一種診斷妊娠糖尿病的microRNA分子標誌物及其檢測試劑盒的製作方法

2023-07-03 08:54:56

專利名稱：一種診斷妊娠糖尿病的microRNA分子標誌物及其檢測試劑盒的製作方法
技術領域：
:本發明涉及一種診斷妊娠糖尿病的microRNA分子標誌物及用於診斷妊娠糖尿病的試劑盒。
背景技術：
:在妊娠中晚期，隨著孕周的增加，孕婦體內抗胰島素樣物質(如:胎盤生乳素，雌激素、孕酮等)的分泌也不斷升高，這直接導致了孕婦對於胰島素的敏感性也隨之下降，為了維持正常的糖代謝水平，胰島素分泌量必須相應增加，對於那些胰島素分泌受限的孕婦，由於不能正常代謝這一生理變化而最終導致血糖升高。我們將這種懷孕前未患有糖尿病，而在懷孕時才出現高血糖的臨床症狀稱妊娠糖尿病(Gestational diabetes mellitus,GDM)，它是糖尿病的一種特殊類型。妊娠糖尿病是高危妊娠，嚴重危害了母兒的健康。如果對於妊娠糖尿病不加以任何治療與控制，那麼妊娠糖尿病患者的胎兒圍產期死亡率則會大於 40%。隨著人們生活水平的提高以及生育年齡的推遲等綜合社會因素的影響，妊娠糖尿病的發病率正在急劇上升。最新的調查數據顯示我國妊娠糖尿病患者的發病率已經達到了6.6%。雖然隨著胰島素的問世和圍產醫學的發展，妊娠糖尿病患者的胎兒圍產期死亡率已經大大的降低了，但是妊娠糖尿病依然會帶來許多不良的妊娠結局。其中，巨大兒(出生體重超過4000克的嬰兒)的分娩就是妊娠糖尿病患者最主要的不良妊娠結局。巨大兒在分娩過程不僅自身面臨的危 險要比正常體重兒高，而且也容易對母體造成創傷。同時有研究資料顯示，巨大兒中發生心臟畸形的比例要高於一般正常體重兒，並且在長大後患肥胖症的機率也會升高，將成為糖尿病、高血壓等多種疾病的易患人群。眾所周知，在孕婦妊娠期間，胎盤是一個重要的器官，是連接母嬰生命的橋梁。對胎盤結構與功能的研究是認識母體疾病對胚胎影響的關鍵環節。在過去的一段時間裡，研究者們已經對於「為何妊娠糖尿病患者分娩巨大兒的機率會明顯增高」這一科學問題已經進行了初步的探討，普遍的觀點認為，母體的高血糖環境會誘導胎盤中某些生長因子異常表達，最終導致巨大兒的產生。mi croRNAs (miRNAs)是一類由大約22個核苷酸組成的單鏈非編碼的小分子RNA，這類小分子廣泛的存在於動植物中並承擔了重要的生物學功能。miRNAs主要是通過在後轉錄水平上對基因的表達調控來實現其相應的生物學功能的，在很多疾病的發生和發展過程中扮演了極其重要的角色，其不但可以成為預測某些疾病發生的分子標誌物而且還有可能成為治療某些疾病的分子靶點。越來越多的研究證據已經表明miRNA作為一種調控因子在糖尿病以及糖尿病的併發症中均扮演了重要的角色。有研究結果表明，血清中的miRNA分子是由組織中的miRNA主動分泌而獲得的，因此，分析組織中miRNA的表達譜對血清中的miRNA篩選也具有指導意義。對妊娠糖尿病的診斷可以儘早的對患者的飲食和生活規律進行科學的調控，必要時，還可以對患有妊娠糖尿病的孕婦使用胰島素進行治療，所有這些措施，都為了將孕婦的血糖調控在合適的生理範圍內，降低巨大兒產生的機率，提高我國的人口質量。目前，對於妊娠糖尿病的診斷只能依靠「糖耐量」檢測進行，這種檢測手段需要連續4次對孕婦吸取靜脈血進行，給孕婦帶來了一定的痛苦。因此研發一種可以減輕孕婦痛苦，並可以準確預測或者診斷妊娠糖尿病的分子標誌物至關重要。本發明提供了一種miRNA分子作為妊娠糖尿病預測或診斷的分子標誌物，通過現代生物學技術檢測微量血清樣品中這種分子標誌物的表達水平來診斷妊娠糖尿病具有重要意義。

