解澱粉芽孢桿菌和微生物製劑及其製備方法

2023-06-03 06:08:01 1

專利名稱：：解澱粉芽孢桿菌和微生物製劑及其製備方法
技術領域：
：本發明涉及生物防治領域，尤其涉及一種新的解澱粉芽孢桿菌以及使用該芽孢桿菌製備的微生物製劑和方法。
背景技術：
：眾所周知，由於微生物農藥的技術特徵和發展方向與人類未來的生產方式、食品安全、營養健康、生態平衡和生物多樣性都具有良好的相融性，加上以現代發酵工程和生物技術為基礎的微生物工業化生產技術體系日趨完善，微生物農藥的研究開發已引起了研究人員廣泛的關注和重視。利用植株上附生的或根際土壤中的拮抗細菌或其代謝產物調控有害微生物的平衡可達到控病保產的目的，也是植物病害生物防治的重要而有效的途徑，而篩選高效和活性穩定的拮抗菌株則是保證生物防治獲得成功的先決條件。芽孢桿菌(Ba"7/"s^p.)是自然界廣泛存在的一類細菌，其中的一些菌株可以產生桿菌肽、大環脂、環脂和類噬菌體顆粒等十幾種抗菌物質，在植物病害生物防治中有著廣泛的應用前景。同時，芽孢桿菌為革蘭氏陽性細菌，可以形成芽孢，細胞壁不含內毒素，除個別種外絕大多數對人畜無毒，因此具有很強的環境適應性和環境友好性。微生物農藥與化學農藥市場相比是個新興的產業，發展微生物農藥在我國具有巨大的潛在市場，新型微生物農藥的研究成果轉讓市場潛力相當可觀，並將推進傳統農藥產業結構調整和技術提升，獲得巨大的規模效益，為現代農業生產和生態環境的可持續發展，為農業等相關產業結構的調整提供重要的技術保障。
發明內容本發明要解決的技術問題是提供一種新的抑菌譜廣、抑菌效果好的芽孢桿菌菌種(30"7/10附>^0//^^/^^";0，還提供了一種高效、無毒、安全的防治植物病害的微生物製劑及其低成本的製備方法。為解決上述技術問題，本發明採用的技術方案是一種解澱粉芽孢桿菌(5acz7/wsawy/o/z々we/ac/era)YN-l，其保藏編號為CGMCCNO.2328。一種以上述解澱粉芽孢桿菌製備的微生物製劑，以重量份計，該微生物製劑含有解澱粉芽孢桿菌YN-lCGMCCNO.2328發酵液8295份，表面活性劑28份，防腐劑14份。所述微生物製劑還含有抗凍劑26份。所述解澱粉芽孢桿菌發酵液是通過如下方法製得將所述解澱粉芽孢桿菌YN-1接種於培養液，發酵培養至少36小時，將發酵液過濾，滅菌，再將其濃縮至原來體積的4060%後即成；所述培養液中含有葡萄糖812g/L、玉米粉1016g/L、黃豆餅粉1016g/L。上述生物製劑可以通過常規的灌根、浸種、噴霧等方法施用。可單獨使用，也可以與對本生防菌株無副作用的其它殺菌劑、植物調節劑混合使用。一般在作物播種期或病害始發期施用，方法是播種前，採用發酵製劑與種子拌種；或在病害始發期，通過灌根施入作物根際或噴霧施用。一種微生物製劑的製備方法，包括以下步驟(1)試管菌種製備將解澱粉芽孢桿菌YN-lCGMCCNO.2328接種到試管NYDA斜面培養基上，263(TC下培養2448小時獲得試管菌種；(2)種子液製備將上述試管菌種接入NYD培養液內，在2630。