一種檢測抗生素殘留的適配體傳感器的製備方法
2023-06-03 07:12:51 1
一種檢測抗生素殘留的適配體傳感器的製備方法
【專利摘要】本發明公開了一種檢測抗生素殘留的適配體傳感器的製備方法，屬於農產品安全檢測【技術領域】。本發明通過將金電極與硫堇進行電聚合，獲得電聚合硫堇電極，再將預配好的碳納米管-石墨烯納米複合物均勻滴塗到電聚合硫堇電極表面，晾乾後，再將電極浸入到抗生素適配體溶液中，衝洗晾乾後，再用BSA溶液封閉，獲得抗生素適配體傳感器。本發明所製備的適配體傳感器具有不用經過預處理、分析速度快、作業系統簡單、準確度高、專一性強、成本低、響應快等優點，檢測限達到0.8nM，適用於抗生素殘留的快速檢測。
【專利說明】一種檢測抗生素殘留的適配體傳感器的製備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種檢測抗生素殘留的適配體傳感器的製備方法，屬於農產品安全檢測【技術領域】。
技術背景
[0002]抗生素作為一種治療疾病的藥物，目前已經被廣泛應用在乳牛的疾病治療。無論是通過肌肉注射還是口服，進入奶牛體內的抗生素都是可以通過乳牛的新陳代謝排出體夕卜，並且牛乳就是乳牛把抗生素類物質排洩出體外的一種重要途徑。因此牛奶中的抗生素殘留的問題，一般專家調查認為，泌乳期乳牛的用藥不當和安全時間不注意是牛奶中的抗生素殘留的重要的兩個來源，特別是使用乳房灌注法治療乳腺炎時，易造成牛乳中抗生素殘留。牛奶是老少皆宜的營養品，牛奶中若含有抗生素，對長期飲用者來說無疑是等於長期服用小劑量的抗生素，對抗生素過敏的人服用殘留抗生素的乳後會發生過敏反應。即使是正常飲用者，體內的某些條件性致病菌易產生耐藥性，一旦患病再用同種抗生素治療很難奏效。為了預防和解決抗生素殘留造成的食品汙染和人體安全等問題，現在最有效的策略就是儘早儘快地找到高效、靈敏、準確的檢測殘留卡那黴素方法。目前我國已經加入WT0，這就使得我們與世界各國的貿易往來變得現實並且嚴肅，這就要求我們更加注重卡那黴素殘留的檢測以及預防。
[0003]抗生素殘留的檢測方法多種多樣，每種方法都有各自特點，適應在不同條件下檢測。在選用各種方法時我們應當根據簡便易用、精確可靠的原則。常用的抗生素殘留檢測方法有氣相色譜法(GC)、光譜法、高效液相色譜法(HPLC)、薄層色譜法(TLC)、適配體分析法等。這些分析方法雖然具有高選擇性，但是由於操作繁瑣、耗時長、成本高，並且需對樣品進行預濃縮和衍生處理，所以很難得到廣泛應用。因此，人們會更加急切的需要快速、可靠、經濟和適合於現場應用的快速檢測方法。於是，快速、可信、廉價、敏感的適配體生物傳感器應運而生。與傳統的分析方法相比，適配體生物傳感器具有待測的樣品不用經過預先處理、分析速度快、作業系統簡單、準確度高、專一'丨生強、成本低、響應快等優點。
【發明內容】
[0004]本發明的目的在於提供一種能克服上述缺陷以及操作簡單、靈敏度高、選擇性好的檢測抗生素殘留的電流型適配體傳感器的製備方法。採用的技術方案為:
一種檢測抗生素殘留的適配體傳感器的製備方法，是將金電極(d=2mm)與硫堇進行電聚合，獲得電聚合硫堇電極，再將預配好的碳納米管-石墨烯納米複合物均勻滴塗到電聚合硫堇電極表面，晾乾後，再將電極浸入到抗生素適配體溶液中，衝洗晾乾後，再用BSA溶液封閉，獲得抗生素適配體傳感器。
[0005]所述方法的步驟如下:
O製備碳納米管-石墨烯納米溶液；
2)清洗,活化並測試金電極；3)將步驟2)所得金電極進行電聚合硫堇，獲得電聚合硫堇電極；
