一種梅花鹿朊蛋白免疫學檢測方法

2023-06-03 20:08:01

專利名稱：一種梅花鹿朊蛋白免疫學檢測方法
技術領域：
本發明屬生物檢驗檢疫領域，通過構建重組蛋白，利用重組蛋白免疫動物製備抗體，建立一種梅花鹿朊蛋白雙抗夾心ELISA檢測方法。
背景技術：
朊病毒(Prion)是一種由蛋白質組成而不含有核酸等遺傳物質的病毒。朊病毒 (PrPsc)是生物體內普遍存在的正常細胞型朊蛋白(PrPe),當它由於某種原因結構發生變化，在細胞內發生錯誤摺疊並可以抵抗新陳代謝，進而聚集擴增，最後引起細胞死亡，最終引起宿主發生神經退行性病變，導致不可逆轉性死亡。朊病毒病作為一種新型疾病，由於它病原的特異性，傳統的消毒措施不能破壞它的傳染性，正常的食物加工過程中不能有效滅活朊病毒，因此該病對食品安全造成巨大威脅。當狂牛症在歐洲爆發時，英法等國屠宰牛群達到100萬隻以上，造成巨大的經濟損失， 同時許多人因為使用了病牛肉製品可能在今後的幾十年後感染朊病毒病。鹿慢性消耗性疾病(Chronic wasting disease, CWD)和狂牛症(BSE)，羊癢疫 (Scrapy)，人克雅氏病(CJD) —樣都屬於朊病毒病。鹿慢性消耗性疾病主要感染北美麋鹿、 黑尾鹿、白尾鹿等，廣泛分布於北美，主要存在於加拿大和美國。近幾年，亞洲國家韓國在引進來自加拿大的鹿體內發現朊病毒，後證實病鹿感染鹿慢性消耗性疾病。梅花鹿是我國重要經濟動物，梅花鹿製品品種豐富，具有較高的藥用價值和經濟價值。由於IM3se可以吸引ft~Pe，並將其轉化成IM3se導致疾病的傳播，而且朊蛋白在各個物種中均高度保守，梅花鹿朊蛋白和北美麋鹿、黑尾鹿、白尾鹿胺基酸同源性則高達93%。一旦該病在我國出現，必將對我國的財政收入、食品安全造成巨大的危害。當前對於朊病毒病的檢測主要是利用PrPse抗蛋白酶消化的特點，對動物組織勻漿進行消化前後的對比，既可以判斷該病原是否存在。檢測手段主要應用Western blot和免疫組化的方法。這兩種方法雖然準確度高，但對儀器和環境的要求很高，需要在實驗室進行。

發明內容
本發明提供一種梅花鹿朊蛋白免疫學檢測方法，本發明採取的技術方案是包括下列步驟
(一)、鼠抗重組朊蛋白PrFes單克隆抗體的製備如下 (a)、重組朊蛋白PrPres的製備
(1)製備重組朊蛋白PrP"s基因的人工合成引物為 Fff: GGG AAT TCC ATA TGA AGA AGC GAC CAA AAC CTG ； RV: CGGATC CGA ACT TGC CCC TCG TTG GTA ；
(2)提取梅花鹿總基因組DNA為模板，進行PCR擴增，獲得目的基因，克隆至 PMD-18T-Simp 1 e載體上，將PrFes基因片段插入表達載體pET_Trx中構建重組表達質粒，pET-Trx- PrPres ；將PrFes基因片段插入表達載體ρΕΤ-His中構建重組表達質粒， pET-His- PrPres ；
(3)將重組表達質粒ρΕΤ- χ-PrPlres和pET-His- PrPlres轉入BL21 (DE3)中進行表達， 得到兩種重組融合朊蛋白I^rFes-Trx和PrFes-His,表達條件為陽性克隆培養物以1%接種於LB培養基(50mg/L抗生素)，37°C劇烈搖蕩培養至0D600=0. 6時加入終濃度為lmmol/L 的IPTG進行誘導，220r/min劇烈搖培4h，離心收集菌體，菌體重新PBS懸浮並經超聲波裂解，離心分別收集上清和沉澱，通過SDS-PAGE分別檢測全菌、上清和沉澱，發現ft~Pres-Trx 和PrFes-His分別以包涵體的形式大量表達；
