具有親水性塗層的多孔膜及其製備和使用方法

2023-06-03 19:00:31

具有親水性塗層的多孔膜及其製備和使用方法
【專利摘要】本發明描述了一種包含接枝到多孔膜的聚合親水性塗層的改性多孔膜。所述接枝到多孔膜的聚合親水性塗層包含例如PEG部分，例如PEGMA、PEGDA或TMPET，其中在多孔膜上的所述聚合親水性塗層降低不期望的材料與多孔膜的非特異性結合併且在免疫測定、體外診斷測試和護理點測試中提高信號與噪聲比。還公開了製備這些改性多孔膜的方法。
【專利說明】具有親水性塗層的多孔膜及其製備和使用方法
[0001] 相關申請的交叉引用 本申請要求2011年12月30日提交的美國專利申請號13/340, 793和2012年1月31 日提交的13/362, 793的優先權；它們的公開內容通過引用而全文結合到本文中。 發明領域
[0002] 本公開總體涉及永久接枝親水性塗層的多孔膜，使得與多孔膜的非特異性結合最 小化，該多孔膜用於在多孔膜上固定一種或多種特定的生物分子供進一步分析。還描述了 製備和使用具有這些親水性塗層的改性多孔膜的方法。
[0003] 背景 多孔膜（例如硝化纖維素膜）常規地用於多種過程，包括需要固定一種或多種生物分 子的生物學應用。這些生物分子包括但不限於蛋白質（例如，抗體）和核酸（例如，脫氧核 糖核酸（DNA)和核糖核酸（RNA))。本領域描述了能夠既固定關注的特定生物分子又同時使 幹擾性能的各種分子的非特異性結合最小化的膜，所述性能為例如免疫測定、體外診斷測 試（特別是護理點診斷方法）和在生物學樣品（例如，血液、尿、唾液、痰、其它身體分泌物、 細胞和組織樣品）中分析物或生物分子分離的性能。發現這樣的膜用於多種生物學過程和 醫療技術。
[0004] 硝化纖維素膜呈現硝化纖維素膜和生物分子之間基本上非特異性的相互作用。研 究人員傳統上依賴該被動關聯作為在多種"捕集"類型固定方法中使用硝化纖維素膜的基 礎。然而，對硝化纖維素膜和關注的生物分子之間的該被動相互作用的依賴導致在許多生 物學應用中成功使用硝化纖維素膜的複雜化。該技術必然限制可在硝化纖維素膜上固定的 生物分子的量，同樣有問題的是，還允許不期望的分子（例如，不是關注的生物分子）與硝 化纖維素膜的非特異性結合。降低非特異性結合將允許提高關注的生物分子與硝化纖維素 膜的特異性結合併且還降低信號（例如，期望的生物分子與硝化纖維素膜的期望的結合） 與噪聲（例如，不期望的材料與硝化纖維素的非特異性結合）比。降低信號與噪聲比將提 高例如免疫測定、體外診斷測試（特別是護理點診斷方法）和在生物學樣品（例如，血液、 淋巴、尿、唾液、痰、其它身體分泌物、細胞和組織樣品）中分析物或生物分子與其它材料的 分離方法的性能和靈敏度。本領域中描述了在例如免疫測定中降低信號與噪聲比。
[0005] 本領域需要將多孔膜改性（例如，化學改性）的新的組合物和方法，以改進關注的 生物分子（例如，蛋白質和核酸）與多孔膜基底的固定和結合。這樣的改性多孔膜（包括 改性的硝化纖維素膜）適用於例如免疫測定、體外診斷測試（例如，護理點診斷應用）和在 生物學樣品中分離關注的生物分子的技術。本領域需要塗布有化合物以降低與膜的非特異 性結合的多孔膜，更特別是硝化纖維素膜。這樣的膜將改進例如許多免疫測定的性能和靈 敏度。
[0006] 本領域需要將多孔膜（例如，硝化纖維素膜）改性（例如，化學改性）以降低不期 望的材料與多孔膜基底的非特異性結合的新方法。塗布有化合物以降低與膜的非特異性結 合的多孔膜（更特別是硝化纖維素膜）將是有利的。相對於在使用未改性的多孔（例如， 硝化纖維素膜）實施的免疫測定中觀察到的，通過降低與膜的非特異性結合，通過潛在地 消除對於例如在免疫測定中使用以使非特異性結合最小化的傳統阻斷劑的需要，和通過提 高信號與噪聲比，這樣的膜將改進例如許多免疫測定的性能和靈敏度。
