革蘭陽性需氧菌鑑定板及其製備方法

2023-06-03 16:45:31 1

專利名稱：：革蘭陽性需氧菌鑑定板及其製備方法
技術領域：
：本發明涉及生物製劑。具體涉及一種革蘭陽性需氧菌鑑定板及其製備方法。
背景技術：
：近20年來，由於臨床上廣泛大量地使用種類繁多的抗菌藥物，細菌的耐藥性越來越普遍，有的細菌可同時耐2-7種藥物，耐藥菌株的廣泛傳播給臨床治療帶來很大困難，特別是對於醫院內感染的細菌。醫院內感染是出現在醫院環境中的感染，並易發生流行，故又可將其稱為醫院獲得性感染(Hospitalacquiredinfection)。雖然發生醫院感染的病情有輕有重，但都給病人增加了額外的痛苦、經濟負擔和不幸，同時也會由於延長住院時間而加重醫療和護理工作的負擔，影響病床周轉。嚴重的醫院感染往往使病人所患的疾病不能達到預期的療效，甚至產生難以治療的後遺症或死亡。據美國的一次不完全統計資料報告，其住院病人中約有5%發生醫院感染，平均延長住院45d，每年約有10萬人死亡於醫院感染，估計每年由於醫院感染要多消耗20餘億美元。從引起醫院感染的微生物來看，固然有些仍是所熟悉的致病性很強的微生物，但是近年來醫院感染的病原體種類有明顯變化的趨勢，革蘭氏陰性菌已取代了原來為主要病原的革蘭氏陽性球菌，其中腸桿菌科及假單胞菌約佔醫院感染的60%-65%，並且主要為多耐藥性細菌。由於廣泛應用抗生素，細菌的不斷變遷，助長了醫院內感染的存在和發展，今日的臨床微生物學最重要的特點是向醫院感染方面轉變。微生物鑑定及藥敏分析系統是主要應用於臨床實驗室的高科技體外診斷產品，對輔助臨床各科室診斷治療具有重要意義。目前在國際上，對細菌的快速鑑定和藥敏分析己經取得了很大的進展，微生物自動化檢測產品逐步替代了手工檢測。目前，微生物自動化檢測產品主要有法國生物-梅裡埃公司的VITEK-AMS微生物分析系統、美國Dade-MicroSean公司的MicroScan自動微生物鑑定和藥敏測試系統以及英國TrekDiagnosticSystemLtd.的SENSTITRE螢光法快速微生物鑑定和藥敏分析系統。它們的工作原理相近，主要是根據細菌理化性質的差異，採用光電比色，測定細菌生長分解底物導致PH值改變而產生的不同顏色和濁度變化來判斷反應情況，從而給出鑑定藥敏結果。但是，上述檢測產品在臨床推廣上，用於微生物鑑定主要存在以下幾個方面的問題(1)鑑定時間偏長，需要16-24小時給出結果；(2)鑑定範圍比較狹窄，可以鑑定的細菌種類少。
發明內容本發明要解決的技術問題在於克服上述不足之處，研究設計一種快速準確革蘭陽性需氧菌鑑定板。本發明的鑑定檢測實驗基於下列原理根據目前微生物鑑定領域權威的伯傑細菌鑑定手冊，細菌的鑑定主要通過檢測細菌對各種營養物質的利用情況，即通過檢測細菌生化反應特性來鑑定細菌。而細菌利用營養物質發生生化反應的過程中，會發生一系列的氧化還原反應，這些氧化還原反應中會產生NADH，而NADH能夠把四唑紫(2，3，5-triphenyltetrazoliumchloride,TTC)指示劑由無色的氧化型轉變為紫色的還原型。因此我們使用四唑紫作為細菌發生生化反應的指示劑，來檢測細菌的生化反應特性，從而達到細菌鑑定的目的。不同細菌利用不同碳源或氮源進入新陳代謝過程，而對其他一些碳源或氮源則無法利用，這些特性是細菌的遺傳物質所決定的。目前現有的微生物鑑定板最多只有30個生化反應，因此對於鑑定細菌的種類方面比較狹窄，可以鑑定的革蘭陽性菌種類最多只有150餘種,且不同種類的細菌需要使用不同種類的板條進行鑑定，同時需要通過補充實驗進行驗證才能得出鑑定結果，操作比較繁瑣。因此，為了克服上述不足之處，達到鑑定所需細菌的目的，就需要選擇一組合適的碳源和氮源。本發明人選擇了500多種碳源和氮源,對多種細菌進行檢測，通過對這些數據的分析整理，最終確定目前板條的碳源和氮源的組合(見下表)。該種鑑定板上的47個碳源和氮源組合可鑑定的革蘭陽性菌種類有300餘種，可以鑑定葡萄球菌屬、鏈球菌屬、腸球菌屬、陽性桿菌等多種不同種類的細菌，且不需要進行補充實驗就可以得出鑑定結果。