(4)切膠純化方法，取500μ L包涵體提取液處理後不插樣品梳直接上樣，按常規方法進行SDS-PAGE，將膠浸入2 mol/L NaAc溶液中在搖床上染色1 h，將染成銀白色的含目的蛋白膠切割下來，置於蒸餾水中在脫色搖床上搖20 min,脫去NaAc，之後將切下來的膠放在密封透析袋內，以電泳的方法使目的蛋白游離出來，將透析袋中的凝膠取出後， 用PEG20000進行濃縮，做透析去除小分子，經SDS-PAGE和flfestern blot鑑定後分裝後放入-80度冰箱備用；
(b)鼠抗重組朊蛋白PrPres單克隆抗體的製備
(1)動物免疫
以復性的重組朊蛋白PrPres-Trx免疫8周齡Balb/c雌性小鼠，100 μ g/只，皮下分點注射，首次免疫用弗氏完全佐劑(1:1)乳化抗原，間隔3周後，採用弗氏不完全佐劑 (1:1)乳化抗原，進行第2、3次免疫，最後加強免疫時，直接用免疫原進行腹腔注射；
(2)間接ELISA篩選方法以及陽性雜交瘤判斷標準的建立
分別以重組成熟朊蛋白PrPres-His和空載體菌體蛋白pET-His包被酶標板孔，以測定PrPres-Trx免疫血清效價，以未免疫的小鼠血清和SP2/0細胞上清為陰性對照，分別測定 492 nm光吸收值，經過多次ELISA檢測，確定最佳工作條件為抗原的最適合包被濃度為 25μ g/ml，4°C包被過夜；陽性和陰性血清最佳工作濃度為1:800，37°C孵育Ih ； HRP二抗最佳工作濃度為1:4000，37°C孵育lh，以此建立了間接ELISA篩選方法；
(3)陽性雜交瘤細胞株的建立和穩定性檢測
取加強免疫3d後的小鼠脾細胞與SP2/0細胞以5 1在PEG1500的作用下融合， 以建立的間接ELISA方法篩選出陽性雜交瘤細胞株，通過多次克隆化和篩選後，獲得一株能分泌單克隆抗體的為「3C6」，2011年12月7日其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的登記入冊編號是CGMCC No. 5556，分類命名產朊蛋白單克隆抗體細胞株， 並用間接ELISA法檢測連續培養30代以及凍存5個月復甦後的陽性雜交瘤細胞的上清液，確定其分泌抗體的穩定性；
(4)單克隆抗體生物學特性的鑑定
按試劑盒說明書操作，經鑑定該單克隆抗體為IgG2b型，以10%的梅花鹿腦勻漿包被 Elisa板，以3C6純化後單抗(1 μ g/ml)檢測，同時以SP2/0細胞上清和鼠陰性血清為陰性對照，在492nm下讀值，3C6反應孔與陰性孔P/N在1觀00倍稀釋條件下仍大於2，說明該單克隆抗體具有識別天然結構梅花鹿朊蛋白的能力；
(二)、兔抗重組朊蛋白PrFes-HiS多克隆抗體的製備
用重組朊蛋白I^rPres-HiS免疫雌性家兔，皮下3點注射，免疫劑量Img/只/次，間隔14d免疫，共免疫3次，第1次採用弗氏完全佐劑，第2、3次採用弗氏不完全佐劑，第3次免疫後 14天心臟放血，37°C放置1小時後，4°C過夜，次日3000轉離心15分鐘，去上清，辛酸-硫酸銨法純化兔多抗血清，純化後的IgG用PBS透析3次，用BCA法測定蛋白濃度，_80°C凍存； (三)梅花鹿朊蛋白的檢測步驟如下
(1)加入100μL濃度為5μ g/ml兔抗重組梅花鹿朊蛋白PrPres-His多克隆抗體包被 ELISA反應板，4°C孵育12小時；
(2)取梅花鹿腦組織0.5g,加入4. 5ml組織蛋白裂解液，製備成10%組織勻漿。每1毫升組織勻漿加入IOmg蛋白酶K，37°C孵育1小時；
(3)取出包被後的ELISA板用TBST洗5次，每次5分鐘；
(4)每孔加入300μ L封閉液:3%BSA + 3%明膠，37°C孵育2小時；