C下培養1216小時製成一級種子液，然後以l:100150的體積比將一級種子液接入NYD培養液內，在263(TC下進行發酵培養1214小時，獲得二級種子液；(3)發酵培養基製備取葡萄糖、玉米粉、黃豆餅粉加水配製成含葡萄糖812g/L、玉米粉1016g/L、黃豆餅粉1016g/L的培養基；(4)液體發酵生產對發酵設備及培養基滅菌後，將二級種子液按1:2030的體積比接種於培養液，在263(TC下發酵培養至少36小時後，將發酵液過濾，滅菌，再將其濃縮至原來體積的4060%即得YN-1菌株發酵液；(5)製劑製備取上步所得YN-1菌株發酵液8295份、表面活性劑28份、防腐劑14份，充分混勻即成。在上述步驟(5)中，還可進一步混入抗凍劑26份。上述抗凍劑為乙二醇、尿素、氯化鈣、氯化鈉中的至少一種。上述表面活性劑0204、SilwetL-77、Mon0818、0P-10中的至少一種。上述防腐劑為水楊酸鈉、氯化鈉中的至少一種。本發明具有積極有益的效果1.所篩選出的及"附;^//^^/^&^，-1抑菌譜廣、抑菌效果好，其對蘋果輪紋病菌(屍/2ysa/asp0rap/r/co/aNose.)、蘋果樹腐j;蘭病菌(f^Zs"附g//MiyabeetYamada)、蘋果褐斑病菌(Marasom'"ama//(RHenn.)Tto.)、黃瓜灰黴病菌(Bo^y他c/"e陽")禾口辣椒枯萎病菌(Fw5W7'w/wo:9^ponwf.sp.ca;w/cw附)有較強的抑審lj作用，室內YN-1菌株對褐斑病菌的抑菌效果達90%(參見實施例3)，說明該菌及其代謝產物可用於製備廣譜、高效生物製劑，具有極為廣闊的工業化生產前景。2.本發明的微生物製劑主要防治對象為蘋果褐斑病、蘋果腐爛病等。除此之外，以該菌株製備的生物製劑對黃瓜、辣椒、西瓜、棉花、小麥等農作物以及地黃、山藥等藥用植物的輪紋病菌、腐爛病菌、褐斑病菌、灰黴病菌、枯萎病菌、炭疽病等真菌病害也有較好的防治效果；在濟源市王屋山林場、溫縣等地的田間小區進行的防效試驗表明該生防製劑效果顯著、穩定性好，能夠有效的防治蘋果褐斑病、小麥紋枯病等真菌病害，對蘋果輪斑病、褐斑病等病害的防治效果可高達81.4%(見實施例IO)。3.本發明生物製劑的製備方法簡單、合理，篩選出了成本低廉的工業用培養基，大大降低了工業化生產成本，有利該生物製劑的應用普及。本發明所述解澱粉芽孢桿菌(&cz7/wsam_y/o/zXac/ms)YN-1,已於2008年1月9日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其簡稱為CGMCC,保藏編號為CGMCCNO.2328。具體實施例方式實施例l菌種篩選指示菌以蘋果輪紋病菌(屍/2;wz/o^orapWco/aNose.)、蘋果腐爛病菌(Fa/s"附a//MiyabeetYamada)、蘋果褐孩王病菌(Aforaso"/"aw"//(P.Henn.)Tto.)、西瓜枯菱病菌(i^s"Ww附ax^s/on/附(Schl.)f.sp.w/ve"m(Smith)Snyder)、黃瓜枯菱病菌CFwsan'ww2ax^s/orww(Schl.)f.sp.C^/cw/wen'wwwOwen.)、辣椒枯妻病(Fusan'w附ojjQ^porwmf.sp.cajM7'cM/w)、棉花枯菱病(T^wsan'wwo;^^spon'wmSchl.f.sp.vos7一"謂入小麥紋枯病Wz"o"iacerealsvanderHoevenapud.Boerema&Verhoeven)作為指示菌。