10革蘭陽性需氧菌鑑定板底物表tableseeoriginaldocumentpage11本發明提供了一種革蘭陽性需氧菌鑑定板，該鑑定板由反應底物原液和肉湯培養基組成，所述反應底物原液在鑑定板上的位置及其各成分的濃度為(g/ml)tableseeoriginaldocumentpage11tableseeoriginaldocumentpage12H6，H12D-葡萄糖-6-磷酸酯2%所述肉湯培養基由下列成分組成(V/V)物質名稱所佔比例純水64%GP/MT(革蘭陽性菌鹽貯液)21.9%氯化銨NH4Cl水溶液4.4%GP(革蘭陽性菌)混合貯液0.88%50yM葉酸水溶液0.088%8mM維生素K3亞硫酸氫鈉水溶液4.4%結晶紫水溶液4.4%實中GP/MT(革蘭陽性菌鹽貯液)由下列成分組成(重量％濃度)物質名稱所佔比例純水[H20]80%2水合磷酸二氫鈉[NaH2P04-2H20]4.68o/0磷酸氫二鈉[Na2HP04]12.775%氯化鉀[KC1]2.61%十水合焦磷酸鈉[Na4P2(Vl0H2O]0.018%本發明的另一目的是提供了革蘭陰性需氧菌鑑定板的製備方法。由於革蘭陽性菌需氧菌鑑定板可以鑑定不同種類的細菌，包括一些營養成分要求比較高的苛養菌，因此必須有一種合適的營養物質來滿足各種不同種類細菌生長的需要。本發明人通過以下實驗對混合試劑中的成分組成進行了選擇，研製發明了一種混合試劑，該混合試劑有多種細菌生長所需的營養物質混合組成。1、實驗方法選取無機鹽基礎、胺基酸、磷酸緩衝液、維生素、蛋白腖、牛肉膏、麥芽膏等多種細菌生長營養物質按不同的組合方式和適當的比例混合配置成試劑，然後選取不同種類的細菌進行試驗，以確定合種組合方式可以滿足各種不同種類細菌的生長。2、實驗結果本實驗選取了金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、大鼠鏈球菌、馬紅球菌、極小棒桿菌、蠟樣芽孢桿菌、藤黃微球菌不同種類細菌加入不同混合試劑配置的鑑定板條中進行實驗，實驗結果如下tableseeoriginaldocumentpage14通過上述實驗表明組合5的混合試劑可能滿足不同種類細菌生長的需要，因此本發明人確定了混合試劑的組合方式，該混合試劑的各物質按下列比例混合配置成GP(革蘭陽性菌)混合試劑重量％濃度tableseeoriginaldocumentpage14本發明方法包括下列步驟1、配置鑑定板反應底物原液根據下列配置濃度要求配置各反應底物的原液。(g/ml)tableseeoriginaldocumentpage15tableseeoriginaldocumentpage162、配置肉湯培養基(1)、下列各物質的按比例混合配置GP/MT(革蘭陽性菌鹽貯液)重量％濃度tableseeoriginaldocumentpage16(2)、按下列各物質配置濃度要求配置GP混合貯液(g/ml)tableseeoriginaldocumentpage16(3)、根據下列配置濃度要求配置以下幾種物質的水溶液。(g/ml)tableseeoriginaldocumentpage16、按下列各物質的比例混合配置肉湯培養基(v/v)tableseeoriginaldocumentpage163、分裝(1)根據板條批量生產的數量要求將合適的步驟1配置的反應底物原液分裝到96支試管中。(2)根據板條批量生產的數量要求將步驟2配置的肉湯培養基加入到(1)的試管中。4、加樣分裝板條使用分裝系統在96孔的相應位置對指定的鑑定板條加樣，每孔加50ul;5、板條乾燥上述板條常溫乾燥16-18小時；6、包裝。7、板條存C由於本發明鑑定板上的47個碳源和氮源組合可鑑定的革蘭陽性菌種類有300餘種，可以鑑定葡萄球菌屬、鏈球菌屬、腸球菌屬、陽性桿菌等多種不同種類的細菌，且不需要進行補充實驗就可以得出鑑定結果，操作簡單，結果準確，因而，有較大的臨床應用價值。