一種提高乳酸菌膽鹽耐受性的方法
2023-06-03 09:29:46 2
一種提高乳酸菌膽鹽耐受性的方法
【專利摘要】本發明公開了一種提高細胞壁中含穀氨醯胺和賴氨酸的乳酸菌膽鹽耐受性的方法，所述方法為含有穀氨醯胺轉氨酶的培養基培養所述乳酸菌。本發明中涉及的所述乳酸菌包括乳酸乳球菌8148菌株、植物乳桿菌亞種菌株、羅伊氏乳桿菌和乾酪乳桿菌等所有細胞壁中含穀氨醯胺和賴氨酸的乳酸菌類菌鍾，本發明優選穀氨醯胺轉氨酶在培養基中的終濃度為3～25U/mL，同時通過穀氨醯胺轉氨酶母液多次添加到培養基的方法進一步了提高乳酸菌膽鹽耐受性。本發明所述方法簡單，成本較低，易於工業化生產，通過所述方法可以顯著提高現有市售的乳酸菌類益生菌對膽鹽的抗性，有助於其在腸道內發揮功能。
【專利說明】一種提高乳酸菌膽鹽耐受性的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及提高乳酸菌膽鹽耐受性的方法，特別涉及一種提高細胞壁肽聚糖中含穀氨醯胺和賴氨酸的乳酸菌耐受膽鹽性的方法。
【背景技術】
[0002]益生菌是指來源於宿主並對宿主健康有一定促進作用的微生物活體。而已經被證明是益生菌的菌株中，大部分屬於乳酸菌。大量研究表明，能夠作為人類胃腸道中益生菌的乳酸菌具有抗氧化、降低膽固醇、增強免疫力、抗腫瘤等重要生物學功能。益生菌能夠在宿主體內有多大程度的存活量，和到達部位後的繁殖能力決定著其對宿主提供益處的力度或效果。這就要求製品中的乳酸菌能夠通過上消化道以大量的存活菌到達腸道並且定植於腸黏膜，以發揮其益處，因而乳酸菌細胞應該具有對膽鹽的耐受性。
[0003]膽鹽(Bile salt)是由肝細胞分泌的膽汁酸與甘氨酸或牛磺酸結合而形成的鈉鹽或鉀鹽。膽鹽的主要作用是幫助消化脂肪，所以膽鹽對細胞膜中磷脂、脂肪酸和膜蛋白具有一定的破壞作用，從而改變了細胞膜的滲透性，對細胞造成傷害，使乳酸菌類益生菌死亡。因而，對膽鹽具有一定的耐受性是乳酸菌能夠在腸道存活、生長並發揮功效的先決條件之一，即:能夠在正常生理膽鹽濃度脅迫後生長和代謝的菌株才可能在腸道中存活。因此，提高乳酸菌對膽鹽的耐受性是乳酸菌製品研製與開發的技術關鍵。
[0004]現有的方法主要包括從自然界分離篩選耐膽鹽的乳酸菌菌株，對現有的商業化菌株進行定向選育、誘變或基因操作，以及利用微膠囊包裹菌株，以提高其耐膽鹽的能力。這些方法在應用性方面都存在一些問題，如分離篩選兼具益生性和耐膽鹽的菌株難度較大，後續的安全性評價也需要時間和成本，並且存在著由於安全性不達標導致不能應用的問題；對於第二種方法，由於現在的消費者對純天然綠色食品的青睞和對基因修飾食品的排斥，如果對已實際應用的菌株進行定向選育、誘變或基因操作，存在著消費者接受度較低的風險；而第三種方法，目前國內外已經發展了多種微膠囊化技術應用於益生菌，但各自都存在著一些缺點，不能兼顧工業化生產與保持細菌活性之間固有的矛盾。
[0005]穀氨醯胺轉氨酶(transglutaminase,簡稱TG)是由331個氨基組成的分子量約38000的具有活性中心的單體蛋白質，其可催化蛋白質多肽發生分子內和分子間發生共價交聯，從而改善蛋白質的結構和功能，對蛋白質的性質如:發泡性，乳化性，乳化穩定性，熱穩定性、保水性和凝膠能力等效果顯著，進而改善食品的風味、口感、質地和外觀等。
[0006]目前，還尚未公開採用穀氨醯胺轉氨酶處理乳酸菌以提高其膽鹽耐受性的相關文獻資料。
【發明內容】
[0007]本發明提供一種可以提高細胞壁肽聚糖中含穀氨醯胺和賴氨酸的乳酸菌耐受膽鹽能力的方法，所述方法具有操作簡單，成本低，實用性強等特點。