(5)用TBST洗5次，每次5分鐘；
(6)每孔加入100μ L待檢組織勻漿，37°C孵育1小時；
(7)用TBST洗5次，每次5分鐘;
(8)每孔加入100μ L濃度為1. 25 μ g/ml辣根過氧化物酶標記的鼠抗重組梅花鹿朊蛋白單克隆抗體3C6，37°C孵育1小時；
(9)用TBST洗5次，每次5分鐘；
(10)加入底物，37°C避光孵育10分鐘；
(11)每孔加入50μ L 2M硫酸終止反應；
(12)讀板，記錄OD值;
(13)根據標準曲線，計算組織勻漿中梅花鹿朊蛋白的含量。本發明受到了國家自然科學基金面上項目(30871956)的資助。本發明採取的包被抗體為兔抗梅花鹿重組朊蛋白PrFes-His多克隆抗體、檢測抗體為鼠抗梅花鹿重組朊蛋白I^rPres單克隆抗體，所用的Elisa的方式具有準確度高的優點， 同時所受環境的限制較少，本發明可應用於製備梅花鹿朊蛋白雙抗夾心ELISA檢測試劑
品.ο


圖Ia是本發明重組表達載體PET-Trx構建圖； 圖Ib是本發明重組表達載體PET-His構建圖2是PrP-Trx表達圖，橢圓標記處為目的蛋白，目的蛋白大小為2. SKd ； 圖3是PrP-Trx純化圖，1和2均為切膠純化後的目的蛋白； 圖4是ft~P-HIS表達圖，橢圓標記處為目的蛋白； 圖5是PrP-HIS純化圖，1和2均為切膠純化後的目的蛋白； 圖6是免疫後血清效價圖，在51200X稀釋時陽性血清和陰性血清的P/N仍超過2. 1 ； 圖7是利用單抗3C6檢測梅花鹿腦，在Western blot中可見特異性條帶； 圖8是免疫血清效價圖，在51200倍稀釋時P/N仍大於2. 1 ； 圖 9 是標準曲線圖，y=0. ΟΟΟδχ+Ο. 5434, R2=O. 9912。
具體實施方式
實施例1重組朊蛋白PrFes的製備
(1)製備重組朊蛋白PrFes基因的人工合成引物為 Fff: GGG AAT TCC ATA TGA AGA AGC GAC CAA AAC CTG RV: CGGATC CGA ACT TGC CCC TCG TTG GTA ；
(2)提取梅花鹿總基因組DNA為模板，進行PCR擴增，擴增條件為預變性95°C2分鐘，變性93°C 50秒，退火56°C 45秒，延伸72°C 1分鐘，30個循環，最後72°C延伸10分鐘，獲得目的基因，克隆至PMD-IST-Simple載體上，酶切鑑定，目的基因核苷酸序列見SEQ ID UfI^rPlres基因片段插入表達載體pET-TRX和PET-HIS中構建重組表達質粒，pET_TRX_ PrPres, pET-HIS-PrPres ；
(3)將重組表達質粒pET-TrS-PrPlres和PET-His-PrPlres轉化BL21(DE3)中進行表達， 得到重組融合朊蛋白PrFes-Trx和PrFes-His, PrPres-Trx作為免疫原免疫動物，PrPres-His 包被ELISA板後作為檢測源用來篩選單抗。實施例2重組朊蛋白PrFes的大量製備和切膠回收
表達條件為陽性克隆培養物以1%接種於LB培養基(50mg/L抗生素)。37°C劇烈搖蕩培養至0D600=0. 6時，加入終濃度為lmmol/L的IPTG進行誘導，220r/min，劇烈搖培4h。離心收集菌體，菌體重新PBS懸浮並經超聲波裂解，離心分別收集上清和沉澱，通過SDS-PAGE 分別檢測全菌、上清和沉澱，發現I^rFes-Trx和PrFes-His分別以包涵體的形式大量表達。切膠純化方法，取500 μ L包涵體提取液處理後不插樣品梳直接上樣，按常規方法進行SDS-PAGE。將膠浸入2 mol/L NaAc溶液中在搖床上染色1 h，將染成銀白色的含目的蛋白膠切割下來，置於蒸餾水中在脫色搖床上搖20 min，脫去NaAc。之後將切下來的膠放在密封透析袋內，之後以電泳的方法使目的蛋白游離出來，將透析袋中的凝膠取出後， 用PEG20000進行濃縮，然後做透析去除小分子。經SDS-PAGE和flfestern blot鑑定後，分裝後放入-80度冰箱備用。實施例3動物免疫
