REPS1在製備兒童I型糖尿病診斷產品中的用途的製作方法
2023-07-03 09:09:26 1
本發明涉及兒童i型糖尿病診斷、預測預後領域，更具體地，本發明涉及以檢測reps1異常為手段的兒童i型糖尿病診斷、預測預後方法。
背景技術：
i型糖尿病(t1dm)為在遺傳基礎上由環境因素激發的、自身免疫介導的以胰腺β細胞受損為特徵的自身免疫性疾病，是一種由於胰島素缺乏或作用不足引起的能量代謝疾病。通常在兒童、少年、青年時期被診斷，發病風險最高的年齡段是10-14歲，青少年以後，發病率下降。兒童i型糖尿病以往多指小於15歲發生的糖尿病，由於who(世界衛生組織)已經兒童定義為0-18歲，因此兒童糖尿病應指小於18歲發生的糖尿病。兒童1型糖尿病的臨床表現為多尿、多飲、多食及消瘦。兒童1型糖尿病比成人糖尿病重，起病較急，不易早期發現，胰島β細胞的功能可出現明顯下降甚至發展為衰竭，早期併發症即可出現，如糖尿病酮症甚至酸中毒，如處理不及時或不當，可能危及生命。i型糖尿病確切發病機制尚未完全闡明，目前認為是遺傳、免疫和環境因素共同作用所致。
高通量測序技術(high-throughputsequencing)是指能夠一次並行對幾十萬到幾百萬條dna分子進行序列測定，每一次序列測定的讀長一般較短的測序技術。高通量測序技術是對傳統測序一次革命性變革，隨著2005年羅氏的454測序儀及2006年solexa測序儀出現後飛速發展，2009年左右高通量測序技術在國內興起。高通量測序類型分為多種，基因晶片、基因深度測序(genomere-sequencing)、轉錄組深度測序(transcriptomere-sequencing又稱rna-seq)等。
細胞的功能是從基因的表達開始的，轉錄組是指某一時間細胞內所有基因轉錄而來的rna總稱。通過高通量測序技術可獲得基因表達的rna水平有關信息，可以揭示基因表達與一些生命現象之間的內在聯繫。
高通量測序技術的快速發展和應用，為兒童i型糖尿病發病機理的研究提供了更加全面和快速的分析手段，也為兒童i型糖尿病的進一步治療方案提供嶄新思路。深入研究兒童i型糖尿病相關基因的調控機制，有助於了解兒童i型糖尿病的遺傳分子機制，為尋找新的藥物提供理論依據。
技術實現要素：
本發明的目的之一在於提供一種通過檢測reps1基因或蛋白表達差異來診斷兒童i型糖尿病的方法。
本發明的目的之二在於提供一種通過檢測reps1基因或蛋白表達差異來預測兒童i型糖尿病預後的方法。
為了實現上述目的，本發明採用了如下技術方案：
本發明提供了檢測reps1基因或reps1蛋白的產品在製備兒童i型糖尿病診斷工具中的用途。
本發明還提供了檢測reps1基因或reps1蛋白的產品在製備預測兒童i型糖尿病預後工具中的用途。
進一步，所述檢測reps1基因或reps1蛋白的產品包括檢測reps1基因或reps1蛋白的表達水平的產品。所述產品包括能夠結合reps1基因的核酸或者能夠結合reps1蛋白的物質(例如抗體)。所述核酸能夠檢測reps1基因的表達水平；所述物質能夠檢測reps1蛋白的表達水平。
本發明的檢測reps1基因的產品可基於使用核酸分子的已知方法來發揮其功能：如pcr、如southern雜交、northern雜交、點雜交、螢光原位雜交(fish)、dna微陣列、aso法、高通量測序平臺等。使用該產品可以定性地、定量地、或半定量地實施分析。
包含在上述產品中的核酸可以通過化學合成來獲得，或通過從生物材料製備含有期望核酸的基因，然後使用設計用於擴增期望核酸的引物擴增它來獲得。