[0008]一種提高細胞壁肽聚糖中含穀氨醯胺和賴氨酸的乳酸菌膽鹽耐受性的方法，所述方法為:用含有穀氨醯胺轉氨酶的培養基培養所述乳酸菌；
[0009]進一步，所述穀氨醯胺轉氨酶分至少兩次添加；
[0010]再進一步，所述穀氨醯胺轉氨酶優選分2到5次添加；
[0011]所述穀氨醯胺轉氨酶在製備培養基開始到培養結束前的時間內添加。
[0012]所述乳酸菌具體包括乳酸乳球菌8148菌株、植物乳桿菌植物亞種菌株、羅伊氏乳桿菌和乾酪乳桿菌等細胞壁肽聚糖中含穀氨醯胺和賴氨酸的乳酸菌類菌鍾；
[0013]在最後一次添加所述穀氨醯胺轉氨酶後，使穀氨醯胺轉氨酶在培養基中的終濃度為 3 ~25U/mL ；
[0014]優選穀氨醯胺轉氨酶在培養基中的終濃度為3~25U/mL ；
[0015]進一步優選穀氨醯胺轉氨酶在培養基中的終濃度為12U/mL;
[0016]進一步提高乳酸菌膽鹽耐受性的方法還包括用水配製成50~500U/mL的穀氨醯胺轉氨酶母液，用濾膜過濾，將穀氨醯胺轉氨酶母液添加到所述乳酸菌培養基中；
[0017]上述乳酸菌的培養基包括MRS液體培養基、GMl7液體培養基和MRS固體培養基。
[0018]本發明的有益效果
[0019]其一:
[0020]發明人發現凡是細胞壁肽聚糖中含穀氨醯胺和賴氨酸的乳酸菌類益生菌，都可以採用本發明的方法，有效地提高其對膽鹽的耐受性。
[0021]採用穀氨醯胺轉氨酶處理後能提高乳酸乳球菌和植物乳桿菌等的膽鹽耐受性原理如下:
[0022]革蘭氏陽性細菌細胞壁的結構簡單，主要是由肽聚糖層所構成，肽聚糖是異型多糖大分子，每一肽聚糖單體含有三個組成部分，即雙糖單位、由四個胺基酸連起來的短肽「尾」和肽「橋」。不同的革蘭氏陽性菌可能具有組成不同的短肽「尾」和肽「橋」。特別是一些革蘭氏陽性菌的短肽」尾」的組成是L-丙氨酸一D-穀氨醯胺一L-賴氨酸一D-丙氨酸，這其中恰巧具有了穀氨醯胺轉氨酶的催化底物穀氨醯胺和賴氨酸。因此，發明人研究後認為，採用穀氨醯胺轉氨酶處理乳酸菌後，使乳酸菌的細胞壁交聯度增加，加密的細胞壁可有效阻擋膽鹽分子穿過細胞壁去損傷細胞膜，從而賦予了採用穀氨醯胺轉氨酶處理後的乳酸菌抗膽鹽的優良特性。
[0023]本發明雖然能提高乳酸菌的膽鹽耐受性，但是對酸脅迫效果不明顯。酸脅迫和膽鹽脅迫對細胞的損傷原因差異很大。酸脅迫會導致胞內PH值降低，抑制胞內酶活和轉運系統的活性，造成糖酵解速率降低，從而影響細胞能量的產生。同時，胞內低PH值會誘導細胞消耗自身的能量來將胞內過多的H+泵出胞外，必然會進一步加重能量的消耗，從而嚴重抑制細胞生長。膽鹽的主要作用是幫助人體消化脂肪，所以膽鹽對細胞膜中磷脂、脂肪酸和膜蛋白具有一定的破壞作用，從而改變了細胞膜的滲透性，對細胞造成傷害。研究結果也證明了穀氨醯胺轉氨酶處理對乳酸菌細胞的酸脅迫沒有效果。
[0024]其二:
[0025]穀氨醯胺轉氨酶，穀氨醯胺轉氨酶廣泛存在於動物組織，可催化蛋白質中L-賴氨酸和穀氨醯胺之間的結合反應，因而能使蛋白質或多肽之間發生共價交聯，形成共價化合物的聚合物。人們一直都在食用含有穀氨醯胺轉氨酶催化形成Y-穀氨醯賴氨酸異肽鍵的食物如水產加工品、火腿、香腸、面類、豆腐等，因此，用穀氨醯胺轉氨酶處理乳酸菌類益生菌菌株對人體是安全的。
[0026]乳酸乳球菌一直以來這兩個亞種被人們用來作為乳製品發酵劑，具有重要的經濟價值，同時，它也是目前乳酸菌中研究最為深入的模式菌株，因此用其得到的實驗結果在很大程度上能反映出乳酸菌的共性。植物乳桿菌是人體腸道內天然存在的一種細菌，服用植物乳桿菌後，對健康人群和病患者具有特定的醫療保健作用。目前，大量的植物乳桿菌菌株作為益生菌已經得到商業化應用。
