基於納米金及lscm反射光模式的細胞成像方法

2023-07-03 16:10:41 2

基於納米金及lscm反射光模式的細胞成像方法
【專利摘要】本發明提供了一種基於納米金及LSCM反射光模式的細胞成像方法，該方法將特異性的靶向分子組裝到納米金顆粒表面，在LSCM下可直接觀察到該探針，將其與細胞共培養後，可利用LSCM觀察細胞內部及表面的納米金生物探針的數量、分布及形態。本發明方法通過種子生長法製備40-50nm的納米金，在其表面修飾與細胞表面的特異性受體相對應的靶向分子作為生物探針，該探針能大量的粘附在細胞表面或進入細胞內，將其與細胞共培養，洗滌並固定後，採用LSCM(雷射掃描共聚焦顯微鏡)反射光的模式來觀察納米金的反射光，可以較為便捷的實現細胞的LSCM成像。
【專利說明】基於納米金及LSCM反射光模式的細胞成像方法

【技術領域】
[0001]本發明涉及納米材料的功能化及應用領域，尤其是一種基於納米金及LSCM(雷射掃描共聚焦顯微鏡)反射光模式的細胞成像方法。

【背景技術】
[0002]目前，已有許多研究表明納米金可以作為探針進入生物組織內部探測生物分子的生理功能，進而在分子水平上解釋生命過程。由於其良好的生物相容性和無毒副作用，被廣泛的應用在生物化學分析，生物分子標記和檢測等領域。如納米金探針在免疫分析中的應用，納米金探針在單細胞分析中的應用，納米金探針在靶向藥物中的應用，納米金探針在DNA檢測中的應用等，然而在眾多應用中，納米金的光學檢測靈敏度仍受到限制，需要結合螢光染料標記法，表面增強拉曼散射等技術來使用，對於其應用造成了局限。
[0003]LSCM(Lsaer scanning confocal microscope,雷射掃描共聚焦顯微鏡)是一種先進的分子生物學和細胞生物學研究儀器。它在螢光顯微鏡成像的基礎上加裝雷射掃描裝置，結合數據化圖像處理技術，採集組織和細胞內螢光標記圖像，在亞細胞水平觀察鈣等離子水平的變化，並結合電生理等技術觀察細胞生理活動與細胞形態及運動變化的相互關係。由於它的應用範圍較廣泛，已成為形態學、分子細胞生物學、神經科學和藥理學等研究領域中很重要的研究技術。但在上述應用中，大部分都需要對目標進行螢光標記，在這過程中，螢光探針在裝載及成像過程中易發生螢光淬滅，影響實驗結果，並且實驗步驟複雜，不易操作。而納米金作為一種較為穩定的體系，只要在其表面接上靶向分子，則能使其對細胞有特異性的靶向作用，能大量的粘附在細胞表面或進入細胞內，然後採用雷射共聚焦反射光的模式來觀察納米金的反射光，可以較為便捷地實現細胞的雷射掃描共聚焦顯微鏡成像。在現有的研究中，尚未見利用雷射掃描共聚焦顯微鏡反射光模式觀察納米金生物探針與細胞相互作用及細胞成像的研究。


【發明內容】

[0004]針對現有技術中的缺陷，本發明的目的是提供一種基於納米金及LSCM反射光模式的細胞成像方法。
[0005]本發明是通過以下技術方案實現的:
[0006]本發明提供一種基於納米金及LSCM反射光模式的細胞成像方法，將特異性的靶向分子組裝到納米金顆粒表面構成探針，在LSCM下可直接觀察到該探針，將其與細胞共培養後，可利用LSCM觀察細胞內部及表面的納米金生物探針的數量、分布及形態。
[0007]優選地，所述方法包括如下步驟:
[0008](I)採用檸檬酸三鈉還原製得金種溶液；
[0009](2)採用種子生長法製得大粒徑的納米金溶液；
[0010](3)將靶向分子加入到步驟(2)製備的納米金溶液中，混合均勻，進行組裝；
[0011](4)組裝好的溶液離心洗滌；
[0012](5)洗滌後得到納米金生物探針，將該探針用細胞培養基重懸浮；