進一步，所述pcr方法為已知方法，例如，arms(amplificationrefractorymutationsystem，擴增不應突變系統)法、rt-pcr(逆轉錄酶-pcr)法、嵌套pcr法等等。擴增的核酸可以通過使用點印跡雜交法、表面等離子共振法(spr法)、pcr-rflp法、原位rt-pcr法、pcr-sso(序列特異性寡核苷酸)法、pcr-ssp法、ampflp(可擴增片段長度多態性)法、mvr-pcr法、和pcr-sscp(單鏈構象多態性)法來檢測。
上面所述的核酸包括擴增reps1基因的引物，產品中包括的引物可以通過通過化學合成來製備，通過使用本領域技術人員知道的方法參考已知信息來適當地設計，並通過化學合成來製備。
在本發明的具體實施方案中，所述核酸為qpcr實驗中使用的擴增引物，所述引物的序列如seqidno.1(正向序列)和seqidno.2(反向序列)所示。
上面所述的核酸還可包括探針，所述探針可以通過化學合成來製備，通過使用本領域技術人員知道的方法參考已知信息來恰當設計，並通過化學合成來製備，或者可以通過從生物材料製備含有期望核酸序列的基因，並使用設計用於擴增期望核酸序列的引物擴增它來製備。
本發明的檢測reps1蛋白的產品可基於使用抗體的已知方法來發揮其功能：例如，可以包括elisa、放射免疫測定法、免疫組織化學法、western印跡等。
本發明的檢測reps1蛋白的產品包括特異性結合reps1蛋白的抗體或其片段。可以使用任何結構、尺寸、免疫球蛋白類別、起源等的抗體或其片段，只要它結合靶蛋白質即可。本發明的檢測產品中包括的抗體或其片段可以是單克隆的或多克隆的。抗體片段指保留抗體對抗原的結合活性的抗體一部分(部分片段)或含有抗體一部分的肽。抗體片段可以包括f(ab′)2、fab′、fab、單鏈fv(scfv)、二硫化物鍵合的fv(dsfv)或其聚合物、二聚化v區(雙抗體)、或含有cdr的肽。本發明的檢測reps1蛋白的產品可以包括編碼抗體或編碼抗體片段的胺基酸序列的分離的核酸，包含該核酸的載體，和攜帶該載體的細胞。
抗體可以通過本領域技術人員公知的方法來獲得。例如，製備保留整個或部分靶蛋白質的多肽或整合編碼它們的多核苷酸的哺乳動物細胞表達載體作為抗原。使用抗原免疫動物後，從經過免疫的動物獲得免疫細胞並融合骨髓瘤細胞以獲得雜交瘤。然後從雜交瘤培養物收集抗體。最後可以通過使用被用作抗原的reps1蛋白或其部分對獲得的抗體實施抗原特異性純化來獲得針對reps1蛋白的單克隆抗體。可以如下製備多克隆抗體：用與上文相同的抗原免疫動物，從經過免疫的動物收集血液樣品，從血液中分離出血清，然後使用上述抗原對血清實施抗原特異性純化。可以通過用酶處理獲得的抗體或通過使用獲得的抗體的序列信息來獲得抗體片段。
標記物與抗體或其片段的結合可以通過本領域普遍知道的方法來實施。例如，可以如下螢光標記蛋白質或肽：用磷酸鹽緩衝液清洗蛋白質或肽，添加用dmso、緩衝劑、等準備的染料，然後混合溶液，再於室溫放置10分鐘。另外，標記可使用商品化的標記試劑盒，諸如生物素標記試劑盒，如生物素標記試劑盒-nh2、生物素標記試劑盒-sh(dojindolaboratories)；鹼性磷酸酶標記試劑盒諸如鹼性磷酸酶標記試劑盒-nh2、鹼性磷酸酶標記試劑盒-sh(dojindolaboratories)；過氧化物酶標記試劑盒諸如過氧化物酶標記試劑盒-nh2、過氧化物酶標記試劑盒-nh2(dojindolaboratories)；藻膽蛋白標記試劑盒諸如藻膽蛋白標記試劑盒-nh2、藻膽蛋白標記試劑盒-sh、b-藻紅蛋白標記試劑盒-nh2，b-藻紅蛋白標記試劑盒-sh、r-藻紅蛋白標記試劑盒-nh2、r-藻紅蛋白標記試劑盒sh(dojindolaboratories)；螢光標記試劑盒諸如螢光素標記試劑盒-nh2、hilytefluor(tm)555標記試劑盒-nh2、hilytefluor(tm)647標記試劑盒-nh2(dojindolaboratories)；及dylight547和dylight647(technochemicalcorp.)、zenon(tm)、alexafluor(tm)抗體標記試劑盒、qdot(tm)抗體標記試劑盒(invitrogencorporation)和ez-標記物蛋白質標記試劑盒(funakoshicorporation)。為了正確標記，可以使用適宜的儀器來檢測經過標記的抗體或其片段。