[0027]綜上所述，本發明在食品安全方面是絕對安全的，並且所研究的幾種乳酸菌具有這一類乳酸菌的代表性。
[0028]其三:
[0029]本發明方法簡單，成本較低，易於工業化生產，通過所述方法可以顯著提高現有市售的乳酸菌類益生菌對膽鹽的抗性，有助於其在腸道內發揮功能。例如:按照本實施例1中的方法用12U/mL穀氨醯胺轉氨酶處理後的乳酸乳球菌在生長1h時對0.04%膽鹽耐受性比未處理的提高了 5.63倍；按照實施例2中的方法處理後的植物乳桿菌植物亞種在生長1h時對0.04%膽鹽耐受性比未處理的提高了 7.59倍。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0030]圖1:0.04%膽鹽脅迫2h對乳酸乳球菌8148菌株生長的影響情況圖；
[0031]圖 2:穀氨醯胺轉氨酶加入方式對乳酸乳球菌8148菌株0.04%膽鹽脅迫2h耐受性的影響情況圖；
[0032]圖3:不同濃度穀氨醯胺轉氨酶處理對乳酸乳球菌8148菌株0.04%膽鹽脅迫2h耐受性的影響情況圖；
[0033]圖4:不同濃度穀氨醯胺轉氨酶處理對植物乳桿菌植物亞種菌株0.04%膽鹽脅迫2h耐受性的影響情況圖。
【具體實施方式】
[0034]實施例1
[0035]一種通過穀氨醯胺轉氨酶處理乳酸乳球菌8148菌株，提高其耐受膽鹽能力的方法。
[0036]本實施例中，M17肉湯培養基粉末購買自青島海博。M17肉湯培養基是用42.3gM17肉湯培養基粉末加熱溶解於100ml蒸餾水中，121°C高壓滅菌15分鐘，備用。
[0037]所述乳酸乳球菌8148菌株來自中國工業微生物菌種保藏管理中心，CICC編號20406。
[0038]本發明的操作步驟依次為:
[0039]1、配製GM17液體培養基:具體方法是在M17肉湯培養基中添加終濃度為5g/L葡萄糖，得到GM17液體培養基。
[0040]2、接種:將活化好的乳酸乳球菌8148菌株以5%的量接種於GM17培養基中，30°C下靜置培養4h作為種子液。
[0041]3、培養:再以5%的接種量將種子液接種於GM17培養基中培養乳酸乳球菌8148菌株。
[0042]4、穀氨醯胺轉氨酶溶液配製:用水配製成200U/mL的穀氨醯胺轉氨酶母液，用
0.45 μ m濾膜過濾後，放置4±2°C的條件下冷藏備用。
[0043]5、穀氨醯胺轉氨酶處理:分別於2h、4h、6h加入等量步驟4得到的穀氨醯胺轉氨酶母液，使穀氨醯胺轉氨酶在培養基中的終濃度為3~25U/mL。
[0044]6、靜置培養:靜置培養至8h，得到穀氨醯胺轉氨酶處理後的乳酸乳球菌8148菌株。
[0045]其中，本實施例選擇GM17培養基是由於乳酸乳球菌8148菌株在GM17培養基的生長較好，本實施例的方法不限於培養基，本實施例的GM17培養基可以替換為凡是能夠使乳酸乳球菌8148菌株生長的液體培養基。
[0046] 脅迫抗性的測定一般採用存活率法，此法需要多次10倍稀釋，誤差難以避免。為減少由於稀釋帶來的誤差，本發明採用基於比濁法的耐受率法來測定乳酸乳球菌8148菌株的膽鹽耐受性。乳酸乳球菌8148菌株在0.04%膽鹽脅迫2h後直接接種GM17培養基進行培養。由於膽鹽對細胞的損傷，導致活細胞數減少，延滯期明顯延長，對數期生長速率相對較慢，但是最終生物量與未脅迫的對照組一致。細胞對膽鹽的耐受性越強，則生物量與未受脅迫的對照組的越接近，耐受率越高，即抗性越強，反之亦然。如圖1所示，膽鹽耐受率曲線呈現出前期迅速降低至最低值，後期逐漸升高至100%的特點。曲線的後期足以反映出細胞經膽鹽脅迫後活細胞的生長能力，即對膽鹽脅迫的耐受性。因此，膽鹽耐受率曲線的後期上升階段的情況可以用來表徵細胞對膽鹽脅迫的抗性大小。