[0007] 概述 本文描述改性多孔膜，特別是硝化纖維素膜。在一個具體的實施方案中，硝化纖維素 膜包含與硝化纖維素膜鍵合的聚合親水性塗層。聚合親水性塗層通常與硝化纖維素膜永久 (例如，共價）鍵合。聚合親水性塗層可通過任何方法與硝化纖維素膜鍵合，包括通過使多 孔（例如，硝化纖維素）膜暴露於電子束（電子束）輻射。
[0008] 本文的組合物包括改性多孔膜，例如硝化纖維素膜，其包含通常與膜永久鍵合的 聚合親水性塗層。所述組合物適用於依賴一種或多種生物分子例如蛋白質（例如，抗體） 和核酸（例如，DNA或RNA)與多孔膜（包括但不限於硝化纖維素膜）結合的方法。在特定 的方面，所述組合物用於免疫測定、體外診斷測試、從生物學樣品（例如，血液、尿、唾液、痰 和細胞或組織的樣品）鑑定或分離關注的生物分子的技術，和需要在多孔膜基底（如硝化 纖維素膜）上固定生物分子的各種其它生物學方法。多孔膜（特別是硝化纖維素膜）包含 與膜鍵合的聚合親水性塗層，其中所述膜降低不期望的材料與多孔膜（更特別是硝化纖維 素膜）的非特異性結合。在本文描述的硝化纖維素膜上的聚合親水性塗層可包括但不限於 聚乙二醇（PEG)部分、聚乙烯醇、羥基、帶負電荷的離子基團、帶正電荷的離子基團、兩性離 子基團，或它們的任何組合。
[0009] 附圖 當參考附圖，閱讀以下詳細說明時，化學改性的多孔膜的這些和其它特徵、方面和優點 將變得更好理解，其中由始至終在附圖中，相似的符號代表相似的部件，其中： 圖1示意性表示通過電子束輻射在硝化纖維素膜上的聚合親水性塗層的機構。
[0010] 圖2提供使用本文描述的改性多孔膜的受孕測試的結果。測定的細節和結果的解 釋在實施例4中陳述。
[0011] 詳述 本文提供包含至少一個與多孔膜（例如，硝化纖維素膜）鍵合的聚合親水性塗層的改 性多孔膜（特別是硝化纖維素膜）。多孔膜（例如硝化纖維素膜）傳統上用於在多孔固體 基底上固定生物分子（例如，DNA、RNA或蛋白質）。本文使用的術語"改性"，特別是提及所 公開的多孔膜（例如，硝化纖維素膜）時，旨在包括對膜的任何改變，例如，對初始的未改性 的膜的化學改變。本發明的"改性"多孔膜（例如，硝化纖維素膜）可為包含通過電子束輻 射接枝到硝化纖維素膜的聚合親水性塗層的硝化纖維素膜，如以下描述。親水性塗層包含 例如聚乙二醇部分、聚乙烯醇、羥基、帶負電荷的離子基團、帶正電荷的離子基團、兩性離子 基團，或它們的任何組合。在某些方面，聚合親水性塗層包含PEG部分，例如PEGMA、PEGDA 或TMPET。本公開包括所有分子量的PEG部分。
[0012] 包含聚合親水性塗層的示例性改性多孔膜的示意圖在以下提供並且在圖1中陳 述。如圖中所示，在某些方面，本公開的多孔膜具有式（I)的結構，其包括接枝到多孔膜（例 如，硝化纖維素膜）的聚合親水性塗層，其中所述聚合物親水性塗層包含：1)電子（電子 束）反應性部分的可變長度鏈單體的聚合物（標記為聚（A)x，其中X為存在的聚合物的數 量，並且範圍為1、2、3、4,持續到包括所有整數；2)在（聚（A)x)之間形成鍵合的鍵；和3) 標記為B基團的官能團，其促進與化學基團（例如，在關注的生物分子上存在的胺基）的反 應，從而促進在多孔膜上固定生物分子。聚合親水性塗層（例如，在以下示意圖中標記的 "聚（A)x_鍵-B"）包含數個組分（例如，聚（A)x聚合物、鍵和官能部分B)，並且接枝（例 如，共價鍵合）到多孔膜。參見以下和圖1關於聚合親水性塗層的組分和功能的更詳細的 描述。
[0013] 為了更清楚和簡明地描述和指出要求保護的本發明的主題，對於用於以下說明和 所附權利要求的特定術語提供以下定義。在整個說明書中，特定術語的舉例應看作是非限 制性實例。