預測預後是指預測患者狀況的過程或結果，並不意味著能以100％的準確度預測患者狀況的過程或結果。預測預後是指確定某些過程或結果的可能性是否增加，而並不意味著通過與某些過程或結果不發生的情況比較來確定發生某些過程或結果的可能性。如本發明而言，本發明中reps1基因或reps1蛋白的水平降低的患者中，與不顯示該特徵的患者相比，更有可能觀察到特定過程或結果。
進一步，所述檢測reps1基因或reps1蛋白的產品可以是檢測reps1基因或reps1蛋白的試劑、也可以是包含所述試劑的試劑盒、晶片、試紙等，也可以是使用所述試劑的高通量測序平臺。
利用前面所述的檢測產品檢測兒童受試者樣本中的reps1基因或reps1蛋白的表達水平，與正常兒童相比，兒童受試者樣本中的reps1基因或reps1蛋白的表達水平降低，則診斷該兒童受試者為兒童i型糖尿病患者或該患有兒童i型糖尿病的兒童受試者的預後差。
作為依照本發明的檢測產品的樣本，可以使用例如自活檢受試者獲得的組織樣品或流體。樣本不受特別限制，只要它適於本發明的測定；例如，它可以包括組織、血液、血漿、血清、淋巴液、尿液、漿膜腔液、脊髓液、滑液、房水、淚液、唾液、或其級分或經過處理的材料。
在本發明的具體實施方案中，所述樣本來自兒童受試者的血液。
本發明還提供了一種診斷兒童i型糖尿病的工具，所述工具能夠檢測兒童受試者樣本中reps1基因或reps1蛋白的表達水平。所述工具包括能夠結合reps1基因的核酸或者能夠結合reps1蛋白的物質(例如抗體)。所述核酸能夠檢測reps1基因的表達水平；所述物質能夠檢測reps1蛋白的表達水平。
進一步，所述核酸和所述物質的性質同前面所述。
進一步，所述診斷兒童i型糖尿病的工具包括但不限於晶片、試劑盒、試紙、或高通量測序平臺；高通量測序平臺是一種特殊的診斷兒童i型糖尿病的工具，隨著高通量測序技術的發展，對一個人的基因表達譜的構建將成為十分便捷的工作。通過對比疾病患者和正常人群的基因表達譜，容易分析出哪個基因的異常與疾病相關。因此，在高通量測序中獲知reps1基因的異常與兒童i型糖尿病相關也屬於reps1基因的用途，同樣在本發明的保護範圍之內。
本發明還提供了一種預測兒童i型糖尿病預後的工具，所述工具能夠檢測兒童受試者樣本中reps1基因或reps1蛋白的表達水平，所述預測兒童i型糖尿病預後工具包括能夠結合reps1基因的核酸或者能夠結合reps1蛋白的物質(例如抗體)。所述核酸能夠檢測reps1基因的mrna水平；所述物質能夠檢測reps1蛋白的表達水平。
進一步，所述核酸和所述物質的性質同前面所述。
進一步，所述預測兒童i型糖尿病預後的工具包括但不限於晶片、試劑盒、試紙、或高通量測序平臺；高通量測序平臺是一種特殊的診斷工具，隨著高通量測序技術的發展，對一個人的基因表達譜的構建將成為十分便捷的工作。通過對比疾病患者和正常人群的基因表達譜，容易分析出哪個基因的異常與疾病相關。因此，在高通量測序中獲知reps1基因的異常與兒童i型糖尿病相關也屬於reps1基因的用途，同樣在本發明的保護範圍之內。