培養基NYDA培養基(牛肉膏8g，蛋白腖8g，葡萄糖10g，瓊脂15g，補水至1000ml)、NYD培養基(牛肉膏8g，蛋白腖8g，葡萄糖10g，補水至1000ml)及PDA培養基(去皮馬鈴薯200g，葡萄糖10g，瓊脂粉15g，補水至1000ml)、兩用培養基(去皮馬鈴薯200g、牛肉膏5g、蛋白腖5g、葡萄糖10g，瓊脂粉15g，補水至1000ml)。篩選方法鄭州市惠濟區毛莊生菜地，採用五點取樣法，鏟去表層10cm土層，將所得土樣充分混勻後，取500g晾乾備用。菌種分離將風乾的土樣過40目篩，每個土樣取15g，加入盛有250ml無菌水和若干玻璃珠的三角瓶中，置搖床上120r/min震蕩20min，靜置後取上清液為母液。採用梯度稀釋法將母液依次稀釋濃度至10—3、10—4、10—5待用；平板塗布吸取100ul菌液至NYDA平板上進行塗布後，28t:培養箱中培養24h;挑單菌落劃線挑選具有不同菌落特徵的單菌落在NYDA平板上劃線，28'C培養箱中繼代培養四次，將生長特性不發生顯著變化者斜面保存備用。然後採用以下通用的紙碟法、含毒介質法進行拮抗菌篩選。紙碟法(1)將培養2天(溫度28X:)的斜面拮抗菌種用無菌水製成菌懸液，待用；濾紙用打孔器打成。=6mm的雙層圓形紙片，滅菌待用。PDA平板培養基培養病原菌(90mm培養皿)，用打孔器(直徑6mm)沿菌落邊緣打成菌餅，待用；(2)將兩用培養基倒入培養皿(120mm)，每皿中接3種病原菌菌餅，每種菌兩個菌餅，在菌餅之間接入已浸過菌懸液的紙碟，每皿1種拮抗菌。同時用不接拮抗菌的病原菌作對照，待對照長滿後，目測抑菌效果；(3)將兩用培養基倒入培養皿(120mra)，每皿中接l種病原菌菌餅，每皿3個菌餅，在菌餅之間接入已浸過菌懸液的紙碟，每皿接1種初篩的拮抗菌。同時用不接拮抗菌的病原菌作對照，待對照長滿後，測量抑菌圈直徑。含毒介質法將在紙碟法中篩選出的比較好的拮抗菌種接入NYD培養液，搖床培養(28。C、120r/min)72h，滅菌(121。C，20min)後待用。在培養皿(90mm)中先加入lmL原液，再加19mL冷卻至45"C左右的PDA培養基，混勻，待培養基凝固後，接入同類的病原菌菌餅，重複6次，同時用不含原液的平板做對照，待對照長滿後測量菌落直徑，計算抑菌率。抑菌率計算公式抑菌率(％)=(對照菌落直徑一處理菌落直徑)X100/(對照菌落直徑—6)本實施例共獲得22個初步篩選的菌株，其中有13個菌株對參試病原菌具有不同程度的抑制作用，對這些效果較好的拮抗菌株以蘋果褐斑病菌等為指示菌進一步做拮抗試驗，篩選出對其具有很好防治效果的YN-1菌株。表ltableseeoriginaldocumentpage9以上結果表明，由菜園土壤中分離得到的菌株YN-1不但對蘋果褐斑病菌具有顯著的拮抗作用，而且對其它植物真菌病害病原菌也具有較好的拮抗作用，表明YN-1菌株具有廣譜、高效的抑菌作用。實施例2菌株鑑定對實施例1中所分離的菌株YN-1,通過生物學特性觀察，進行進一步的形態鑑定，方法如下(1)染色按常規的染色方法進行染色。(2)形態和培養特徵在NYDA和NYD培養基上28。C培養48h，觀察其菌落特徵和顏色等，用光學顯微鏡觀察菌體特徵。(3)生理生化特徵參照《常見細菌系統鑑定手冊》方法進行。(4)菌株的穩定性將該菌株置於-7(TC冰箱中保存，在3、6、12、24月不同時間取出，傳代培養測定其抑菌率。(5)16SrDNA和分析菌株採用LB液體培養基在28。C振蕩培養至對數生長期，以9000r/min離心，收集菌體，按常規方法提取細菌基因組DNA，合成用於擴增細菌16SrDNA和ITS序列的通用PCR引物進行擴增，目的片段利用分子生物學常規的方法進行克隆和測序。