以復性的重組朊蛋白PrPres-Trx免疫8周齡Balb/c雌性小鼠，100 μ g/只，皮下分點注射，首次免疫用弗氏完全佐劑(1:1)乳化抗原，間隔3周後，採用弗氏不完全佐劑 (1:1)乳化抗原，進行第2、3次免疫，最後加強免疫時，直接用免疫原進行腹腔注射。實施例4間接ELISA的建立
分別以重組成熟朊蛋白PrPres-His和空載體菌體蛋白pET-His包被酶標板孔，以測定PrPres-Trx免疫血清效價，以未免疫的小鼠血清和SP2/0細胞上清為陰性對照，分別測定 492 nm光吸收值，經過多次ELISA檢測，確定最佳工作條件為抗原的最適合包被濃度為 25μ g/ml，4°C包被過夜；陽性和陰性血清最佳工作濃度為1:800，37°C孵育Ih ； HRP二抗最佳工作濃度為1:4000，37°C孵育lh，以此建立了間接ELISA篩選方法。實施例5陽性雜交瘤細胞株的建立和穩定性檢測
取加強免疫3d後的小鼠脾細胞與SP2/0細胞以5:1在PEG1500的作用下融合，以建立的間接ELISA方法篩選出陽性雜交瘤細胞株，通過多次克隆化和篩選後，獲得一株能分泌的抗體為「3C6」，2011年12月7日其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的登記入冊編號是CGMCC No. 5556，分類命名產朊蛋白單克隆抗體細胞株，並用間接 ELISA法檢測連續培養30代以及凍存5個月復甦後的陽性雜交瘤細胞的上清液，確定其分泌單克隆抗體的穩定性。實施例6單抗生物學特性的鑑定
按試劑盒說明書操作，鑑定單克隆抗體為IgG2b型，以10%的梅花鹿腦勻漿包被Elisa 板，以純化後單抗(1 μ g/ml)檢測，同時以SP2/0細胞上清和鼠陰性血清為陰性對照。在 492nm下讀值，該單克隆抗體反應孔與陰性孔P/N在1觀00倍稀釋條件下仍大於2，說明該單克隆抗體具有識別天然結構梅花鹿朊蛋白的能力。實施例7兔抗重組朊蛋白PrFes多克隆抗體的製備
用重組梅花鹿朊蛋白PrFe-Trx所得重組梅花鹿朊蛋白免疫雌性家兔，皮下3點注射， 免疫劑量Img/只/次，間隔14d免疫，共免疫3次，第1次採用弗氏完全佐劑，第2、3次採用弗氏不完全佐劑，第3次免疫後14天心臟放血，37 0C放置1小時後，4°C過夜，次日3000 轉離心15分鐘，卻上清，辛酸-硫酸銨法純化兔多抗血清，純化後的IgG用PBS透析3次， 用BCA法測定蛋白濃度，-80°C凍存。實施例8兔抗重組朊蛋白PrFes多克隆抗體的純化採用辛酸一硫酸銨法，操作步驟如下
(1)將血清用濾紙過濾去沉澱和脂質，濾液用4倍體積60mmol/L醋酸緩衝液(pH4. 0) 稀釋後，用NaOH調pH值至4. 5 ；
(2)逐滴加入正辛酸(終濃度75μ L/mL)，室溫下攪拌30分鐘後，以6000 8000 r/ min離心30分鐘，收集上清液；
(3)上清液經濾紙過濾2次，將濾液與10XPBS(0.1 mol/L, pH7. 4)按10 1比例混合，調PH至7. 4，置冰浴冷至4°C ；
(4)每毫升上述混合液加0.277g固體硫酸銨，4°C攪拌30分鐘，以4000 6000 r/ min離心15-20分鐘，將沉澱溶於少量PBS，在2000倍體積的PBS中透析，透析結束後，酶標儀測定蛋白濃度並分裝、凍存。實施例9兔抗重組朊蛋白PrFes多克隆抗體最佳稀釋度和單抗最適工作濃度的確定