[0014] 本文使用的術語"非特異性結合"指在多孔膜（例如，硝化纖維素膜）上生物分子 的連接，其通過生物分子和膜的被動相互作用而發生，並且獨立於生物分子和膜之間的任 何特定的主動相互作用。"非特異性結合"還通常稱為與多孔膜（特別是硝化纖維素膜）的 "背景結合"。非特異性結合的一個實例包括僅由在溶液中隨機相遇而引起的DNA分子與硝 化纖維素膜的連接。
[0015] 本文使用的術語"改性的"，特別是提及所公開的多孔膜（例如，硝化纖維素膜） 時，旨在包括對膜的任何改變，例如，對初始的未改性的多孔膜（例如，硝化纖維素膜）基底 的化學改變。本文陳述的"改性"多孔膜（更特別是硝化纖維素膜）可為包含與硝化纖維 素膜鍵合的聚合親水性塗層的改性（例如，化學改性）硝化纖維素膜。在具體的實施方案 中，聚合親水性塗層包含PEG部分，包括但不限於PEGMA、PEGDA或TMPET。
[0016] 還提供了用於製備具有與多孔膜（例如，硝化纖維素膜）鍵合（通常永久鍵合） 的聚合親水性塗層的多孔膜（例如，硝化纖維素膜）的方法。在一些實施方案中，如下使聚 合親水性塗層在多孔膜（例如硝化纖維素膜）上鍵合：提供未改性的多孔膜（例如，硝化纖 維素膜），在親水性化合物的含水溶液中浸沒膜，和使膜暴露於電子束輻射，從而在多孔膜 (例如，硝化纖維素膜）上使親水性塗層聚合。例如，使硝化纖維素膜浸沒在親水性化合物 (例如，PEG部分，例如PEGMA、PEGDA或TMPET)的含水溶液中，隨後經歷電子束輻射。或者， 在本發明的其它方面，如下製備改性多孔膜，首先使多孔膜（例如，硝化纖維素膜）經歷電 子束輻射，接著在親水性化合物（例如PEGMA、PEGDA或TMPET)的含水溶液（例如，A-鍵-B 的含水溶液）中浸沒膜。本公開包括生產本文描述的改性多孔膜（例如，硝化纖維素膜） 基底的方法，例如，採用浸沒和電子束輻射步驟的方法步驟的順序。
[0017] 如以下更詳細描述的，當在用於製備改性多孔膜的方法的情境中使用時，術語在 例如親水性化合物（例如PEG部分，特別是PEGMA、PEGDA或TMPET，如在權利要求書中敘述） 的含水溶液中"浸沒"多孔膜通常通過以下實現：在親水性化合物（例如，PEG部分，包括但 不限於PEGMA、PEGDA或TMPET)的含水溶液中浸漬整個多孔膜（更具體為硝化纖維素膜）， 隨後除去任何過量的溶液。
[0018] 雖然在整個本申請中敘述硝化纖維素膜，但是本公開包括各種多孔膜。僅為了示 例性目的並且無任何預期限制，未改性的多孔膜可包括纖維素膜、乙酸纖維素膜、再生纖維 素膜、硝化纖維素混合酯膜、聚醚碸膜、尼龍膜、聚烯烴膜、聚酯膜、聚碳酸酯膜、聚丙烯膜、 聚偏二氟乙烯膜、聚乙烯膜、聚苯乙烯膜、聚氨酯膜、聚苯醚膜、聚（四氟乙烯-共聚-六氟 丙烯）膜，或上述多孔膜的兩種或更多種的任何組合。
[0019] 硝化纖維素膜目前廣泛用於多種需要在固相材料上固定特定的生物分子（例如， DNA、RNA或蛋白質例如抗體）的生物學應用。"多孔膜"旨在不帶限制地表示任何多孔膜，包 括任何市售可得的或非市售可得的多孔膜，特別是硝化纖維素膜，更特別是市售可得的硝 化纖維素膜。在本公開的某些方面，如在圖1中陳述的，將硝化纖維素膜化學改性，以包含 PEG的聚合親水性塗層，其中所述聚合親水性塗層降低與硝化纖維素膜的非特異性結合。由 硝化纖維素聚合物製備的硝化纖維素膜對於DNA、RNA和蛋白質具有強親和力，並且防止這 些生物分子變性。
[0020] 本申請使用的"硝化纖維素膜"包括含有任何氮濃度、多種多樣的孔尺寸和可變的 膜厚度的所有那些多孔膜產品。在特定的實施方案中，多孔膜的孔尺寸可在0. 01-50微米 範圍。此外，在整個多孔膜中孔直徑可為均勻的，或者，孔直徑可為不規則的。選擇具有適 當的氮含量、孔尺寸和膜厚度的硝化纖維素膜以實現特定的期望結果，完全在本領域技術 人員的技術和知識以內。此外，專業技術人員將立即理解和認識到短語"硝化纖維素膜"的 含義，並且這樣的硝化纖維素膜包括例如市售可得的硝化纖維素膜，可為"無背襯"膜，或者 含有"背襯材料"或"背襯支撐"例如聚酯（PE)。關於是使用"無背襯"還是"背襯"多孔膜 (例如，硝化纖維素膜）的選擇取決於要實施的具體應用，並且進行這樣的選擇完全在本領 域普通技術人員的知識以內。
