基因小鼠中的mIn/9°Y_ST2210捕集及療效義大利託林(Turin)大學GuidoForni教授親切提供攜帶活化的大鼠HER-2/neu致癌基因的Balb/c轉基因小鼠(Balb-NeuT小鼠)(DiCarloE.，etal.，Lab.Invest.，1999，79，10，1261)。在動物12周大時(此時期相當於動物的所有IO個乳房中原位發展出癌症的期間)為每組四隻的動物的二邊IV乳房經乳頭內途徑注射25微升(3.3毫克/毫升)的介質、WTavidin或0XaVidinHABA。48小時後給予(i.v.)動物劑量為4.4微克的經放射標示的ST2210。此劑量相當於用於治療目的的800iiCi的9。Y(飾Ci的mIn_ST2210突起是用於計算劑量)。在投藥後3小時處死2隻動物/組並切開乳房IV及III，依上述在Y-計數器中計算。也收集非標靶器官進行稱重及計算。數據以^D/克組織表示。依前述的乳腺整體分析來評估此預先靶向的近距離放射治療對腫瘤損害的效果(DeGiovanniC.，etal.，CancerResearch,2004，64，4001)。表5中所示的數據指出在NeuT小鼠中，經OXavidin皿治療的IV乳房中有明顯的經放射標示的ST2210的特異捕集，但在經WTavidin治療及經介質治療的IV乳房中均無。來自所有動物組的乳房III為陰性(血液背景水平)，此暗示抗生物素蛋白化是僅局限於受治療的乳房。全部數據與先前關於WTavidin及OXavidiriH艦的組織持久性方面的差異相一致。在任何案例中，血液及非標靶器官(包括腎臟、肝臟及脾臟)中的背景放射活性均低於0.2%ID/克組織，此暗示不需如目前的IAIO^變體般以生物素化白蛋白進行追蹤步驟。此以OXavidin皿為基礎的近距離放射治療對NeuT小鼠的乳腺的效果使經0XaVidinHABA治療的乳房中的癌症損害與經載劑或WTavidin治療的乳房相比較明顯減少(數據未顯示)。表5Neut模型％JMlti/9CIY-ST2210的。/"D/克(土SD)'血液脾臟腎臟肝臟乳房IV乳房III介質0.003(0.001)0.007(0.002)0.143(0.OU)0.023(0.001)0,007(0，002)0.005(0.001)WTavidin0.002(0.001)0.008(0.001)0.161(0.035)0-027(0.006)0.028(0.027)0.007(0.002)OXavididhaba0,003(0.001)0.006(0.001)0.101(0,008〉0-019(0.003)1,784(0,512)實施例9:單步驟近距離放射治療在體外以ST2210將125I-OXavidinHABA飽和後藉由超濾作用將125I-OXavidinHABA自未結合的ST2210中純化出來，再將其經由肌肉內途徑注射入Balb/c小鼠的一隻後肢中。在WTavidin方面也依循相同的實驗計劃。161周後，將受治療的肢體中該以ST2210飽和的WTavidin或0XavidinH^的量與游離的WTavidin或OXavidiriH^相比較。圖8中的結果同時指出在注射後一周仍存有與ST2210複合的OXavidin咖A或未複合的OXavidinHABA(l7%ID/100毫克)，WTavidin則幾乎完全消失(<0.5%ID/100毫克)，由此可證明預先以生物素化試劑飽和的OXaVidinHABA與游離OXavidinHABA有相同的作用方式，其可用於單步驟近距離放射治療。實施例10:OXavidinmBA與WTavidin相比較的腦部持久性在全身麻醉下，將5微升體積(16微克劑量)依前述製備的^I-WTavidin或OXaVidinmBA注射至Balb/c小鼠的腦部。注射入腦部時是使用Hamilton注射器通過頭骨左側，深度達4-5毫米。圖9中的結果指出類似於肌肉和乳房，於注射後24小時，儀在腦部的0XaVidinHABA為約12.65±6.59%ID/100毫克組織。如先前在其他組織中所評估者，WTavidin的量低於2.08±1.03%ID/100毫克組織。此結果指出0XavidinHABA可用於腦瘤的近距離放射治療中或用來眶準腦部生物素化的治療劑。