4)在步驟3)所得電聚合硫堇電極上均勻滴塗步驟I)製備的碳納米管-石墨烯納米溶液，獲得納米塗膜電極；
5)將步驟4)所得納米塗膜電極浸入到抗生素適配體溶液中，衝洗晾乾後獲得適配體電
極；
6)利用BSA溶液封閉步驟5)所得適配體電極，晾乾後獲得適配體傳感器。
[0006]所述方法的步驟I)所述製備碳納米管-石墨烯納米溶液，是取IOOmg碳納米管加入到2.6mol/L的HNO3中，在140°C下回流6h，抽濾，用超純水洗滌至中性，加入石墨烯後將溶液分散在N，N- 二甲基甲醯胺中，再用超聲波分散，直到得到黑色懸濁液。
[0007]所述方法的步驟2)所述清洗，活化並測試金電極，是利用熱piranha溶液浸泡金電極後，再用Al2O3漿拋光，在依次用去離子水、HNO3、無水乙醇和去離子水超聲清洗，乾燥後用循環伏安法活化，並通過檢測金電極循環伏安曲線峰電位差測試金電極。
[0008]所述方法的步驟3)所述電聚合硫堇，是將預處理好的金電極放入含0.10mol/L的HNO3和4mmol/L硫堇的磷酸鹽緩衝液中，在-0.1-1.4V範圍內，以50mV/s的速度循環掃描30圈，取出清洗。
[0009]所述方法的步驟4)所述滴塗碳納米管-石墨烯納米溶液，是取5 μ L碳納米管-石墨烯納米複合液滴塗在電聚合硫堇電極表面，20°C下靜置2h，然後用pH7.5的磷酸鹽緩衝液衝洗，氮氣吹乾。
[0010]所述方法的步驟5)所述浸入到抗生素適配體溶液中，浸泡時間為0.5h，浸泡溫度為 4。。。
[0011]所述方法的步驟6)所述用BSA溶液封閉電極，BSA溶液濃度為0.5%，封閉溫度為20°C，封閉時間為2h。
[0012]所述方法的具體步驟如下:
1)取IOOmg碳納米管加入到2.6mol/L的HNO3中，在140°C下回流6h，抽濾，用超純水洗滌至中性，加入石墨烯後將溶液分散在N，N-二甲基甲醯胺中，再用超聲波分散，直到得到黑色懸濁液，獲得碳納米管-石墨烯納米複合溶液；
2)利用熱piranha溶液浸泡金電極後,用Al2O3漿拋光,再依次用去離子水、HNO3、無水乙醇和去離子水超聲清洗，乾燥後用循環伏安法活化，並通過檢測金電極循環伏安曲線峰電位差測試金電極，獲得預處理金電極；
3)將步驟2)所得的預處理金電極放入含0.10mol/L的HNO3和4mmol/L硫堇的磷酸鹽緩衝液中，在-0.1-1.4V範圍內，以50mV/s的速度循環掃描30圈，取出清洗乾燥後獲得電聚合硫堇電極；
4)取5μ L步驟I)製備的碳納米管-石墨烯納米複合溶液滴塗在步驟3)所得電聚合硫堇電極表面，20°C下靜置2h，然後用pH7.5的磷酸鹽緩衝液衝洗，氮氣吹乾後獲得納米塗膜電極；
5)將步驟4)所得納米塗膜電極浸入到抗生素適配體溶液中浸泡時間為0.5h，浸泡溫度為4°C，衝洗晾乾後獲得適配體電極；
6)將步驟5)所得適配體電極浸入0.5%的BSA溶液中，室溫封閉0.5h後晾乾得到適配體傳感器。[0013]本方法的有益效果:
本發明採用電聚合硫堇、滴塗碳納米管-石墨烯納米複合物對金電極進行修飾。電聚合硫堇具有較高的比表面積、良好的穩定性和導電性，可以增大電極表面電子的轉移和生物相容性，進而增大適配體傳感器的響應電流，並且沉積過程簡單、省時、可控；
本發明先在組裝好的電極表面修飾上生物素化的適配體，再吸附親和素，最後再將生物素修飾DNA固定到修飾電極上來對卡那黴素實時檢測。卡那黴素和用不同基團修飾的卡那黴素適體形成夾層結構-「三明治結構」，使得檢測度更高；