[0021] 具有任何氮濃度、孔尺寸或存在或不存在背襯支撐的硝化纖維素膜均包括在本文 使用的術語"硝化纖維素膜"中。硝化纖維素膜具有多種化學和物理性質，並且常規地用於 需要例如將關注的生物分子（例如，DNA、RNA或蛋白質例如抗體）固定到多孔膜（例如，硝 化纖維素膜），或用於在這樣的膜上收集生物分子以在待分析的生物學樣品中將它們與其 它蛋白質、核酸和生物分子等分離的生物學技術。任何硝化纖維素膜可用於本公開。
[0022] 雖然在整個本申請中提及多孔膜，但組合物、製備方法和使用方法同樣適用於可 用於固定生物分子的其它固相材料，如在本文的權利要求所敘述。這樣的固相材料包括但 不限於玻璃珠、玻璃纖維、膠乳珠、結節、餅、納米顆粒、空心膜管，和上述固相材料的兩種或 更多種的任何組合。本領域技術人員將能選擇適用於特定的使用方法（例如，免疫測定） 的多孔膜（特別是硝化纖維素膜）。雖然多孔膜（例如，硝化纖維素膜。在本發明的某些方 面，硝化纖維素膜的孔尺寸在〇. 01-50 Mm範圍。
[0023] 術語"生物學樣品"包括但不限於得自人或非人生物體的血液、血清、淋巴、唾液、 粘液、尿、其它身體分泌物、細胞和組織部分。生物學樣品可由自身經歷診斷測試（例如，血 糖監測）的個體或由經過訓練的醫療專業人員通過多種技術得到，所述多種技術包括例如 用針吸出血液，或者刮或擦特定的區域，例如患者皮膚上的傷口。用於收集各種生物學樣品 的方法為本領域公知的。
[0024] 本文使用的"免疫測定"在其最寬的含義內包括基於抗體及其相應的抗原之間的 相互作用的任何技術。這樣的測定基於抗體以高特異性與一組或非常有限組的類似分子 (例如，抗原）結合的獨特能力。與抗體結合的分子稱為抗原。可使用抗原或抗體作為"捕 獲"分子來"俘獲"抗體-抗原對的其它成員，進行免疫測定。本文使用的術語"免疫測定" 還包括利用抗體來檢測生物學樣品（例如，生物化學反應的代謝物）中的非蛋白質生物分 子的那些測定。
[0025] 免疫測定的示例性但非窮盡的列舉包括側流測定（例如，家庭受孕測試）、放射性 免疫測定（RIA)、酶免疫測定（EIA)、酶聯免疫吸附劑測定（ELISA)、螢光免疫測定和化學發 光免疫測定。該領域專業技術人員具有選擇和實施適當的方法用於具體的情況所需的技 術，以及實施這些免疫測定的技術，以及解釋結果的技術。免疫測定可產生定性或定量的結 果，取決於選擇的具體的檢測方法。
[0026] 側流測定為常見的免疫測定，主要是由於其容易使用，並且包括例如市售可得的 家庭-受孕測試和常規藥物測試的產品。側流測定是特別有利的，因為裝置和方法通常簡 單使用並且簡單解釋測試結果，即使由沒有接受正式醫療訓練的個體進行。側流裝置和方 法旨在檢測在生物學樣品（例如，尿）中存在或不存在靶分析物或生物分子（例如，在側流 家庭受孕測試中的人絨膜促性腺激素（hCG))。雖然在側流裝置和測定中存在變化，但這些 測試常用於家庭測試、護理點測試和實驗室使用。側流測定通常以方便的"量尺"形式呈現， 如在以下實施例中描述的，其中待測試的生物學樣品通過毛細作用沿著固體基底（例如， 多孔膜，通常為硝化纖維素膜）流動。在某些形式的側流測定中，將量尺浸沒在生物學樣品 中，當生物學樣品向上流動到測試條紋時，其遇到事先印在量尺上的一種或多種試劑，從而 遇到已事先印有例如抗體或抗原（例如，hCG)的測試條紋上的線或區域。當生物學樣品遇 到該試劑時，產生信號以指示對於分析物或關注的生物分子的存在，該測試為陽性還是陰 性（例如，通常在家庭受孕測試中，在檢測hCG中，裸眼可見的線指示患者的尿中存在hCG)。