權利要求一種氧化的抗生物素蛋白，其中每一抗生物素蛋白分子至少有一甘露糖殘基被下式所示的殘基所取代FPA00001011318300011.tif2.如權利要求1的氧化的抗生物素蛋白，其包含約8至15個醛部分。3.如權利要求1-2中任一項的氧化的抗生物素蛋白，其具有等於或高於78t:的熱穩定性。4.一種複合物，其是由如權利要求1至3中任一項的氧化的抗生物素蛋白及生物素化的治療劑所組成。5.如權利要求4的複合物，其中該生物素化的治療劑為抗癌劑。6.—種如權利要求4或5的複合物作為藥物的用途。7.—種如權利要求1至3中任一項的氧化的抗生物素蛋白的用途，其中該氧化的抗生物素蛋白是在治療的第一個步驟中投與，接著投與生物素化的治療劑。8.如權利要求6或7的用途，其是在近距離放射治療中用於治療罹患癌症的患者。9.如權利要求8的用途，其中所述癌症為乳癌、胰臟癌、肺癌、胸膜癌、腹膜癌、面頸癌、膀胱癌、腦癌、前列腺癌、卵巢癌或眼癌。10.如權利要求8的用途，其中該抗癌劑是選自放射性同位素、化療劑、細胞因子、毒素及抗癌細胞。11.如權利要求6或7的用途，其中該治療劑的代表為用於治療癌症、退化性或遺傳性疾病的生物素化的幹細胞或體細胞。12.如權利要求4或7的氧化的抗生物素蛋白的用途，其是應用於可用來治療自體免疫/退化性/遺傳性疾病的組織再生中，該自體免疫/退化性/遺傳性疾病包括糖尿病、多發性硬化症、類風溼性關節炎、阿爾茲海默氏症、脊髓受傷、杜興氏肌肉失養症(Duche皿emusculardystrophy)、心肌梗死及中風。13.如權利要求10的用途，其中所述放射性同位素是選自Fe-52、Mn-52m、Co_55、Cu-64、Ga-67、Ga_68、Tc-99m、In-lll、1-123、1-125、1-131、P_32、Sc_47、Cu_67、Y_90、Pd-109、Ag-lll、1-131、Pm-149、Re_186、Re_188、At_211、Pb_212、Bi-212及Lu_177。14.一種藥學組合物，其包含如權利要求1至5中任一項的氧化的抗生物素蛋白或複合物以及藥學上可接受的賦形劑。15.—種試劑盒，其包含在一種容器中的如權利要求14的藥學組合物及在第二種容器中的生物素化的治療劑，所述藥學組合物包含如權利要求1至3中任一項的氧化的抗生物素蛋白。16.如權利要求15的試劑盒，其是用於二步驟的輔助性手術間及圍手術期的局部區域及/或系統性療法中，其中所述二種容器為注射器形式。17.—種氧化抗生物素蛋白的方法，其中該氧化作用包括下列步驟a)將預先與摩爾過量的(HABA)混合的野生型抗生物素蛋白與氧化劑(諸如在pH值低於6.0的50-100mM醋酸鹽緩衝液中的10_20mM過碘酸鈉)於4。C或室溫下培養1_5小時；b)阻斷反應，並藉由色譜法、超濾作用、透析作用或其他本領域的技術人員所已知的純化方法移除氧化劑及HABA，以進行純化；及c)在酸性pH下進行凍幹或製劑。18.治療患有癌症的患者的方法，其特徵在於用權利要求13中任一項的氧化的抗生物素蛋白使欲治療的組織或器官抗生物素蛋白化，接著給予生物素化的抗癌劑，或者對欲治療的組織或器官直接給予權利要求4的複合物。全文摘要本發明描述經化學改質的抗生物素蛋白，其與野生型抗生物素蛋白相比較，在受治療的組織中具有較高的持久性。抗生物素蛋白的氧化作用是在低親和性配體HABA的存在下藉由與過碘酸鹽一起培養來進行，該佔據生物素結合部位的HABA阻止蛋白質在氧化步驟期間變性。過碘酸鹽氧化作用自抗生物素蛋白甘露糖開環中產生CHO基團，一旦注射後便與組織NH2殘基反應以形成穩定的席夫氏鹼(Schiff′sbase)。該固定的抗生物素蛋白可保持結合具有治療活性的生物素化作用劑(如經放射性標記的生物素、幹細胞及體細胞)的能力，可用於近距離放射治療(brachytherapy)(如術中抗生物素蛋白化放射性核素療法(IntraoperativeAvidinationRadionuclideTherapy))或退化性或遺傳性疾病中。文檔編號A61K47/42GK101772353SQ200880101669公開日2010年7月7日申請日期2008年7月16日優先權日2007年8月2日發明者C·A·努佐羅,R·德桑提斯申請人:希格馬託製藥工業公司