採用本發明製成的電流型適配體傳感器可以在牛奶集收、上市前，進行卡那黴素殘留的快速測定，直接對抗生素殘留量是否超標進行檢測，檢測限為8.6 nM。避免因飲用含有殘留抗生素的牛奶而引起中毒，為農產品安全生產與消費提供殘留檢測的技術支撐。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0014]圖1.工作電極表面修飾不同納米材料後的循環伏安曲線；
Ca.裸金電極；b.硫堇/金電極；c.石墨烯-聚苯胺/硫堇/金電極；d納米金/石墨烯-聚苯胺/硫堇/金電極；e.適配體I/納米金/石墨烯-聚苯胺/硫堇/金電極f.BSA/適配體I/納米金/石墨烯-聚苯胺/硫堇/金電極；g.適配體2-卡那黴素/BSA/適配體I/納米金/石墨烯-聚苯胺/硫堇/金電極)；
圖2適配體傳感器的標準曲線；
(A.適配體傳感器檢測不同濃度的卡那黴素差分脈衝伏安曲線；B卡那黴素濃度與適配體傳感器檢測的電流變化線性關係曲線)。
【具體實施方式】
[0015]下面結合實施例對本發明做進一步說明，但本發明不受實施例的限制。實施例1適配體傳感器的製備
一種檢測卡那黴素的適配體傳感器的製備步驟如下:
(1)碳納米管-石墨烯納米複合膜的製備:取IOOmg碳納米管加入濃度為2.6mol/L的HNO3在140°C的條件下回流6h，抽濾，用超純水洗滌至pH為中性。將石墨烯加入到上述溶液中，並將其上述溶液分散在N，N-二甲基甲醯胺中，然後將分散液用超聲波分散，直到得到黑色的懸浮液；
(2)金電極的清洗:金電極修飾前，首先浸入熱的「piranha」溶液(H2S04:30%H202=3:1)中浸泡15min，用水清洗乾淨，接下來用0.3ym、30nm的Al2O3漿在麂皮上拋光至鏡面，拋光後用去離子水洗去除表面汙物，再移入超聲水浴中清洗，每次5min，重複二次，然後依次用6mol/L的HNO3、無水乙醇和去離子水超聲清洗，氮氣環境下乾燥；
(3)金電極的活化:徹底清洗後，電極在0.5mol/L H2SO4溶液中用循環伏安法活化，掃描範圍1.0V?-1.0V,反覆掃描直至達到穩定的循環伏安圖為止；
(4)預處理好的金電極的測試:在含有IX 10_3moVLK3Fe (CN)6的0.20mol/LKN03溶液中跑循環伏安曲線，以測試所述金電極的性能，掃描速度50mV/S，掃描範圍為-0.1V?
0.6V ;當所述循環伏安曲線中的峰電位差在80mV-120mV以下，並儘可能接近64mV，所述金電極可使用，否則要重新返回步驟(2)中，處理所述金電極，直到符合要求，圖1為修飾不同佳測試底液的邱為7.5，最佳適配體的濃度:；時間與溫度分別為60 111111和351 ；
示準溶液，將上述製備好的適配體傳感器分特異性反應60111111，檢測適配體與相應卡那圖2),測得檢測限為8.6龜電傳感器製備方法用於抗生素殘留的檢測，養濃度範圍廣，靈敏度高。為了考察該傳感該傳感器響應電流下降約9.4%，表示該傳%，測得相對標準偏差(830)為5.6 %，表示裝完五個傳感器，連續測3次，測得為艮的研究該適配體傳感器的實用價值，在超爰衝液稀釋5倍，加入不同濃度的卡那黴素仗率率在97.2 - 104.9%之間，由此證明，該我國抗生素殘留快速檢測技術發展和國際
【權利要求】
1.一種檢測抗生素殘留的適配體傳感器的製備方法，其特徵在於，將金電極與硫堇進行電聚合，獲得電聚合硫堇電極，再將預配好的碳納米管-石墨烯納米複合物滴塗到電聚合硫堇電極表面，晾乾後將電極浸入到抗生素適配體溶液中，衝洗晾乾後用BSA溶液封閉，獲得抗生素適配體傳感器。
2.根據權利要求1所述方法，其特徵在於，所述抗生素為卡那黴素。