[0027] 側流裝置和方法為本領域公知的。參見，例如，美國專利號4, 094, 647 ; 4, 313, 734 ；4, 857, 453 ；5, 073, 484 ；5, 559, 041 ；5, 571, 726 ；5, 578, 577 ；5, 591, 645 ； 6, 187, 598 ;6, 352, 862 ;和6, 485, 982 ;均通過引用而全文結合到本文中。在已知的例如側 流裝置和測定中包括本公開的改性多孔膜（例如包含親水性聚合物的聚合塗層的改性硝 化纖維素膜）將顯著改進這樣的側流裝置和免疫測定的性能、靈敏度和特異性，降低得到 準確測試結果所需的分析物或生物分子的濃度，和降低檢測存在或不存在分析物或生物分 子的時間，從而使獲得測試結果所需的時間最小化。
[0028] 所有抗體為蛋白質，更尤其是糖蛋白，並且對關注的抗原（例如，多肽的一部分） 呈現結合特異性。術語"抗體"以最寬的含義使用，並且涵蓋完全裝配的抗體、可結合抗原的 抗體碎片（例如，Fab'、F'（ab)2、Fv、單鏈抗體、雙抗體）和包含前述的重組體肽。"抗體碎 片"包含完整的抗體的一部分，優選完整的抗體的抗原-結合的或可變的區域。抗體碎片的 實例包括Fab、Fab'、F(ab'）2和Fv碎片、雙抗體和線性抗體（Zapata等人（1995) Protein Eng. 8(10):1057 1062)、單鏈抗體分子和由抗體碎片形成的多-特異性抗體。任何抗體或 抗體碎片可用於本發明的實踐。
[0029] 在本發明的某些方面，需要檢測在固相材料（包括但不限於硝化纖維素膜）上結 合或固定的抗體。所公開的發明包括本領域已知的用於檢測與硝化纖維素膜結合的抗體 的任何方法。適當的抗體結合檢測技術的確定和優化為標準的，並且完全在本領域技術人 員的常規能力以內。在一些實施方案中，通過使抗體與可檢測物質偶聯，可促進檢測抗體結 合。可檢測物質的實例包括各種酶、修復基團、螢光材料、發光材料、生物發光材料和放射 性材料。示例性合適的酶包括辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶、β -半乳糖苷酶或乙醯膽鹼脂 酶；合適的修復基團複合物的實例包括抗生物素蛋白鏈菌素/生物素和抗生物素蛋白/生 物素；合適的螢光材料的實例包括傘形酮、螢光素、螢光素異硫氰酸酯（FITC)、若丹明、二 氯三嗪基胺螢光素、丹磺醯氯或藻紅蛋白；可與抗體偶聯的可檢測的發光材料包括但不限 於魯米諾；生物發光材料的實例包括螢光素酶、螢光素和水母發光蛋白；而用於檢測抗體 結合的合適的放射性材料的實例包括125I、131I、35S或 3h。
[0030] 包含例如PEG的聚合物塗層的改性多孔膜可被進一步改性，以包含在多孔膜上固 定的親水性化合物。在包含聚合塗層的改性多孔膜上引入親水性化合物可用作阻斷劑，以 降低與多孔膜（例如，硝化纖維素膜）的非特異性背景結合。使與多孔膜的非特異性背景 結合最小化改進信號與噪聲比，例如在免疫測定中，該免疫測定基於在多孔膜上固定的抗 體的特定相互作用和樣品（正在對其分析該生物分子的存在或量）中的關注的特定生物分 子（例如，蛋白質）。
[0031] 在本發明的某些方面，如上所述，使用親水性化合物的含水溶液製備要求保護的 改性硝化纖維素膜。親水性化合物的溶液還可包含助溶劑，以改進親水性化合物在水中的 溶解度。例如，表面活性劑更特別是非離子表面活性劑（例如，聚氧乙烯（20)脫水山梨糖 醇單月桂酸酯（Tween-20?))可用作助溶劑，以提高例如PEG在水中的溶解度。本領域技術 人員將認識到必須通過實驗確定和優化提高例如PEG (例如，PEGMA、PEGDA或TMPET)的溶 解度所需的特定助溶劑（例如，非離子表面活性劑，例如聚氧乙烯（20)脫水山梨糖醇單月 桂酸酯（Tween-20?))的適當量。