[0013](6)將(5)處理後的納米金生物探針加入到細胞中，於培養箱中與細胞共培養；
[0014](7)將細胞用緩衝液洗滌並用多聚甲醛固定後，即可在雷射共聚焦掃描顯微鏡下觀察成像。
[0015]優選地，所述納米金溶液所用納米金的粒徑為40_50nm ;粒徑過小，超過雷射共聚焦顯微鏡解析度；粒徑過大，導致所製備探針過大，引起聚集或影響後期應用。
[0016]優選地，所述金種溶液的製備方法為:所述金種溶液的製備方法為:將I?5mM檸檬酸三鈉溶液10mL加熱攪拌，冷凝回流至沸騰，快速注入10?30mM HAuCl4溶液400 μ L，得到1nm的金種溶液。
[0017]優選地，所述納米金溶液的製備方法為:將所述的金種溶液在原容器中降溫至90°C，注入10-30mM HAuCl4溶液400 μ L，30min反應結束後，重複以上步驟兩次；取出22mL樣品,注入l_5mM的檸檬酸三鈉22mL，作為種子溶液，重複本步驟4_6次，得40_50nm的納米金溶液。
[0018]優選地，所述靶向分子為葉酸、透明質酸、多肽分子中的一種。
[0019]優選地，所述離心洗滌的條件為4°C，12000-5000r/min，5min，洗滌液為去離子水；轉速過低造成探針的損失，過高可能會引起探針的聚集。
[0020]優選地，所述納米金生物探針與細胞於37°C，體積含量5% CO2的培養箱中共培養時間為 30-120min。
[0021]優選地，所述雷射的波長為488_633nm。
[0022]與現有技術相比，本發明具有如下的有益效果:
[0023](I)本發明利用製備的納米金-靶向分子生物探針應用於細胞的LSCM反射光模式成像，不需要螢光標記，操作簡便。納米金-靶向分子生物探針與細胞表面受體結合明顯，在LSCM下能看到細胞表面附著有亮點(雷射波長不同，顆粒反射光顏色不同)，而作為對照組的未經靶向分子標記的納米金細胞與共培養時，細胞表面無明顯亮點出現。
[0024](2)本發明方法無需對目標進行螢光標記，避免螢光探針在裝載及成像過程中發生淬滅，能直觀地觀察到納米生物探針與細胞的識別及相互作用。
[0025](3)本發明採用納米金作為一種生物相容性極佳的材料，為作為腫瘤細胞靶向治療的藥物載體提供了可能。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]通過閱讀參照以下附圖對非限制性實施例所作的詳細描述，本發明的其它特徵、目的和優點將會變得更明顯:
[0027]圖1為未經靶向分子修飾的納米金生物探針與細胞共培養後，在LSCM反射光模式下拍攝的照片；
[0028]圖2為納米金-靶向分子生物探針與細胞共培養後，在LSCM反射光模式下拍攝的照片。

【具體實施方式】
[0029]下面結合具體實施例對本發明進行詳細說明。以下實施例將有助於本領域的技術人員進一步理解本發明，但不以任何形式限制本發明。應當指出的是，對本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進。這些都屬於本發明的保護範圍。
[0030]實施例1
[0031]本實施例涉及一種基於納米金及LSCM反射光模式的細胞成像方法:具體步驟如下:
[0032](l)2.2mM檸檬酸三鈉溶液10mL加熱攪拌，冷凝回流至沸騰，快速注入25mMHAuC14溶液400 μ L,得到1nm的金種；
[0033](2)在原容器中降溫至90°C，注入25mM HAuCl4溶液400 μ L，約30min後反應結束，該過程重複兩次；吸出22mL樣品，注入2.2mM的檸檬酸三鈉22mL，作為種子溶液，重複以上步驟，約4-6次,可得40-50nm的金膠溶液；