本發明的檢測產品、診斷工具中使用的抗reps1抗體或其片段所識別的胺基酸的數目沒有特別限制，只要抗體能夠結合reps1即可。當抗體作為治療藥物時，優選的是它能夠識別儘可能多的胺基酸，只要它能抑制reps1功能。抗體或其片段識別的胺基酸的數目是至少一個，更優選至少三個。抗體的免疫球蛋白類別不受限制，可以是igg、igm、iga、ige、igd或igy。
本發明的檢測產品、診斷工具中使用的抗reps1抗體的其他性質同前面所述。
進一步，所述受試者樣本可以使用例如自活檢受試者獲得的組織樣品或流體。樣本不受特別限制，只要它適於本發明的測定；例如，它可以包括組織、血液、血漿、血清、淋巴液、尿液、漿膜腔液、脊髓液、滑液、房水、淚液、唾液、或其級分或經過處理的材料。在本發明的具體實施方案中，所述樣本來自受試者的血液。
本發明還提供了一種診斷兒童i型糖尿病或預測兒童i型糖尿病預後的方法，所述方法包括如下步驟：
(1)獲取兒童受試者的樣品；
(2)檢測兒童受試者樣品中reps1基因或蛋白的表達水平；
(3)將測得的reps1基因或蛋白的表達水平與兒童受試者的患病與否關聯起來。
(4)與正常兒童相比，reps1基因或蛋白的表達水平降低，則該兒童受試者被診斷為兒童i型糖尿病，或判斷患有兒童i型糖尿病的兒童受試者預後差。
在本發明的上下文中，「診斷兒童i型糖尿病」既包括判斷兒童受試者是否已經患有兒童i型糖尿病、也包括判斷兒童受試者是否存在患有兒童i型糖尿病的風險。
本發明的優點和有益效果：
本發明發現了一種診斷兒童i型糖尿病以及預測兒童i型糖尿病患者預後的分子標誌物，使用該分子標誌物可以在兒童i型糖尿病發生的早期即可作為判斷，提高了患者的生存率。另外，通過預測患者的預後，本發明能夠提供有意義的信息來為患者決定治療方案策略。
附圖說明
圖1顯示利用qpcr檢測reps1基因在兒童i型糖尿病患者和正常兒童中的表達差異；
圖2顯示利用免疫印跡檢測reps1基因在兒童i型糖尿病患者和正常兒童中的表達差異。
具體的實施方式
下面結合附圖和實施例對本發明作進一步詳細的說明。以下實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如sambrook等人，分子克隆：實驗室手冊(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
實施例1篩選兒童i型糖尿病患者和正常兒童中差異表達的基因
1、臨床對象：內分泌科初次就診的兒童i型糖尿病(按who1999年糖尿病診斷標準)住院患者10例，其中男5例，女5例，年齡5-16歲；正常對照組8例，其中男3例，女5例皆為健康體檢者，無糖尿病家族史，並排除內分泌疾患及其他慢性疾病，年齡5-16歲，與糖尿病患兒性別、年齡無統計學差異。本研究經醫學倫理委員會備案並批准，入選患兒及健康對照兒童合法監護人均籤署臨床研究同意書。
2、血液總rna提取
使用博凌科為tripurelsreagent血液(血液樣本)rna抽提試劑進行血液總rna的提取。
基本步驟：
(1)按照3:1的體積比例加入tripurelsreagent和血液振蕩混勻；
(2)加入氯仿幫助有機相和水相分層；
(3)異丙醇沉澱rna；
(4)漂洗rna沉澱；
(5)rnase-freeh2o重新溶解rna沉澱。
3、rna樣品的質量分析
利用nanodrop2000對所提rna的濃度和純度進行檢測，瓊脂糖凝膠電泳檢測rna完整性，agilent2100測定rin值。單次建庫要求rna總量5μg，濃度≥200ng/μl，od260/280介於1.8～2.2之間。
3、高通量轉錄組測序
(1)rna-seq讀段定位