通過BLAST(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/)對測序結果進行分析，與GenBank資料庫中的序列進行同源性比較，確定該菌株的分類地位。以上實驗結果記錄如下1.形態特徵該菌於28'C培養，在顯微鏡下，菌體形狀為直杆狀，菌體平均大小為21.5X2.82Mm，革蘭氏染色為陽性。具有莢膜和芽孢，芽孢形狀為橢圓形，在中心，稍膨大。鞭毛端生，單鞭毛。具有運動性。2.培養特徵該菌於28X:在NYDA平板培養基上培養24h，產生圓形菌落，邊緣不規則，菌落質地溼潤，白色，無光澤，用接種針挑取菌落，菌體粘連，具有粘度，培養基顏色沒有變化，無特殊氣味，繼續培養48小時後，菌落變得乾燥。3.生理生化特徵表3菌株YN-1的生理生化特徵生理生化特徵YN-1菌株tableseeoriginaldocumentpage11注"+"表示陽性反應，"-"表示陰性反應。4.菌株的穩定性將該菌株置於-7(TC冰箱中保存，傳代6次仍具菌種的活性，該菌的生長溫度範圍很廣，在1055'C之間，最適宜的溫度為28'C。其生長酸鹼度在58之間，最適pH值為7。5.16SrDNA和ITS序列分析根據16SrDNA序列分析YN-1菌株為芽孢桿菌屬(i^w77"s)，從菌株的各項形態特徵、培養特徵和生理生化特徵也表明該菌株屬芽孢桿菌屬，與對照組醜az^7o7&"e/acie/^菌種的特徵相同。而進一步的ITS序列分析也表明YN-1菌株ITS序列與已報導的A朋y^oh》"e/acj'朋sITS序列有99%的同源性。所以將YN-1菌株鑑定為醜a/z7"7勿"e/acie"s。formulaseeoriginaldocumentpage12CGTAGTGATTCTTTTTAACGGTTAAGTTAGAAAGGGCGCACGGTGGATGCCTTGGCAC321bpTTTTTAACGGTTAAGTTAGAAAGGGCGCACGGTGGATGCCTTGGCAC321bpAGGAGGTGATCCAGCCGCACCTTCCGATACGGCTACCTTGTTACGACT264bpCGTAGTGATTCTTTTTAACGGTTAAGTTAGAAAGGGCGCACGGTGGATGCCTTGGCAC322bpCTTTTTAACGGTTAAGTTAGAAAGGGCGCACGGTGGATGCCTTGGCAC438bpTAGAAAGGGCGCACGGTGGATGCCTTGGCAC實施例3YN-l菌株在不同發酵階段對蘋果褐斑病菌、蘋果輪紋病菌的抑菌活性測定以蘋果褐斑病菌、蘋果輪紋病菌為指示菌。抑菌活性測定用含毒介質法。將蘋果褐斑病菌、蘋果輪紋病菌平板培養待用。接入種子液後6小時開始，一直到84小時不同時間段取樣，取出的樣品滅菌後，取lmL加入19mLPDA培養基內倒入90mra培養皿內製成平板，然後分別接入蘋果褐斑病菌、蘋果輪紋病菌菌餅，重複6次，用不含發酵液的PDA蘋果褐斑病菌、蘋果輪紋病菌平板做對照，待對照長滿後測量菌落直徑，計算抑菌率，取平均值，抑菌結果如下表所示表4YN-1菌株發酵液對蘋果輪紋病菌和蘋果褐斑病菌抑制率(％)tableseeoriginaldocumentpage14從表4可以看出本實施例所用生防菌株YN-1發酵液所含抑菌活性物質，從12小時開始對指示菌起到明顯的抑制作用，隨著發酵時間延長抑菌率逐漸增加，直到48小時抑菌率達到高峰，對蘋果輪紋病菌抑菌率達92.4%，蘋果褐斑病菌抑菌率達90.3%，此後仍保持較高抑菌活性。