[0032] 選擇在多孔膜（特別是硝化纖維素膜）上接枝聚合物塗層的方法中使用的電子束 輻射的劑量，使得與硝化纖維素膜鍵合的聚合親水性塗層的量最大化，同時還限制已知由 電子束輻射引起的多孔膜（例如，硝化纖維素膜）的降解。本領域技術人員將認識到，用於 製備本發明的改性多孔膜的電子束輻射的適當劑量需要通過實驗優化。在具體的實施方案 中，在製備改性多孔膜的方法中使用的電子束輻射的劑量可在小於1 kGy-約50 kGy範圍。 優化參數（例如聚合親水性塗層的量、任選的表面活性劑和適用於本發明的方法的電子束 輻射的劑量）的測定設計為標準的，並且完全在本領域技術人員常規能力以內。
[0033] 本發明的改性多孔膜適用於各種生物學應用，其取決於在多孔膜（例如，硝化纖 維素膜）上固定生物分子，包括但不限於免疫測定、體外診斷測試和用於分離關注的生物 分子的技術。硝化纖維素膜由於它們固定核酸（例如，DNA和RNA)用於DNA印跡和RNA印 跡的獨特能力以及它們對胺基酸（例如，蛋白質）的結合親和力而特別用於生物學技術。作 為這些性質的結果，硝化纖維素膜在其中抗原-抗體結合提供測試結果（例如，家庭受孕測 試）的診斷測試中廣泛用作基底。
[0034] 雖然未改性的硝化纖維素膜結合生物分子（例如核酸和蛋白質）的能力是有益 的，但這些膜的改性降低與硝化纖維素膜的非特異性結合促進固定生物分子（例如，DNA、 RNA和蛋白質），比起未改性的多孔膜提供顯著的優點。
[0035] 因此，在本發明的某些方面，提供用於改進使用硝化纖維素膜用於固定生物分子 的免疫測定的靈敏度的方法，其中所述用於免疫測定的硝化纖維素膜為包含與硝化纖維素 膜鍵合的聚合親水性塗層的硝化纖維素膜。雖然本文描述的方法可用於實踐任何免疫測 定，在某些實施方案中，免疫測定包括但不限於側流免疫測定、放射性免疫測定、酶免疫測 定（EIA)、酶聯免疫吸附劑測定（ELISA)、螢光免疫測定和化學發光免疫測定。
[0036] 本公開包括用於改進免疫測定的性能的方法。短語"改進免疫測定的性能"旨在 包括由使用本發明的改性多孔膜引起的多種有利性質，包括但不限於：使不期望的材料與 改性多孔膜的非特異性結合最小化（或者稱為降低背景結合），消除對於使用免疫測定的 性能傳統所需的阻斷劑的需要，提高信號與噪聲比，和通過使非特異性結合最小化而改進 將關注的特定生物分子固定到多孔膜。
[0037] 在一個具體的實施方案中，用於改進使用多孔膜用於固定生物分子的免疫測定的 性能的方法包括提供具有式（I)的結構的多孔膜，其中式（I)為：
【權利要求】
1. 一種具有式α)的結構的多孔膜，其中式α)為：
其中Α為電子束（電子束）反應性部分，其中聚（Α)χ為所述電子束反應性部分的聚合 物，X為存在於所述聚（Α)χ聚合物中的Α單體的數量；其中鍵在所述聚（Α)χ聚合物和Β基 團之間形成鍵合，並且其中聚（Α)χ-鍵-Β為共價接枝到所述多孔膜的聚合親水性塗層。
2. 權利要求1的多孔膜，其中所述膜選自硝化纖維素膜、纖維素膜、乙酸纖維素膜、再 生纖維素膜、硝化纖維素混合酯膜、聚醚碸膜、尼龍膜、聚烯烴膜、聚酯膜、聚碳酸酯膜、聚 丙烯膜、聚偏二氟乙烯膜、聚乙烯膜、聚苯乙烯膜、聚氨酯膜、聚苯醚膜、聚（四氟乙烯-共 聚-六氟丙烯）膜，和上述膜中的兩種或更多種的任何組合。
3. 權利要求2的多孔膜，其中所述多孔膜為包含與硝化纖維素膜鍵合的聚合親水性塗 層的硝化纖維素膜。
4. 權利要求1的多孔膜，其中所述電子束反應性部分Α選自甲基丙烯酸酯、丙烯酸酯、 丙烯醯胺、乙烯基酮、苯乙烯、乙烯基醚、含乙烯基的部分、含烯丙基的部分、基於苄基的化 合物、基於叔碳（CHR3)的化合物，和上述官能部分的兩種或更多種的任何組合。