[0034](3)取金膠100 μ L與100 μ L ImM巰基修飾的HA溶液室溫下攪拌60min，所得溶液於4°C, 8000r/min離心5min,去上清；
[0035](4)用去離子水洗滌3遍；
[0036](5)用100 μ L細胞培養基重懸；
[0037](6)將納米金-HA生物探針及未經HA修飾的納米金分別加入到兩個含900 μ L培養基的結腸癌細胞培養皿中，於37°C，5% CO2的培養箱中培養60min培養；
[0038](7)用pH = 7.4的PBS緩衝液洗滌三遍，並用多聚甲醛固定30min後洗滌；將細胞放置LSCM下,調反射光模式,米用488nm雷射拍攝。
[0039]實施例2
[0040]本實施例涉及一種基於納米金及LSCM反射光模式的細胞成像方法:具體步驟如下:
[0041](l)2.2mM檸檬酸三鈉溶液10mL加熱攪拌，冷凝回流至沸騰，快速注入25mMHAuCl4溶液400 μ L,得到1nm的金種；
[0042](2)在原容器中降溫至90°C，注入25mM HAuCl4溶液400 μ L，約30min後反應結束，該過程重複兩次；吸出22mL樣品，注入2.2mM的檸檬酸三鈉22mL，作為種子溶液，重複以上步驟，約4-6次,可得45nm的金膠溶液；
[0043](3)取金膠100 μ L與100 μ L ImM巰基修飾的HA溶液室溫下攪拌60min，所得溶液於4°C, 8000r/min離心5min,去上清；
[0044](4)用去離子水洗滌3遍；
[0045](5)用100 μ L細胞培養基重懸；
[0046](6)將納米金-HA生物探針及未經HA修飾的納米金分別加入到兩個含900 μ L培養基的結腸癌細胞培養皿中，於37°C，5% CO2的培養箱中培養60min ；
[0047](7)用pH = 7.4的PBS緩衝液洗滌三遍，並用多聚甲醛固定30min後洗滌，將細胞放置LSCM下,調反射光模式,米用532nm雷射拍攝。
[0048]實施例3
[0049]本實施例涉及一種基於納米金及LSCM反射光模式的細胞成像方法:具體步驟如下:
[0050](l)2.2mM檸檬酸三鈉溶液10mL加熱攪拌，冷凝回流至沸騰，快速注入25mMHAuCl4溶液400 μ L,得到1nm的金種；
[0051](2)在原容器中降溫至90°C，注入25mM HAuCl4溶液400 μ L，約30min後反應結束，該過程重複兩次；吸出22mL樣品，注入2.2mM的檸檬酸三鈉22mL，作為種子溶液，重複以上步驟，約4-6次,可得40-50nm的金膠溶液；
[0052](3)取金膠100 μ L與100 μ L ImM巰基修飾的HA溶液室溫下攪拌60min，所得溶液於4°C, 8000r/min離心5min,去上清；
[0053](4)用去離子水洗滌3遍；
[0054](5)用100 μ L細胞培養基重懸；
[0055](6)將納米金-HA生物探針及未經HA修飾的納米金分別加入到兩個含900 μ L培養基的結腸癌細胞培養皿中，於37°C，5% CO2的培養箱中培養60min ；
[0056](7)用pH = 7.4的PBS緩衝液洗滌三遍，並用多聚甲醛固定30min後洗滌，將細胞放置LSCM下,調反射光模式,米用633nm雷射拍攝。
[0057]實施例4
[0058]本實施例涉及一種基於納米金及LSCM反射光模式的細胞成像方法:具體步驟如下:
[0059](I) ImM檸檬酸三鈉溶液10mL加熱攪拌，冷凝回流至沸騰，快速注入10mMHAuC14溶液400 UL,得到1nm的金種；