採用棋盤方陣滴定法，同時確定多抗最佳包被稀釋度和單抗的最適工作濃度，具體方法如下以pH9. 6的碳酸鹽緩衝液將兔多克隆抗體稀釋，濃度分別為20 μ g/ml、10 μ g/ml、 5 μ g/ml,2. 5 μ g/mlU. 25 μ g/ml,0. 625 μ g/ml,0. 3125 μ g/ml 包被酶標板，4°C 12 小時。洗滌後封閉液封閉2小時。洗滌後加入1 μ g/mL PrPres-Trx溶液，以PBS作為陰性對照，37°C 溫育1小時。洗滌後加入單抗3C6，稀釋倍數分別為5. 0 μ g/mL，2. 5 μ g/mL，2. 0 μ g/mL， 1. 25 μ g/mL, 0. 625 μ g/mL, 0. 3125 μ g/mL, 0. 1 μ g/mL,以商品化朊蛋白單克隆抗體 SAF31 (Pierce公司)作為陽性對照，然後分別進行檢測，根據P/N值結果確定最佳多抗包被濃度為5 μ g/ml稀釋和單抗最適工作濃度為1. 25 μ g/mL。實施例10包被多抗和單抗作用條件的確定
以最適多抗包被稀釋度包被酶標板，分成4組，第1組4°C包被M小時；第2組4°C 包被12小時；第3組37°C包被2小時後4°C包被12小時；第4組37°C包被2小時；之後將包被好的酶標板洗滌三遍，洗滌後，37°C封閉2小時，再次洗滌，加入1 μ g/mL PrPres-Trx 溶液，37°C孵育1小時，洗滌，以PBS溶液作為陰性對照，加入單抗3C6，37°C分別作用2小時、1.5小時、1小時和30分鐘，37°C孵育1小時，然後分別進行ELISA檢測，根據P/N值結果確定最佳多抗包被條件為4°C包被12小時，最佳單抗作用時間為37°C分別作用1小時。實施例11封閉液的確定
用最佳的多抗包被稀釋度和包被條件包被酶標板，洗滌後，分成6組。第一組用3%BSA 封閉；第二組用3%明膠封閉；第三組用10%脫脂乳封閉；第四組3%酪蛋白封閉 』第五組3%BSA + 3%明膠，然後進行ELISA試驗檢測，根據P/N值結果確定最佳封閉液為第五組 3%BSA + 3% 明膠。實施例12封閉時間的確定
用最佳的多抗包被稀釋度和包被條件包被酶標板，洗滌後，加入之前中選定的封閉液， 200 μ L/孔，分成5組。第一組37°C封閉4小時；第二組37°C封閉2小時；第三組4°C 12 小時；第四組37°C 4小時後4°C 12小時；第五組37°C 2小時，4°C小時。然後按步驟進行 ELISA試驗檢測，根據P/N值結果確定最佳封閉時間為37°C封閉2小時。實施例13標準曲線的製作
按以上優化的實驗最佳條件，取 8. 0,16. 0,32. 0,64. 0,128. 0,256. 0,512. 0,1024. 0 ng/mL的朊蛋白商品化標準品)標準液，每個濃度設兩個平行孔，按照W010]制定的雙抗夾心ELISA試驗程序進行檢測，以在0D492nm下測得的值與陰性值對照比值小於2. 1 時，最低朊蛋白PrP標準品濃度設為最低檢測限，對測定數據進行回歸分析，得出回歸方程和標準曲線，回歸方程為y=0. ΟΟΟδχ+Ο. 5434，R2=O. 9912，其中X=PrP (稀釋濃度)，y軸是OD 值，最低檢測限為25ng/ml。實施例14 一種梅花鹿朊蛋白雙抗夾心ELISA檢測方法的使用
(1)加入ΙΟΟμL濃度為5μ g/ml兔抗重組梅花鹿朊蛋白PrPres-His多克隆抗體包被 ELISA反應板，4°C孵育12小時；