由此可見該菌株所產生的拮抗物質，從發酵後逐漸產生直到48小時達到高峰。室內試驗結果表明，YN-1所產活性物質對蘋果輪紋病菌和蘋果褐斑病菌具有較高的抑菌作用。實施例4一種微生物製劑的製備方法，步驟如下1.試管菌種製備將上述菌株及狐^oh'^7e/"acie;7sYN-1CGMCCNO.2328接種到試管NYDA斜面培養基上，28。C下活化培養24小時獲得試管菌種；2.種子液製備將上述試管菌種接入NYD培養液內，搖床培養16小時(28°C，130轉/分)製成一級種子液，然後將一級種子液以1:100接種於100mLNYD培養液內進行發酵培養(28°C，130轉/分)12小時，獲二級種子液；3.發酵培養基製備以葡萄糖、玉米粉、黃豆餅粉為原料，加水配製成含葡萄糖10g/L、玉米粉13g/L、黃豆餅粉13g/L的培養液；4.液體發酵生產對發酵設備及培養基滅菌後，將二級種子液按1:25的體積比接種於培養液，在28。C下培養發酵48小時，將發酵液過濾，滅菌，再將其真空濃縮至原來體積的50X即得YN-1菌株發酵液；滅菌管道、空氣過濾器、發酵罐、培養基的滅菌按生產工藝標準進行。發酵條件溫度28'C，以自來水冷卻方法進行溫度調節；罐壓0.06MPa;通氣量6slpm;攪拌速度120rpm;每2小時取樣1次，測定pH值，結晶紫染色鏡檢菌體形態，觀察有無雜菌等。以培養基平板方法進行活菌檢測。發酵48小時，抑菌效果基本穩定時停止培養。5.製劑製備將上述YN-1菌株發酵液90kg與02042kg、OP-103kg、水楊酸鈉0.5kg、氯化鈉1.5kg、氯化鈣3kg充分混勻即成。以含毒介質法對上述生物製劑進行室內活性測定，並在蘋果園進行田間試驗，其保質期試驗表明，該生物製劑在室溫下可以保存2年。實施例5—種微生物製劑的製備方法，與實施例4基本相同，不同之處在於①以葡萄糖、玉米粉、黃豆餅粉為原料，加水配製成含葡萄糖8g/L、玉米粉15g/L、黃豆餅粉15g/L的培養液；②對發酵設備及培養液滅菌後，將二級種子液按l:22的體積比接種於上述培養液，在28土rC下培養發酵36小時，將發酵液過濾，滅菌，再將其真空濃縮至原來體積的40%即得YN-1菌株發酵液；③製劑製備YN-l菌株發酵液85kg、SilwetL-772kg、水楊酸鈉2kg、尿素6kg，充分混勻。實施例6—種微生物製劑的製備方法，與實施例4基本相同，不同之處在於①以培養液中含葡萄糖llg/L、玉米粉10g/L、黃豆餅粉16g/L;②對發酵設備及培養液滅菌後，將二級發酵種子液按l:30的體積比接種於上述培養液，在28士rC下培養發酵48小時，過濾發酵後的培養液，並滅菌，再將其真空濃縮至原來體積的60X即得YN-1菌株發酵液；③製劑製備，向82kgYN-l菌株發酵液中加入OP-107kg、水楊酸鈉0.9kg、乙二醇2kg,充分混勻。實施例7—種微生物製劑的製備方法，與實施例4基本相同，不同之處在於①以培養液中含葡萄糖9g/L、玉米粉16g/L、黃豆餅粉11g/L;②對發酵設備及培養基滅菌後，將二級發酵種子液按l:30的體積比接種於上述培養液，在28士2。