[0060](2)在原容器中降溫至90°C，注入1mM HAuCl4溶液400 μ L，約30min後反應結束，該過程重複兩次；吸出22mL樣品，注入ImM的檸檬酸三鈉22mL，作為種子溶液，重複以上步驟，約4-6次,可得40-50nm的金膠溶液；
[0061](3)取金膠100 μ L與100 μ L ImM巰基修飾的HA溶液室溫下攪拌60min，所得溶液於4°C, 8000r/min離心5min,去上清；
[0062](4)用去離子水洗滌3遍；
[0063](5)用100 μ L細胞培養基重懸；
[0064](6)將納米金-HA生物探針及未經HA修飾的納米金分別加入到兩個含900 μ L培養基的結腸癌細胞培養皿中，於37°C，5% CO2的培養箱中培養60min培養；
[0065](7)用pH = 7.4的PBS緩衝液洗滌三遍，並用多聚甲醛固定30min後洗滌；將細胞放置LSCM下,調反射光模式,米用488nm雷射拍攝。
[0066]實施例5
[0067]本實施例涉及一種基於納米金及LSCM反射光模式的細胞成像方法:具體步驟如下:
[0068](I) 5mM檸檬酸三鈉溶液10mL加熱攪拌，冷凝回流至沸騰，快速注入50mMHAuC14溶液400 UL,得到1nm的金種；
[0069](2)在原容器中降溫至90°C，注入50mM HAuCl4溶液400 μ L，約30min後反應結束，該過程重複兩次；吸出22mL樣品，注入5mM的檸檬酸三鈉22mL，作為種子溶液，重複以上步驟，約4-6次,可得40-50nm的金膠溶液；
[0070](3)取金膠100 μ L與100 μ L ImM巰基修飾的HA溶液室溫下攪拌60min，所得溶液於4°C, 8000r/min離心5min,去上清；
[0071](4)用去離子水洗滌3遍；
[0072](5)用100 μ L細胞培養基重懸；
[0073](6)將納米金-HA生物探針及未經HA修飾的納米金分別加入到兩個含900 μ L培養基的結腸癌細胞培養皿中，於37°C，5% CO2的培養箱中培養60min培養；
[0074](7)用pH = 7.4的PBS緩衝液洗滌三遍，並用多聚甲醛固定30min後洗滌；將細胞放置LSCM下,調反射光模式,米用488nm雷射拍攝。
[0075]實施例6
[0076]本實施例涉及一種基於納米金及LSCM反射光模式的細胞成像方法:具體步驟如下:
[0077](l)2.2mM檸檬酸三鈉溶液10mL加熱攪拌，冷凝回流至沸騰，快速注入25mMHAuCl4溶液400 μ L,得到1nm的金種；
[0078](2)在原容器中降溫至90°C，注入25mM HAuCl4溶液400 μ L，約30min後反應結束，該過程重複兩次；吸出22mL樣品，注入2.2mM的檸檬酸三鈉22mL，作為種子溶液，重複以上步驟，約4-6次,可得40-50nm的金膠溶液；
[0079](3)取金膠100 μ L與100 μ L ImM巰基修飾的FA溶液室溫下攪拌60min，所得溶液於4°C, 8000r/min離心5min,去上清；
[0080](4)用去離子水洗滌3遍；
[0081 ] (5)用100 μ L細胞培養基重懸；
[0082](6)將納米金-FA生物探針及未經FA修飾的納米金分別加入到兩個含900 μ L培養基的肺腺癌細胞培養皿中，於37°C，5% CO2的培養箱中培養60min ；
[0083](7)用pH = 7.4的PBS緩衝液洗滌三遍，並用多聚甲醛固定30min後洗滌，將細胞放置LSCM下,調反射光模式,米用488nm雷射拍攝。
[0084]實施例7
[0085]本實施例涉及一種基於納米金及LSCM反射光模式的細胞成像方法:具體步驟如下:
[0086](l)2.2mM檸檬酸三鈉溶液10mL加熱攪拌，冷凝回流至沸騰，快速注入25mMHAuCl4溶液400 μ L,得到1nm的金種；
[0087](2)在原容器中降溫至90°C，注入25mM HAuCl4溶液400 μ L，約30min後反應結束，該過程重複兩次；吸出22mL樣品，注入2.2mM的檸檬酸三鈉22mL，作為種子溶液，重複以上步驟，約4-6次,可得40-50nm的金膠溶液；
[0088](3)取金膠100 μ L與100 μ L ImM巰基修飾的FA溶液室溫下攪拌60min，所得溶液於4°C, 8000r/min離心5min,去上清；
[0089](4)用去離子水洗滌3遍；
[0090](5)用100 μ L細胞培養基重懸；
[0091](6)將納米金-FA生物探針及未經FA修飾的納米金分別加入到兩個含900 μ L培養基的肺腺癌細胞培養皿中，於37°C，5% CO2的培養箱中培養60min ；
[0092](7)用pH = 7.4的PBS緩衝液洗滌三遍，並用多聚甲醛固定30min後洗滌，將細胞放置LSCM下,調反射光模式,米用633nm雷射拍攝。
[0093]實施例8
[0094]本實施例涉及一種基於納米金及LSCM反射光模式的細胞成像方法:具體步驟如下:
[0095](I) 2.2mM檸檬酸三鈉溶液10mL加熱攪拌，冷凝回流至沸騰，快速注入25mMHAuCl4溶液400 μ L,得到1nm的金種；
[0096](2)在原容器中降溫至90°C，注入25mM HAuCl4溶液400 μ L，約30min後反應結束，該過程重複兩次；吸出22mL樣品，注入2.2mM的檸檬酸三鈉22mL，作為種子溶液，重複以上步驟，約4-6次,可得40-50nm的金膠溶液；
[0097](3)取金膠100 μ L，用0.1M的NaOH調節pH為10，加入2%的多肽溶液10 μ L，室溫下組裝30min,所得溶液於4?, 8000r/min離心5min,去上清；
[0098](4)用去離子水洗滌3遍；
[0099](5)用100 μ L細胞培養基重懸；
[0100](6)將納米金-多肽生物探針及未經多肽修飾的納米金分別加入到兩個含900 μ L培養基的神經膠質瘤細胞培養皿中，於37°C，5% CO2的培養箱中培養60min ；
[0101](7)用pH = 7.4的PBS緩衝液洗滌三遍，並用多聚甲醛固定30min後洗滌，將細胞放置LSCM下,調反射光模式,米用488nm雷射拍攝。
[0102]實施例9
[0103]本實施例涉及一種基於納米金及LSCM反射光模式的細胞成像方法:具體步驟如下:
[0104](l)2.2mM檸檬酸三鈉溶液10mL加熱攪拌，冷凝回流至沸騰，快速注入25mMHAuCl4溶液400 μ L,得到1nm的金種；
[0105](2)在原容器中降溫至90°C，注入25mM HAuCl4溶液400 μ L，約30min後反應結束，該過程重複兩次；吸出22mL樣品，注入2.2mM的檸檬酸三鈉22mL，作為種子溶液，重複以上步驟，約4-6次,可得40-50nm的金膠溶液；
[0106](3)取金膠100 μ L，用0.1M的NaOH調節pH為10，加入2%的多肽溶液10 μ L，室溫下組裝30min,所得溶液於4?, 8000r/min離心5min,去上清；
[0107](4)用去離子水洗滌3遍；
[0108](5)用100 μ L細胞培養基重懸；
[0109](6)將納米金-多肽生物探針及未經多肽修飾的納米金分別加入到兩個含900 μ L培養基的神經膠質瘤細胞培養皿中，於37°C，5% CO2的培養箱中培養60min ；