(2)取梅花鹿腦組織0.5g,加入4. 5ml組織蛋白裂解液，製備成10%組織勻漿。每1毫升組織勻漿加入IOmg蛋白酶K，37°C孵育1小時；
(3)取出包被後的ELISA板用TBST洗5次，每次5分鐘；
(4)每孔加入300μ L封閉液:3%BSA + 3%明膠，37°C孵育2小時；
(5)用TBST洗5次，每次5分鐘;
(6)每孔加入100μ L待檢組織勻漿，37°C孵育1小時；
(7)用TBST洗5次，每次5分鐘;
(8)每孔加入100μ L濃度為1. 25 μ g/ml辣根過氧化物酶標記的鼠抗重組梅花鹿朊蛋白單克隆抗體3C6，37°C孵育1小時；
(9)用TBST洗5次，每次5分鐘；
(10)加入底物，37°C避光孵育10分鐘；
(11)每孔加入50μ L 2M硫酸終止反應；
(12)讀板，記錄OD值;
(13)根據標準曲線，計算組織勻漿中梅花鹿朊蛋白的含量。
權利要求
1. 一種梅花鹿朊蛋白免疫學檢測方法，其特下在於包括下列步驟(一)、鼠抗重組朊蛋白PrFes單克隆抗體的製備如下(a)、重組朊蛋白PrPres的製備(1)製備重組朊蛋白PrP"s基因的人工合成引物為Fff: GGG AAT TCC ATA TGA AGA AGC GAC CAA AAC CTG ； RV: CGGATC CGA ACT TGC CCC TCG TTG GTA ；(2)提取梅花鹿總基因組DNA為模板，進行PCR擴增，獲得目的基因，克隆至 PMD-18T-Simp 1 e載體上，將PrFes基因片段插入表達載體pET_Trx中構建重組表達質粒，pET-Trx- PrPres ；將PrFes基因片段插入表達載體ρΕΤ-His中構建重組表達質粒， pET-His- PrPres ；(3)將重組表達質粒ρΕΤ- χ-PrPlres和pET-His- PrPlres轉入BL21 (DE3)中進行表達， 得到兩種重組融合朊蛋白I^rFes-Trx和PrFes-His,表達條件為陽性克隆培養物以1%接種於LB培養基(50mg/L抗生素)，37°C劇烈搖蕩培養至0D600=0. 6時加入終濃度為lmmol/L 的IPTG進行誘導，220r/min劇烈搖培4h，離心收集菌體，菌體重新PBS懸浮並經超聲波裂解，離心分別收集上清和沉澱，通過SDS-PAGE分別檢測全菌、上清和沉澱，發現ft~Pres-Trx 和PrFes-His分別以包涵體的形式大量表達；(4)切膠純化方法，取500μ L包涵體提取液處理後不插樣品梳直接上樣，按常規方法進行SDS-PAGE，將膠浸入2 mol/L NaAc溶液中在搖床上染色1 h，將染成銀白色的含目的蛋白膠切割下來，置於蒸餾水中在脫色搖床上搖20 min,脫去NaAc，之後將切下來的膠放在密封透析袋內，以電泳的方法使目的蛋白游離出來，將透析袋中的凝膠取出後， 用PEG20000進行濃縮，做透析去除小分子，經SDS-PAGE和flfestern blot鑑定後分裝後放入-80度冰箱備用；(b)鼠抗重組朊蛋白PrPres單克隆抗體的製備(1)動物免疫以復性的重組朊蛋白PrPres-Trx免疫8周齡Balb/c雌性小鼠，100 μ g/只，皮下分點注射，首次免疫用弗氏完全佐劑(1:1)乳化抗原，間隔3周後，採用弗氏不完全佐劑 (1:1)乳化抗原，進行第2、3次免疫，最後加強免疫時，直接用免疫原進行腹腔注射；(2)間接ELISA篩選方法以及陽性雜交瘤判斷標準的建立分別以重組成熟朊蛋白PrPres-His和空載體菌體蛋白pET-His包被酶標板孔，以測定PrPres-Trx免疫血清效價，以未免疫的小鼠血清和SP2/0細胞上清為陰性對照，分別測定 492 nm光吸收值，經過多次ELISA檢測，確定最佳工作條件為抗原的最適合包被濃度為 