首先將低質量的讀段去除得到清潔讀段，然後利用tophatv1.3.1將清潔片段與ucsch.sapiens參考基因組(hg19)進行匹配，h.sapiensucschg19版的預先構建的索引從tophat主頁下載，並作為參考基因組，利用tophat與基因組匹配時，允許每個讀段(默認到20)有多個匹配位點，最多2次錯配。tophat根據外顯子區域和gt-ag剪切信號建立可能的剪切位點庫，根據這些剪切位點庫將沒有定位到基因組的讀段定位到基因組上。我們使用tophat方法的系統默認參數。
(2)轉錄豐度評估
匹配上的讀段文件通過cufflinksv1.0.3處理，cufflinksv1.0.3將rna-seq片段數目進行標準化計算轉錄本的相對豐度。fpkm值指的是每一百萬測序片段中匹配到特定基因1kb長的外顯子區域的片段數目。通過貝葉斯推理方法計算fpkm估計值的置信區間。cufflinks使用的參考的gtf注釋文件從ensembl資料庫下載(homo_sapiens.grch37.63.gtf)。
(3)差異表達基因的檢測
將下載的ensemblgtf文件和通過tophat匹配的原始文件傳輸到cuffdiff，cuffdiff使用原始的匹配文件重新估算gtf文件中列出的轉錄本的表達豐度，檢測差異表達。在cuffidff輸出中只有q值＜0.01，測試顯示成功的比較才被認為是差異表達。
6、結果
rna-seq結果顯示，與正常兒童與兒童i型糖尿病患者血液中存在差異表達基因共443個，其中，在兒童i型糖尿病患者血液中表達上調的基因有251個，表達下調的基因是192個。
實施例2qpcr實驗驗證兒童i型糖尿病患者和正常兒童中差異表達的基因
選擇實施例1篩選出的reps1基因進行大樣本驗證。
1、臨床對象：內分泌科初次就診的兒童i型糖尿病(按who1999年糖尿病診斷標準)住院患者10例，其中男5例，女5例，年齡5-16歲；正常對照組8例，其中男3例，女5例皆為健康體檢者，無糖尿病家族史，並排除內分泌疾患及其他慢性疾病，年齡5-16歲，與糖尿病患兒性別、年齡無統計學差異。本研究經醫學倫理委員會備案並批准，入選患兒及健康對照兒童合法監護人均籤署臨床研究同意書。
2、血液總rna提取
使用博凌科為tripurelsreagent血液(血液樣本)rna抽提試劑進行血液總rna的提取。
基本步驟：
(1)按照3:1的體積比例加入tripurelsreagent和血液振蕩混勻；
(2)加入氯仿幫助有機相和水相分層；
(3)異丙醇沉澱rna；
(4)漂洗rna沉澱；
(5)rnase-freeh2o重新溶解rna沉澱。
3、逆轉錄
用逆轉錄緩衝液對lμg總rna進行逆轉錄合成cdna。採用25μl反應體系，每個樣品取1μg總rna作為模板rna，在pcr管中分別加入以下組分：depc水，5×逆轉錄緩衝液，10mmol/ldntp，0.1mmol/ldtt，30μmmol/loligodt,200u/μlm-mlv，模板rna。42℃孵育1h，72℃10min，短暫離心。
4、qpcr
採用25μl反應體系，每個樣本設置3個平行管，所有擴增反應均重複三次以上以保證結果的可靠性。
配製以下反應體系：sybrgreen聚合酶鏈式反應體系12.5μl，正向引物(5μm/μl)1μl，反向引物(5μm/μl)1μl，模板cdna2.0μl，無酶水8.5μl。
引物序列如下：
擴增reps1基因的正向引物序列為5』-gcatcacaaccttctatt-3』(seqidno.1)，反向引物序列為5』-gcaattcgctattcaatc-3』(seqidno.2)；
擴增gapdh基因的正向引物序列為5』-tttaactctggtaaagtggatat-3』(seqidno.3)，反向引物序列為5』-ggtggaatcatattggaaca-3』(seqidno.4)。