5. 權利要求1的多孔膜，其中所述鍵為酯、脂族、芳族、親水性化合物、雜芳族化合物， 或上述鍵的兩種或更多種的任何組合。
6. 權利要求1的多孔膜，其中所述B基團為親水性化合物。
7. 權利要求6的多孔膜，其中所述親水性化合物為PEG部分，並且其中所述PEG部分選 自 PEGMA、PEGDA 和 TMPET。
8. 權利要求1的多孔膜，其中相對於與未改性的多孔膜的非特異性結合，所述聚合親 水性塗層顯示不期望的材料的非特異性結合降低。
9. 一種用於改進使用多孔膜用於固定生物分子的免疫測定的性能的方法，所述方法 包括： a)提供具有式（I)的結構的多孔膜，其中式（I)為：
其中A為電子束（電子束）反應性部分，其中聚（A)x為所述電子束反應性部分的聚合 物，X為存在於所述聚（A) x聚合物中的A單體的數量；其中鍵在所述聚（A) x聚合物和B基 團之間形成鍵合，並且其中聚（A)x-鍵-B為共價接枝到所述多孔膜的聚合親水性塗層； b) 在所述多孔膜上固定與關注的抗原結合的第一抗體； c) 用與所述抗原結合的第二抗體培育生物學樣品，其中所述第二抗體與可檢測物質綴 合； d) 用包含所述第二抗體的生物學樣品培育包含在其上固定的所述第一抗體的多孔膜； 和 e) 使用與所述第二抗體結合的可檢測物質，通過檢測所述第二抗體是否與所述多孔膜 結合，測定在所述生物學樣品中是否存在所述抗原。
10. 權利要求9的方法，所述方法還包括在步驟（d)之後洗滌所述多孔膜，以除去未結 合的材料。
11. 權利要求10的方法，其中洗滌所述多孔膜還包括使用非離子表面活性劑。
12. 權利要求9的方法，其中與所述第二抗體綴合的所述可檢測物質選自酶、修復基 團、螢光染料、發光材料、生物發光材料、放射性材料和金顆粒。
13. 權利要求9的方法，其中所述多孔膜選自其中膜選自：硝化纖維素膜、纖維素膜、乙 酸纖維素膜、再生纖維素膜、硝化纖維素混合酯膜、聚醚碸膜、尼龍膜、聚烯烴膜、聚酯膜、聚 碳酸酯膜、聚丙烯膜、聚偏二氟乙烯膜、聚乙烯膜、聚苯乙烯膜、聚氨酯膜、聚苯醚膜、聚（四 氟乙烯-共聚-六氟丙烯）膜，和上述膜中的兩種或更多種的任何組合。
14. 權利要求13的方法，其中所述多孔膜為硝化纖維素膜。
15. 權利要求9的方法，其中所述電子束反應性部分A選自甲基丙烯酸酯、丙烯酸酯、 丙烯醯胺、乙烯基酮、苯乙烯、乙烯基醚、含乙烯基的部分、含烯丙基的部分、基於苄基的化 合物、基於叔碳（CHR3)的化合物，和上述官能部分的兩種或更多種的任何組合。
16. 權利要求9的方法，其中所述鍵為酯、脂族、芳族、親水性化合物、雜芳族化合物，或 上述鍵的兩種或更多種的任何組合。
17. 權利要求9的方法，其中所述B基團為親水性化合物。
18. 權利要求17的方法，其中所述親水性化合物為PEG部分，並且其中所述PEG部分選 自 PEGMA、PEGDA 和 TMPET。
19. 權利要求9的方法，其中所述免疫測定選自側流免疫測定、放射性免疫測定、酶免 疫測定（EIA)、酶聯免疫吸附劑測定（ELISA)、螢光免疫測定和化學發光免疫測定。
20. 權利要求9的方法，其中所述生物學樣品為血液、血清、淋巴、尿、唾液、粘液、身體 分泌物、細胞或組織。
21. 權利要求9的方法，其中所述抗原選自細菌、病毒、真菌、激素和用於癌症、心臟功 能不良、心臟病發作或炎性過程的蛋白質標記物。
22. 權利要求9的方法，其中步驟（a)的多孔膜使用消除在所述免疫測定中對使用阻 斷劑的需要。
23. 權利要求9的方法，其中所述方法在固體載體上實施，其中所述固體載體為微量滴 定板或載玻片。
24. 權利要求9的方法，其中所述方法允許檢測所述生物學樣品中的兩種或更多種抗 原。
25. -種用於改進使用多孔膜用於固定生物分子的免疫測定的性能的方法，所述方法 包括： a) 提供具有式（I)的結構的多孔膜，其中式（I)為：