[0110](7)用pH = 7.4的PBS緩衝液洗滌三遍，並用多聚甲醛固定30min後洗滌，將細胞放置LSCM下,調反射光模式,米用633nm雷射拍攝。
[0111]對比例
[0112]每個實施例步驟(6)中均設有對照組。圖1為未經修飾的金與細胞共培養後的LSCM反射光模式成像，圖2為經靶向分子修飾後的金與細胞共培養後的LSCM反射光模式成像。從圖1-2對比可看出，由於細胞表面含有靶向分子的受體，經該靶向分子修飾後的金與受體識別並大量富集到細胞表面(即圖2中白色亮點區域)，實現了細胞的成像；作為對t匕，圖1中基本看不到白色亮點的富集區。
[0113]以上對本發明的具體實施例進行了描述。需要理解的是，本發明並不局限於上述特定實施方式，本領域技術人員可以在權利要求的範圍內做出各種變形或修改，這並不影響本發明的實質內容。
【權利要求】
1.一種基於納米金及LSCM反射光模式的細胞成像方法，其特徵在於，將特異性的靶向分子組裝到納米金顆粒表面構成探針，在LSCM下可直接觀察到該探針與細胞共培養後，利用LSCM觀察細胞內部及表面的納米金生物探針的數量、分布及形態；所述方法包括如下步驟: (1)採用檸檬酸三鈉還原製得金種溶液； (2)採用種子生長法製得大粒徑的納米金溶液； (3)將靶向分子加入到步驟(2)製備的納米金溶液中，混合均勻，進行組裝； (4)組裝好的溶液離心洗滌； (5)洗滌後得到納米金生物探針，將該探針用細胞培養基重懸浮； (6)將(5)處理後的納米金生物探針加入到細胞中，於培養箱中與細胞共培養； (7)將細胞用緩衝液洗滌並用多聚甲醛固定後，即可在雷射共聚焦掃描顯微鏡下觀察成像。
2.如權利要求1所述的基於納米金及LSCM反射光模式的細胞成像方法，其特徵在於，所述納米金溶液所用納米金的粒徑為40-50nm。
3.如權利要求1所述的基於納米金及LSCM反射光模式的細胞成像方法，其特徵在於，所述金種溶液的製備方法為:將l_5mM檸檬酸三鈉溶液10mL加熱攪拌，冷凝回流至沸騰，快速注入10-30mM HAuCl4溶液400 μ L，得到1nm的金種溶液。
4.如權利要求1所述的基於納米金及LSCM反射光模式的細胞成像方法，其特徵在於，所述納米金溶液的製備方法為:將所述的金種溶液在原容器中降溫至90°C，注入10-30mMHAuCl4溶液400μ L，30min反應結束後，重複以上步驟兩次；取出22mL樣品，注入l_5mM的檸檬酸三鈉22mL，作為種子溶液，重複本步驟4-6次，得40_50nm的納米金溶液。
5.如權利要求1任一項所述的基於納米金及LSCM反射光模式的細胞成像方法，其特徵在於，所述靶向分子為葉酸、透明質酸、多肽分子中的一種。
6.如權利要求1-5任一項所述的基於納米金及LSCM反射光模式的細胞成像方法，其特徵在於，所述離心洗滌的條件為4°C，12000-5000r/min，5min，洗滌液為去離子水。
7.如權利要求1-5任一項所述的基於納米金及LSCM反射光模式的細胞成像方法，其特徵在於，所述納米金生物探針與細胞於37°C，體積含量5% CO2的培養箱中共培養時間為30_120mino
8.如權利要求1-5任一項所述的基於納米金及LSCM反射光模式的細胞成像方法，其特徵在於，所述雷射的波長為488-633nm。
【文檔編號】G01N21/49GK104316497SQ201410606027
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年10月31日 優先權日:2014年10月31日
【發明者】何丹農, 胡衝婭, 顏娟, 金彩虹 申請人:上海交通大學, 上海納米技術及應用國家工程研究中心有限公司