C下培養發酵48小時，過濾發酵後的培養液，並滅菌，再將其真空濃縮至原來體積的55X即得YN-1菌株發酵液；(D製劑製備，向95kgYN-l菌株發酵液中加入Mon08186kg、氯化鈉1kg、乙二醇2kg、氯化鈣4kg，充分混勻。實施例8—種微生物製劑的製備方法，與實施例4基本相同，不同之處在於①以培養液中含葡萄糖12g/L、玉米粉12g/L、黃豆餅粉13g/L;②製劑製備，將YN-1菌株發酵液94kg與0P-108kg、水楊酸鈉1kg、氯化鈉1kg、尿素2kg、氯化鈣2kg充分混勻即成。實施例9一種微生物製劑的製備方法，與實施例4基本相同，不同之處在於①以葡萄糖、玉米粉、黃豆餅粉為原料，加水配製成含葡萄糖12g/L、玉米粉15g/L、黃豆餅粉15g/L的培養液；②對發酵設備及培養基滅菌後，將二級種子液按1:28的體積比接種於上述培養液，在28士rC下培養發酵36小時，將發酵液過濾，滅菌，再將其濃縮至原來體積的40%即得YN-1菌株發酵液；③製劑製備YN-l菌株發酵液88kg、SilwetL-774kg、水楊酸鈉0.3kg、氯化鈉3kg，充分混勻。實施例IO微生物殺菌劑防治蘋果褐斑病的田間試驗(1)試驗地情況及時間試驗地情況試驗設在濟源市王屋山林場，褐斑病發生較嚴重。果園面積5畝，栽培品種富士，樹齡10年，密度65株/畝。試驗時間2006年7月8至2006年8月26日。(2)試驗藥劑YN-1菌株發酵液製劑和活菌製劑，另以80%新大生可溼性粉劑(美國固信公司)作對照。(3)試驗處理將YN-1菌株發酵液過濾、滅菌、濃縮後，加工成水劑，其基本組成活性物質(有效成份)、溶劑(水或其他有機物)、助劑(表面活性劑、抗凍劑、防腐劑等)。以實施例4和實施例5中所述微生物製劑YN-1為母液為例，分別設25倍、50倍、100倍稀釋液；活菌的含活菌以活菌數/ml計算；80%新大生800倍；清水對照作對照；以葉面噴霧施用，試驗設9個處理，每處理5株，共50株；三次用藥，間隔期為15天。(4)調査時間及方法時間第一次用藥前進行病害基數調查，第二次調查為最後一次用藥後第10天；方法每處理調查3棵，每棵樹從東、西、南、北、內膛5個方位取樣，每方位調查50片葉，調査病葉數，病級，並計算病情指數、防效。褐斑病分級標準0級無病；l級病斑面積佔葉總面積小於10%;3級病斑面積11%25%;5級病斑面積26%40%;7級病斑面積41%65%;9級病斑面積大於65%。計算公式病情指數=E(病情級別X該級的病葉數)防治效果(%)=(5)試驗結果總葉片數x最高級別病情指數對照區病情指數一處理區病情指數X100對照區病情指數X100拮抗菌YN-1的發酵液加入不同助劑或活菌在蘋果上應用，對蘋果褐斑病具有較好的防治效果。調査結果表明(表5)實施例4的防治效果分別為67.2%、81.4%、73.2%;活菌50倍(含活菌數/ml)、100倍(含活菌數/ml)的防效分別為79.2%和53.2%。與施水對照相比病情指數均有明顯的降低；對照組化學農藥新大生的防治效果76.3%，農戶自管的防治效果為68.1%。表5tableseeoriginaldocumentpage18權利要求1.一種解澱粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)YN-1，其保藏編號為CGMCCNO.2328。2.—種以權利要求1所述的解澱粉芽孢桿菌製備的微生物製劑，其特徵在於，以重量份計，該微生物製劑含有解澱粉芽孢桿菌YN-1CGMCCNO.2328發酵液8295份，表面活性劑28份，防腐劑14份。