其中A為電子束（電子束）反應性部分，其中聚（A)x為所述電子束反應性部分的聚合 物，X為存在於所述聚（A)x聚合物中的A單體的數量；其中鍵在所述聚（A)x聚合物和B基 團之間形成鍵合，並且其中聚（A)x-鍵-B為共價接枝到所述多孔膜的聚合親水性塗層； b) 在所述多孔膜上固定與關注的抗原結合的第一抗體，其中所述第一抗體與可檢測物 質綴合； c) 用包含在其上固定的所述第一抗體的多孔膜培育生物學樣品；和 d) 通過檢測所述可檢測物質是否與所述多孔膜結合，測定在所述生物學樣品中是否存 在所述抗原。
26. 權利要求3的硝化纖維素膜，其中所述聚合親水性塗層包含聚乙二醇（PEG)部分、 聚乙烯醇、羥基、帶負電荷的離子基團、帶正電荷的離子基團、兩性離子基團，或它們的任何 組合。
27. 權利要求26的硝化纖維素膜，其中所述聚合親水性塗層包含PEG部分。
28. 權利要求27的硝化纖維素膜，其中所述PEG部分選自PEGMA、PEGDA和TMPET。
29. 權利要求28的硝化纖維素膜，其中關注的生物分子固定在所述硝化纖維素膜上。
30. 權利要求29的硝化纖維素膜，其中所述關注的生物分子為蛋白質或核酸。
31. 權利要求30的硝化纖維素膜，其中所述關注的生物分子為蛋白質。
32. 權利要求31的硝化纖維素膜，其中所述蛋白質為抗體。
33. 權利要求29的硝化纖維素膜，其中相對於與未改性的硝化纖維素膜的非特異性結 合，所述硝化纖維素膜顯示非特異性結合降低。
34. 權利要求33的硝化纖維素膜，其中所述硝化纖維素膜還顯示信號與噪聲比提高。
35. 權利要求3的硝化纖維素膜，其中所述聚合親水性塗層與所述硝化纖維素膜共價 連接。
36. 權利要求3的硝化纖維素膜，其中所述硝化纖維素膜的孔尺寸在0. 01-50微米範 圍。
37. -種用於實施免疫測定的裝置，所述裝置包含權利要求3的硝化纖維素膜。
38. 權利要求37的裝置，其中所述裝置用於側流免疫測定。
39. -種用於製備權利要求3的硝化纖維素膜的方法，所述方法包括： a) 提供未改性的硝化纖維素膜； b) 在親水性化合物的含水溶液中浸沒所述硝化纖維素膜； C)使所述多孔膜暴露於電子束（電子束）輻射；和 d)乾燥所述硝化纖維素膜，從而製備包含與所述硝化纖維素膜鍵合的聚合親水性塗層 的硝化纖維素膜。
40. 權利要求39的方法，其中所述親水性化合物的含水溶液還包含非離子表面活性 劑。
41. 權利要求40的方法，其中所述非離子表面活性劑為聚氧乙烯（20)脫水山梨糖醇 單月桂酸酯。
42. 權利要求25的方法，其中所述免疫測定選自側流免疫測定、放射性免疫測定、酶免 疫測定（EIA)、酶聯免疫吸附劑測定（ELISA)、螢光免疫測定和化學發光免疫測定。
43. 權利要求42的方法，其中所述方法允許檢測生物學樣品中的一種或多種生物分 子。
44. 權利要求43的方法，其中所述生物學樣品為血液、血清、淋巴、尿、唾液、粘液、身體 分泌物、細胞或組織。
45. 權利要求44的方法，其中所述生物分子為與疾病關聯的抗原。
46. 權利要求的45方法，其中所述疾病為細菌性疾病、病毒性疾病或真菌性疾病。
47. 用於在使用硝化纖維素膜用於固定生物分子的免疫測定中降低非特異性結合的 方法，其中所述用於免疫測定的硝化纖維素膜如在權利要求3中陳述。
48. 用於在使用硝化纖維素膜用於固定生物分子的免疫測定中降低信號與噪聲比的 方法，其中所述用於免疫測定的硝化纖維素膜如在權利要求3中陳述。
【文檔編號】B01D67/00GK104066497SQ201280065407
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2012年12月27日 優先權日:2011年12月30日
【發明者】B.李, D.R.摩爾 申請人:通用電氣公司