[0047]膽鹽耐受率的具體測定方法為:菌株培養8h後，將5mL菌液離心，離心條件為4000r/min, lOmin，棄上清液，將細胞沉澱用生理鹽水洗滌一次，重懸於含0.04% (w/v)膽鹽的生理鹽水中，置37°C下水浴2h。在4000r/min, 1min下離心，生理鹽水洗滌一次。用5mL的培養基重懸細胞沉澱，充分混勻作為種子液，以5%的接種量接種於培養基中，於Oh、9h、10h、llh、12h、13h測生物量0D_。同時用生理鹽水代替膽鹽溶液進行相同的實驗操作，以此作為對照。根據公式計算膽鹽脅迫耐受率。
[0048]膽鹽脅迫耐受率(％ ) = OD脅迫/OD對照*100%
[0049]對照實驗:第一組為不加穀氨醯胺轉氨酶的實驗組，即按照實施例1的步驟1，2，3，6操作後，按照上述方法測定其膽鹽脅迫耐受率；第二組為一次性添加穀氨醯胺轉氨酶至終濃度的實驗組，即:將實施例1中的步驟5替換為「在培養的O時刻在培養基中一次性添加穀氨醯胺轉氨酶至終濃度3-25U/mL」，其他同實施例1 ;第三組為實施例1的實驗組；
[0050]其中，第二組和第三組中，添加穀氨醯胺轉氨酶至終濃度9U/mL的實驗結果如表1記載。
[0051]表1穀氨醯胺轉氨酶加入方式對乳酸乳球菌8148菌株0.04%膽鹽耐受性的影響
[0052]
【權利要求】
1.一種提高乳酸菌膽鹽耐受性的方法，所述乳酸菌的細胞壁肽聚糖中含穀氨醯胺和賴氨酸，其特徵在於:所述方法是用含有穀氨醯胺轉氨酶的培養基培養所述乳酸菌。
2.根據權利要求1所述的提高乳酸菌膽鹽耐受性的方法，其特徵在於:至少一次添加所述穀氨醯胺轉氨酶。
3.根據權利要求2所述的提高乳酸菌膽鹽耐受性的方法，其特徵在於:所述穀氨醯胺轉氨酶分2到5次添加。
4.根據權利要求1所述的提高乳酸菌膽鹽耐受性的方法，其特徵在於:所述穀氨醯胺轉氨酶在製備培養基開始到培養結束前的時間內添加。
5.根據權利要求1所述的提高乳酸菌膽鹽耐受性的方法，其特徵在於:所述乳酸菌包括乳酸乳球菌8148菌株、植物乳桿菌亞種菌株、羅伊氏乳桿菌和乾酪乳桿菌。
6.根據權利要求1-5任意一項所述的提高乳酸菌膽鹽耐受性的方法，其特徵在於:所述穀氨醯胺轉氨酶在培養基中的終濃度為3~25U/mL。
7.根據權利要求6所述的提高乳酸菌膽鹽耐受性的方法，其特徵在於:所述穀氨醯胺轉氨酶在培養基中的終濃度為12U/mL。
8.根據權利要求1所述的提高乳酸菌膽鹽耐受性的方法，其特徵在於:還包括用水和穀氨醯胺轉氨酶配製成50~500U/mL的穀氨醯胺轉氨酶母液，用濾膜過濾，通過過濾後的穀氨醯胺轉氨酶母液將穀氨醯胺轉氨酶添加到所述乳酸菌培養基中。
9.根據權利要求1所述的提高乳酸菌膽鹽耐受性的方法，其特徵在於:所述培養基為液體培養基或固體培養基。
10.根據權利要求9所述的提高乳酸菌膽鹽耐受性的方法，其特徵在於:所述培養基包括MRS液體培養基、GMl7液體培養基和MRS固體培養基。
【文檔編號】C12R1/25GK104178447SQ201410445527
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2014年9月3日 優先權日:2014年9月3日
【發明者】付瑞燕, 尤元麗, 黃潔潔 申請人:安徽農業大學