25μ g/ml，4°C包被過夜；陽性和陰性血清最佳工作濃度為1:800，37°C孵育Ih ； HRP二抗最佳工作濃度為1:4000，37°C孵育lh，以此建立了間接ELISA篩選方法；(3)陽性雜交瘤細胞株的建立和穩定性檢測取加強免疫3d後的小鼠脾細胞與SP2/0細胞以5 1在PEG1500的作用下融合， 以建立的間接ELISA方法篩選出陽性雜交瘤細胞株，通過多次克隆化和篩選後，獲得一株能分泌單克隆抗體的為「3C6」，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的登記入冊編號是CGMCC No. 5556，分類命名產朊蛋白單克隆抗體細胞株，並用間接ELISA法檢測連續培養30代以及凍存5個月復甦後的陽性雜交瘤細胞的上清液，確定其分泌抗體的穩定性；(4)單克隆抗體生物學特性的鑑定按試劑盒說明書操作，經鑑定該單克隆抗體為IgG2b型，以10%的梅花鹿腦勻漿包被 Elisa板，以3C6純化後單抗(1 μ g/ml)檢測，同時以SP2/0細胞上清和鼠陰性血清為陰性對照，在492nm下讀值，3C6反應孔與陰性孔P/N在1觀00倍稀釋條件下仍大於2，說明該單克隆抗體具有識別天然結構梅花鹿朊蛋白的能力；(二)、兔抗重組朊蛋白PrFes-HiS多克隆抗體的製備用重組朊蛋白I^rPres-HiS免疫雌性家兔，皮下3點注射，免疫劑量Img/只/次，間隔14d 免疫，共免疫3次，第1次採用弗氏完全佐劑，第2、3次採用弗氏不完全佐劑，第3次免疫後 14天心臟放血，37°C放置1小時後，4°C過夜，次日3000轉離心15分鐘，去上清，辛酸-硫酸銨法純化兔多抗血清，純化後的IgG用PBS透析3次，用BCA法測定蛋白濃度，_80°C凍存；(三)梅花鹿朊蛋白的檢測步驟如下(1)加入100μ L濃度為5 μ g/ml兔抗重組梅花鹿朊蛋白PrFes-His多克隆抗體包被 ELISA反應板，4°C孵育12小時；(2)取梅花鹿腦組織0.5g,加入4. 5ml組織蛋白裂解液，製備成10%組織勻漿，每1毫升組織勻漿加入IOmg蛋白酶K，37°C孵育1小時；(3)取出包被後的ELISA板用TBST洗5次，每次5分鐘；(4)每孔加入300μ L封閉液3%BSA + 3%明膠，37°C孵育2小時；(5)用TBST洗5次，每次5分鐘；(6)每孔加入100μ L待檢組織勻漿，37°C孵育1小時；(7)用TBST洗5次，每次5分鐘；(8)每孔加入100μ L濃度為1. 25 μ g/ml辣根過氧化物酶標記的鼠抗重組梅花鹿朊蛋白單克隆抗體3C6，37°C孵育1小時；(9)用TBST洗5次，每次5分鐘；(10)加入底物，37°C避光孵育10分鐘；(11)每孔加入50μ L 2M硫酸終止反應；(12)讀板，記錄OD值;(13)根據標準曲線，計算組織勻漿中梅花鹿朊蛋白的含量。
全文摘要
本發明涉及一種梅花鹿朊蛋白免疫學檢測方法，屬於生物檢驗檢疫領域。製備鼠抗重組朊蛋白PrPres單克隆抗體、兔抗重組朊蛋白PrPres-His多克隆抗體，採取的包被抗體為兔抗梅花鹿重組朊蛋白PrPres-His多克隆抗體、檢測抗體為鼠抗梅花鹿重組朊蛋白PrPres單克隆抗體，所用的Elisa的方式具有準確度高的優點，同時所受環境的限制較少，本發明可應用於製備梅花鹿朊蛋白雙抗夾心ELISA檢測試劑盒。
文檔編號G01N33/577GK102565410SQ201210009078
公開日2012年7月11日 申請日期2012年1月12日 優先權日2012年1月12日
發明者任洪林, 劉 東, 盧士英, 周玉, 宋傑, 張茂林, 李兆輝, 李巖松, 柳增善 申請人:吉林大學