擴增程序：95℃10min，(95℃5s，60℃60s)*45個循環。以sybr
green作為螢光標記物，在lightcycler螢光實時定量pcr儀上進行pcr反應，通過融解曲線分析和電泳確定目的條帶，δδct法進行相對定量。
5、結果
結果如圖1所示，與正常兒童相比，兒童i型糖尿病患者血液中reps1基因的mrna水平顯著下降，差異具有統計學意義(p<0.05)。
實施例3免疫印跡實驗驗證兒童i型糖尿病患者和正常兒童中差異表達基因的表達產物
1、臨床對象：同實施例2。
2、單核細胞分離
兒童i型糖尿病患者和正常兒童取靜脈血10ml，注入盛肝素的無菌小瓶中，加蓋後立即輕輕搖勻。用無菌吸管加入等體積的hbss(nacl8.0g，na2hpo40.132g，kh2po40.06g，kcl0.4g，酚紅1ml，nahco30.35g，d-葡萄糖1.0g，溶於1000ml雙蒸水)，以降低紅細胞的凝聚。吸取8ml淋巴細胞分層液置50ml離心管中，將稀釋血液沿管壁緩慢加入，保持界面清楚，勿使兩者相混，在20℃2000r/min離心30min，小心吸取分層液與血漿交接部位混濁的灰白色層，即淋巴細胞層，加入另一支離心管中，用5倍體積的hbss洗滌2次，依次以2000r/min、1500r/min在室溫下離心10min，以便去除大部分混雜的血小板，用10ml雙蒸水與細胞團塊混合1min，使殘餘紅細胞裂解，然後迅速加入等量1.8％nacl溶液，2000r/min離心，去上清，經細胞計數後用hbss溶液調整細胞至1×106個/ml備用。
3、單核細胞總蛋白質提取
將上述實驗所得細胞懸液(濃度為1×106個/ml)室溫1000r/min離心10min，棄上清後加入100μl裂解緩衝液，4℃震蕩1h，用超聲波儀破碎細胞，每次10s，共10次，於4℃12000r/min離心1h；取上清用brandford法定量蛋白，分裝成2.5μg/μl，-80℃冰箱保存備用。
4、westernblot檢測
細胞總蛋白用brandford法定量，取適量與樣品緩衝液混合煮沸5min，冷卻5min；取30pg蛋白上樣到製備好的15％聚丙烯醯胺凝膠，進行電泳，開始設為80v恆壓，看見marker後增加至120v；將電泳後的膠取出，使用bio.rad半乾轉印系統於100v轉移50min；轉膜完畢後，用1xpbs洗一次，浸入封閉液，40c過夜；倒掉封閉液，加入western洗滌液洗滌5-10min，加入一抗搖床室溫雜交2h；按照適當比例用western二抗稀釋液稀釋於封閉緩衝液中，孵育60min；洗膜液洗3次，每次10min；使用ecl試劑顯影、定影檢測蛋白表達。
5、統計學處理
將蛋白條帶的灰度值使用imagej軟體進行分析，以β-actin為內參，將目的白條帶的灰度值進行歸一化處理。結果數據都是以平均值±標準差的方式來表示，採用spss13.0統計軟體來進行統計分析的，兩者之間的差異採用t檢驗，認為當p<0.05時具有統計學意義。
6、結果
結果如圖2所示，與正常兒童相比，兒童i型糖尿病患者血液中reps1蛋白含量降低，差異具有統計學意義(p<0.05)。
上述實施例的說明只是用於理解本發明的方法及其核心思想。應當指出，對於本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以對本發明進行若干改進和修飾，這些改進和修飾也將落入本發明權利要求的保護範圍內。
sequencelisting
北京泱深生物信息技術有限公司
reps1在製備兒童i型糖尿病診斷產品中的用途
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