3.根據權利要求1所述方法，其特徵在於，步驟如下: O製備碳納米管-石墨烯納米溶液； 2)清洗、活化並測試金電極； 將步驟3)所得金電極進行電聚合硫堇，獲得電聚合硫堇電極； 在步驟4)所得電聚合硫堇電極上均勻滴塗步驟I)製備的碳納米管-石墨烯納米溶液，獲得納米塗膜電極； 將步驟5)所得納米塗膜電極浸入到抗生素適配體溶液中，衝洗晾乾後獲得適配體電極； 利用BSA溶液封閉步驟6)所得適配體電極，晾乾後獲得適配體傳感器。
4.根據權利要求2所述方法，其特徵在於，步驟I)所述製備碳納米管-石墨烯納米溶液，是取IOOmg碳納米管加入到2.6mol/L的HNO3中，在140°C下回流6h，抽濾，用超純水洗滌至中性，加入石墨烯後將溶液分散在N，N-二甲基甲醯胺中，再用超聲波分散，直到得到黑色懸濁液。
5.根據權利要求2所述方法，其特徵在於，步驟2)所述清洗、活化並測試金電極，是利用熱piranha溶液浸泡金電極後,再用Al2O3漿拋光,在依次用去離子水、HNO3、無水乙醇和去離子水超聲清洗，乾燥後用循環伏安法活化，並通過檢測金電極循環伏安曲線峰電位差測試金電極。
6.根據權利要求2所述方法，其特徵在於，步驟3)所述電聚合硫堇，是將預處理好的金電極放入含0.1OmoI/L的HNO3和4mmol/L硫堇的磷酸鹽緩衝液中，在-0.1~1.4V範圍內，以50mV/s的速度循環掃描30圈，取出清洗。
7.根據權利要求2所述方法，其特徵在於，步驟4)所述滴塗碳納米管-石墨烯納米溶液，是取5 μ L碳納米管-石墨烯納米複合液滴塗在電聚合硫堇電極表面，20°C下靜置2h，然後用PH7.5的磷酸鹽緩衝液衝洗，氮氣吹乾。
8.根據權利要求2所述方法，其特徵在於，步驟5)所述浸入到抗生素適配體溶液中，浸泡時間為0.5h,浸泡溫度為4°C。
9.根據權利要求2所述方法，其特徵在於，步驟6)所述用BSA溶液封閉電極，BSA溶液濃度為0.5%，封閉溫度為20°C，封閉時間為2h。
10.根據權利要求2所述方法，其特徵在於，具體步驟如下: 1)取IOOmg碳納米管加入到2.6mol/L的HNO3中，在140°C下回流6h，抽濾，用超純水洗滌至中性，加入石墨烯後將溶液分散在N，N-二甲基甲醯胺中，再用超聲波分散，直到得到黑色懸濁液，獲得碳納米管-石墨烯納米複合溶液； 2)利用熱piranha溶液浸泡金電極後,用Al2O3漿拋光,再依次用去離子水、HNO3、無水乙醇和去離子水超聲清洗，乾燥後用循環伏安法活化，並通過檢測金電極循環伏安曲線峰電位差測試金電極，獲得預處理金電極；將步驟3)所得的預處理金電極放入含0.10mol/L的HNO3和4mmol/L硫堇的磷酸鹽緩衝液中，在-0.1~1.4V範圍內，以50mV/s的速度循環掃描30圈，取出清洗乾燥後獲得電聚合硫堇電極； 取5 μ L步驟4)製備的碳納米管-石墨烯納米複合溶液滴塗在步驟3)所得電聚合硫堇電極表面，20°C下靜置2h，然後用pH7.5的磷酸鹽緩衝液衝洗，氮氣吹乾後獲得納米塗膜電極； 將步驟5)所得納米塗膜電極浸入到抗生素適配體溶液中浸泡時間為0.5h，浸泡溫度為4°C，衝洗晾乾後獲得適配體電極； 將步驟6)所得適配體電極浸入0.5%的BSA溶液中，室溫封閉0.5h後晾乾得到適配體傳感器。
【文檔編號】G01N27/26GK103837588SQ201410114665
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2014年3月26日 優先權日:2014年3月26日
【發明者】郭業民, 孫霞, 李發蘭, 王相友, 劉君峰 申請人:山東理工大學