發明內容
首先，本發明提供一種可用於診斷妊娠糖尿病的miRNA分子標記物。本發明提供的用於診斷妊娠糖尿病的miRNA為hsa-miR-508-3p (簡稱miR-508)，其序列為:5』-UGAUUGUAGCCUUUUGGAGUAGA-3』 (SEQ ID NO:1) 本發明提供的miRNA分子在妊娠糖尿病孕婦的胎盤組織中異常高表達，並可以通過組織的主動分泌過程分泌到血清中。本發明提供的miRNA可用作妊娠糖尿病診斷的主要標誌物。本發明還提供所述RNA的編碼分子，其序列為DNA: 5 』 -TGATTGTAGCCTTTTGGAGTAGA-3』 (SEQ ID NO:2)。本發明還提供了所述miRNA分子標記物在診斷妊娠糖尿病中的應用。其中，胎盤中miRNA分子水平過高顯示受試者患有妊娠糖尿病。另一方面，本發明提供了用於診斷妊娠糖尿病的試劑盒，其中該試劑盒包含用於檢測血清中hsa-miR-508-3p水平的試劑。在一個優選的實施方案中，該診斷試劑盒為實時定量PCR檢測試劑盒。在一個更優選的實施方案中，該試劑盒包含實時定量PCR引物，其序列為 5』 -TGATTGTAGCCTTTTGGAGTAGA-3』 (SEQ ID NO:2)
在再一方面，本發明提供了用於實時定量PCR檢測血清中hsa-miR-508-3p水平的引物，其序列為 5』-TGATTGTAGCCTTTTGGAGTAGA-3』(SEQ ID NO:2)。本發明還提供了如 SEQID NO:2所示的引物在製備用於診斷妊娠糖尿病的試劑盒中的用途。


:圖1妊娠糖尿病孕婦以及正常對照孕婦胎盤中miRNA的表達分析。圖2妊娠糖尿病孕婦以及正常對照孕婦血清中miRNA的表達分析。具體的實施方式以下的實施例便於更好的理解本發明，但並不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所有的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。實施例1、晶片法分析妊娠糖尿病孕婦胎盤中miRNA表達譜變化。取妊娠糖尿病患者胎盤20例，取正常孕婦胎盤20例作為對照。按照下述方法提取組織RNA。①取新鮮胎盤樣品，將20例混合，液氮冷凍，用研缽研磨至組織成粉末狀(研磨過程中用液氮保持樣品處於低溫狀態)，在Iml的TRIZOL中加入取適量樣品粉末，室溫放置Ih0②在TRIZOL中加入三氯甲烷200μ 1，劇烈震蕩後，靜置21^11，41:，120001^111，離心15min。③去上清，在上清液中加入等體積的異丙醇，劇烈震蕩後，室溫靜置10min，4°C，12000rpm,離心 lOmin。④棄上清，將沉澱放置在通風處，晾乾。⑤加入10 μ IDEPC 水 65°C促溶。將提取的RNA進行miRNA的表達晶片分析，結果見表I。由表I中發現，hsa-miR-508-3p在妊娠糖尿病樣本中和正常樣本中表達具有顯著差異，所述hsa-miR-508-3p 的序列如序列表序列 I 所示,其序列為:5』_UGAUUGUAGCCUUUUGGAGUAGA_3，(SEQ ID NO:I) ο所述hsaniR-508-3p的編碼序列如序列表中序列2所不,其序列為:5，-TGATTGTAGCCTTTTGGAGTAGA-3』 (SEQ ID NO:2)。表1、晶片篩選妊娠糖尿病患者胎盤中miRNA表達譜的變化
權利要求
1.用於診斷妊娠糖尿病的miRNA分子標記物hsa-miR-508-3p,其序列如序列表SEQIDNO:1所示，所述miRNA分子標記物在妊娠糖尿病孕婦的胎盤組織中異常高表達，並通過組織的主動分泌過程分泌到血清中。
2.分泌至血清中的hsa-miR-508-3p作為診斷妊娠糖尿病的分子標記物的用途。
3.用於診斷妊娠糖尿病的試劑盒，其特徵在於所述試劑盒包含用於檢測胎盤或血清中hsa-miR-508_3p水平的試劑，其中所述hsa-miR-508_3p的核苷酸序列如序列表SEQ IDNO:1所示。
4.根據權利要求3的試劑盒，其中所述試劑盒為實時定量PCR檢測試劑盒，其包含序列如SEQ ID NO:2所示的實時定量PCR檢測引物。
5.根據權利 要求4的試劑盒，其中所述試劑盒還包含PCR反應試劑，以及使用說明書。
6.用於特異性檢測血清中hsa-miR-508-3p水平的試劑在製備用於診斷妊娠糖尿病的試劑盒中的用途。
7.權利要求6的用途，其中所述特異性檢測血清中hsa-miR-508-3p水平的試劑包含序列如SEQ ID NO:2所示的實時定量PCR檢測引物。
8.用於實時定量PCR檢測血清中hsa-miR-508-3p水平的引物，其序列如SEQID NO:2所示。
9.序列如SEQID NO:2所示的PCR檢測引物在製備用於診斷妊娠糖尿病的試劑盒中的用途。
全文摘要
本發明提供用於診斷妊娠糖尿病的miRNA分子標記物，其為hsa-miR-508-3p，其序列如序列表SEQ ID NO1所示，所述miRNA分子標記物在妊娠糖尿病孕婦的胎盤組織中異常高表達，並通過組織的主動分泌過程分泌到血清中。本發明還提供了用於診斷妊娠糖尿病的試劑盒，其特徵在於所述試劑盒包含用於檢測血清中hsa-miR-508-3p水平的試劑，其中所述hsa-miR-508-3p的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO1所示。
文檔編號C12N15/11GK103205505SQ201310158449
公開日2013年7月17日 申請日期2013年5月3日 優先權日2013年5月3日
發明者周玲, 劉彥君, 張妍 申請人:周玲, 劉彥君, 張妍