具體實施例方式革蘭陽性需氧菌鑑定板，批量生產375塊產品的生產工藝流程如下:配置鑑定板反應底物原液(g/ml)孔位藥物名稱純水本批所需量(ml)藥物本批所需量(g)Al，A7水1818A2，A8糊精180.72A3，A9N-乙醯-D-葡糖胺180.72A4,A10N-乙醯-e-D-甘露糖胺180.72A5，All苦杏苷180.72A6，A12L-樹膠醛糖180.72Bl，B7對苯二酚葡萄糖苷180.72B2,B8D-纖維二糖180.72B3，B9D-半乳糖180.72B4,B10D-葡萄糖酸180.72B5,Blla-D-葡萄糖180.72B6，B12甘油180.72Cl，C7a-D-乳糖180.72tableseeoriginaldocumentpage182、配置肉湯培養基(1)、將下列各物質混合配置GP/MTtableseeoriginaldocumentpage18十水合焦磷酸鈉[N34P2Orl0H20]0.07lg(2)、按下列各物質的比例混合配置GP混合貯液物質名稱純水本批所需量(ml)藥物本批所需量(g)GP混合試劑5012.375(3)、根據配置濃度要求配置以下幾種物質水溶液c物質名稱純水本批所需量(ml)藥物本批所需量(g)0.5raM葉酸100.0022結晶紫500.9-1.058mM維生素K3亞硫酸氫鈉500.1-0.12氯化銨502.65(4)將下列各物質混合配置肉湯培養基物質名稱藥物本批所需量純水656mlGP/MT225ml氯化銨NH4C1水溶液45mlGP混合貯液9ml50uM葉酸水溶液0.9ml8mM維生素K3亞硫酸氫鈉水溶液45ml結晶紫水溶液45ml3、分裝(1)將配置的反應底物原液分裝到相對應的96支試管中，每管加入6.675ml。(2)將配置的肉湯培養基加入到96支試管中，每管加入8.95ml。4、加樣分裝板條將配置好的96根試管裝在加樣機上，使用加樣機對指定的鑑定板條加樣，每孔加50ul。(在這之前要先運行分裝系統；整個程序大約需要3個小時)。5、板條乾燥將加樣好的板條放入乾燥間進行常溫乾燥，24小時後板條可乾燥完畢。6、板條包裝將乾燥好的板條從乾燥間經傳遞窗送到包裝間進行包裝。7、板條存貯包裝完畢的板條放入2-8'C冰箱進行保存。權利要求1、一種革蘭陽性需氧菌鑑定板，其特徵在於該鑑定板由反應底物原液和肉湯培養基組成，所述反應底物原液在鑑定板上的位置及其各成分的濃度為g/ml位置溶液名稱濃度A1，A7水100％A2，A8糊精4％A3，A9N-乙醯-D-葡糖胺4％A4，A10N-乙醯-β-D-甘露糖胺4％A5，A11苦杏苷4％A6，A12L-樹膠醛糖4％B1，B7對苯二酚葡萄糖苷8％B2，B8D-纖維二糖4％B3，B9D-半乳糖4％B4，B10D-葡萄糖酸4％B5，B11α-D-葡萄糖4％B6，B12甘油4％C1，C7α-D-乳糖4％C2，C8乳果糖4％C3，C9麥芽糖4％C4，C10麥芽三糖4％C5，C11D-甘露醇4％C6，C12D-蜜二糖4％D1，D73-甲基-葡萄糖4％D2，D8β-甲基-D-葡糖苷4％D3，D9帕拉金糖4％D4，D10D-阿洛酮糖4％D5，D11D-棉子糖4％D6，D12D-核糖4％E1，E7水楊甙4％E2，E8D-山梨糖醇4％E3，E9蔗糖4％E4，E10D-塔格糖4％E5，E11D-海藻糖4％E6，E12松二糖4％F1，F7木糖醇4％F2，F8丙酮酸甲基酯4％F3，F9單甲基琥珀酸4％F4，F10醋酸2％F5，F11α-羥基丁酸鈉2％F6，F12α-酮戊酸2％G1，G7L-乳酸4％G2，G8D-丙氨酸2％G3，G9L-丙氨酸2％G4，G10L-丙氨醯-甘氨酸3％G5，G11L-絲氨酸3％G6，G12腺苷2％H1，H72』-脫氧腺苷2％H2，H8肌苷2％H3，H9胸腺嘧啶脫氧核苷2％H4，H10尿嘧啶核苷2％H5，H11尿嘧啶核苷-5』-單磷酸酯2％H6，H12D-葡萄糖-6-磷酸酯2％所述肉湯培養基由下列成分組成v/v物質名稱所佔比例純水64％GP/MT21.9％氯化銨水溶液4.4％GP混合貯液0.88％50μM葉酸水溶液0.088％8mM維生素K3亞硫酸氫鈉水溶液4.4％結晶紫水溶液4.4％2、根據權利要求1所述一種革蘭陽性需氧菌鑑定板，其特徵在於所述肉湯培養基中的GP/MT由下列成分組成重量％濃度物質名稱所佔比例純水[H20]80%2水合磷酸二氫鈉4.68%磷酸氫二鈉12.775%氯化鉀2.61%十水合焦磷酸鈉0.018%3、根據權利要求1所述一種革蘭陽性需氧菌鑑定板，其特徵在於所述肉湯培養基中的GP混合貯液由下列成分組成的GP混合試劑加水配置而成。