3.根據權利要求2所述的微生物製劑，其特徵在於，所述微生物製劑還含有抗凍劑26份。4.根據權利要求3所述的微生物製劑，其特徵在於，所述抗凍劑為乙二醇、尿素、氯化鈣、氯化鈉中的至少一種。5.根據權利要求2至4任一項權利要求所述的微生物製劑，其特徵在於，所述解澱粉芽孢桿菌發酵液是通過如下方法製得將所述解澱粉芽孢桿菌YN-1接種於培養液，發酵培養至少36小時，將發酵液過濾，滅菌，再將其濃縮至原來體積的4060%後即成；所述培養液中含有葡萄糖812g/L、玉米粉1016g/L、黃豆餅粉1016g/L。6.根據權利要求5所述的微生物製劑，其特徵在於，所述表面活性劑為0204、SilwetL-77、Mon0818、0P-10中的至少一種。7.根據權利要求6所述的微生物製劑，其特徵在於，所述防腐劑為水楊酸鈉、氯化鈉中的至少一種。8.—種如權利要求2所述的微生物製劑的製備方法，其特徵在於，它包括以下步驟(1)試管菌種製備將解澱粉芽孢桿菌YN-1CGMCCN0.2328接種到試管NYDA斜面培養基上，2630。C下培養2448小時獲得試管菌種；(2)種子液製備將上述試管菌種接入NYD培養液內，在2630。C下培養1216小時製成一級種子液，然後以l:100150的體積比將一級種子液接入NYD培養液內，在263(TC下進行發酵培養1214小時，獲得二級種子液；(3)發酵培養基製備取葡萄糖、玉米粉、黃豆餅粉加水配製成含葡萄糖812g/L、玉米粉1016g/L、黃豆餅粉1016g/L的培養基；(4)液體發酵生產對發酵設備及培養基滅菌後，將二級種子液按1:2030的體積比接種於培養液，在2630'C下發酵培養至少36小時後，將發酵液過濾，滅菌，再將其濃縮至原來體積的4060X即得YN-1菌株發酵液；(5)製劑製備取上步所得YN-1菌株發酵液8295份、表面活性劑28份、防腐劑14份，充分混勻即成。9.根據權利要求8所述的微生物製劑的製備方法，其特徵在於，在所述步驟(5)中，進一步混入抗凍劑26份，所述抗凍劑為乙二醇、尿素、氯化鈣、氯化鈉中的至少一種。10.根據權利要求8或9所述的微生物製劑的製備方法，其特徵在於，所述表面活性劑0204、SilwetL-77、Mon0818、OP-IO中的至少一種；所述防腐劑為水楊酸鈉、氯化鈉中的至少一種。全文摘要本發明涉及一種保藏編號為CGMCCNO.2328的解澱粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)YN-1和生防微生物製劑及其製備方法。以重量份計，該微生物製劑含芽孢桿菌發酵液82～95份、表面活性劑2～8份、防腐劑1～4份；其製備方法包括試管菌種、種子液、發酵培養基的製備及液體發酵生產、製劑製備等步驟。該解澱粉芽孢桿菌抑菌譜廣、抑菌效果好；以該菌株製備的微生物製劑能有效防治蘋果褐斑病、小麥紋枯病等真菌病害，防治效果顯著、穩定，對蘋果輪斑病、褐斑病等病害的防治效果可高達81.4％；該製劑的生產方法簡單、合理，篩選出了成本低廉的工業用培養基，工業化生產成本低，易於普及應用。文檔編號A01N63/02GK101423812SQ20081023140公開日2009年5月6日申請日期2008年12月17日優先權日2008年12月17日發明者任應黨,倪雲霞,劉新濤,劉玉霞,劉紅彥,楊麗榮,飛王,薛保國申請人:河南省農業科學院