重量％濃度tableseeoriginaldocumentpage44、根據權利要求1所述一種革蘭陽性需氧菌鑑定板，其特徵在於所述革蘭陽性需氧菌鑑定板的底物及其在鑑定板上的位置為-tableseeoriginaldocumentpage45、一種革蘭陽性需氧菌鑑定板的製備方法，其特徵在於該方法包括下列步驟(1)配製鑑定板反應底物原液根據下列配置濃度要求配置各反應底物的原液g/ml位置溶液名稱濃度Al，A7水100%A2，A8糊精4%A3，A9N-乙醯-D-葡糖胺4%A4，A10N-乙醯-e-D-甘露糖胺4%A5，All苦杏苷4%A6，A12L-樹膠醛糖4%Bl，B7對苯二酚葡萄糖苷8%B2，B8D-纖維二糖4%B3，B9D-半乳糖4%B4，B10D-葡萄糖酸4%B5，Blla-D-葡萄糖4%B6,B12甘油4%Cl，C7a-D-乳糖4%C2，C8乳果糖4%C3,C9麥芽糖4%C4，C10麥芽三糖4%C5，CllD-甘露醇4%C6，C12D-蜜二糖4%Dl，D73-甲基-葡萄糖4%D2，D8e-甲基-D-葡糖苷4%D3，D9帕拉金糖4%D4，D10D-阿洛酮糖4%D5，DllD-棉子糖4%D6，D12D-核糖4%El，E7水楊式4%E2，E8D-山梨糖醇4%E3,E9蔗糖4%E4，E10D-塔格糖4%E5，EllD-海藻糖4%E6，E12松二糖4%Fl，F7木糖醇4%F2，F8丙酮酸甲基酯4。/。F3，F9單甲基琥珀酸4%F4，F10醋酸2%F5，Flla-羥基丁酸鈉2%F6,F12a-酮戊酸2%Gl，G7L-乳酸4%G2，G8D-丙氮酸2%G3，G9L-丙氨酸2%G4，G10L-丙氨醯-甘氨酸3%G5,GllL-絲氨酸3%G6，G12腺苷2°/。Hl，H72'-脫氧腺苷2%H2，H8肌苷2%H3，H9胸腺嘧啶脫氧核苷2。/。H4，H10尿嘧啶核苷2%H5，Hll尿嘧啶核苷-5'-單磷酸酯2%H6，H12D-葡萄糖-6-磷酸酯2%(2)配製肉湯培養基①下列各物質按比例混合配製GP/MT重量％濃度物質名稱所佔比例純水80%2水合磷酸二氫鈉4.68%磷酸氫二鈉12.775%氯化鉀2.61%十水合焦磷酸鈉0.018。/。②按下列各物質配製濃度要求配製GP混合貯液g/ml物質名稱濃度GP混和試劑加水配置溶液0.475%③根據下列配製濃度要求配製以下幾種物質的水溶液g/mltableseeoriginaldocumentpage6④按下列各物質的比例混合配製肉湯培養基v/v物質名稱所佔比例純水64%GP/MT21.9%氯化銨水溶液4.4%GP混合!t液0.88%50UM葉酸水溶液0.088%8mM維生素K3亞硫酸氫鈉水溶液4.4%結晶紫水溶液4.4%(3)分裝①根據板條批量生產的數量要求將合適的步驟1配製的反應底物原液分裝到96支試管中；②根據板條批量生產的數量要求將步驟2配製的肉湯培養基加入到①的試管中；(4)加樣分裝板條使用分裝系統在96孔的相應位置對指定的鑑定板條加樣，每孔加50ul;(5)板條乾燥上述板條常溫乾燥16-18小時；(6)包裝。(7)板條存貯。全文摘要本發明提供了革蘭陽性需氧菌鑑定板。本發明鑑定板上的47個碳源和氮源組合可鑑定的革蘭陽性菌種類有300餘種，可以鑑定葡萄球菌屬、鏈球菌屬、腸球菌屬、陽性桿菌等多種不同種類的細菌，且不需要進行補充實驗就可以得出鑑定結果，操作簡單，結果準確，因而，有較大的臨床應用價值。本發明提供了革蘭陽性需氧菌鑑定板的製備方法。文檔編號C12Q1/04GK101469340SQ20071017306公開日2009年7月1日申請日期2007年12月26日優先權日2007年12月26日發明者朱駿娜,鄒豔芳,陳弛宇申請人:上海復星佰珞生物技術有限公司;上海復星醫藥(集團)股份有限公司