一種真空滲透輔助農桿菌介導轉化苜蓿的方法

2023-06-03 19:37:51 2

專利名稱：：一種真空滲透輔助農桿菌介導轉化苜蓿的方法
技術領域：
：本發明涉及一種農桿菌介導轉化苜蓿的方法，尤其涉及一種真空滲透輔助農桿菌介導轉化苜蓿的方法，屬於生物技術和現代農業
技術領域：
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背景技術：
：低溫、乾旱和鹽鹼嚴重影響我國乃至世界的農業生產，我國是乾旱頻繁發生的國家之一，根據統計，我國從1991年至2005年乾旱發生面積平均每年為2602萬公頃，其中1998年乾旱面積最小，為1424萬公頃，而2000年乾旱面積最大，達4054萬公頃，並且有逐年加大的趨勢。水資源短缺以及土壤鹽鹼化是目前制約農業生產的一個全球性問題，到目前為止，全球20%的耕地受到鹽鹼化危害，43%的耕地處於乾旱、半乾旱地區。因此，如何提高植物對低溫、乾旱和鹽鹼等逆境的抵抗能力，是目前科學研究和生產上亟待解決的關鍵問題。苜蓿素有"牧草之王"的美稱，是世界上栽培面積最廣、應用最廣泛的多年生豆科牧草，它不但具有抗旱、抗寒、高產、優質、營養豐富等特點，還具有改良土壤結構、理化性質、保持水土和保護環境等方面的重要作用。在我國實施農業三元結構調整中，苜蓿是發展可持續農業的首選飼料作物，但當今中外現有的苜蓿品種，抗旱、耐鹽能力仍然有限，限制了在乾旱和鹽鹼土壤中的種植。建立農桿菌介導的苜蓿高效再生體系和基因轉化體系，將抗逆基因導入苜蓿中，培育抗低溫、乾旱、耐鹽鹼等綜合性狀優良的苜蓿新品系，對擴大苜蓿種植面積、恢復草場和充分利用我國鹽鹼地都有重要意義。而且可以實現苜蓿育種理論和關鍵技術的新突破，大幅度提高農牧業可持續發展能力、增加鹽鹼乾旱地區植被覆蓋率、促進生態工程建設。因此，抗旱耐鹽轉基因苜蓿新品種在我國推廣應用具有巨大的潛力，並具有良好的經濟和社會效益。多年來，傳統有性雜交育種技術在苜蓿品種改良中發揮了重要作用，由於周期長、效率低以及基因資源匱乏等不利因素的影響，未能取得理想的效果。近年來，隨著分子生物學的快速發展，藉助植物基因工程手段改良苜蓿性狀已成為現代育種的重要途徑。1986年，Reich等用顯微注射法將Ti質粒導入紫花苜蓿原生質體，得到轉化的愈傷組織。1990年，Kuchuke等用直接基因轉移法將外源基因導入苜蓿屬另一個物種Medicagoborealis的葉肉原生質體獲得轉基因植株。2001年，徐恆等用電擊法將GUS基因導入苜蓿愈傷組織粉碎後的小細胞團，並檢測了GUS基因的瞬時表達。其中，農桿菌介導法是獲得轉基因植物最常用最可靠的方法，相關的進展報導也較多。1989年，Bowler把菸草的Mn-SODcDNA導入苜蓿中，發現轉基因植物SOD活性增強。Hightower等也將Mn-SODcDNA導入苜蓿，獲得了耐旱的苜蓿。Winicov(2000)等將Alfinl轉錄因子導入苜蓿基因組中，獲得了耐鹽鹼苜蓿。呂德揚(2000)等用高含硫胺基酸蛋白(HNP)基因轉化苜蓿，黎萬奎(2003)等用肝片吸蟲抗原基因轉化苜蓿，並獲得轉基因植株。此外如抗除草劑基因(HalluinD等，1990)、抗病毒基因(KHillK等，1991)、4和抗蟲基因(EAShahin等，1986)也導入苜蓿中。2003年王濤等發明了"一種快速獲得大量轉基因植物新品種的分子育種方法"的專利(專利號200310102540.2),抗性愈傷最高僅達到50%，轉化周期長達12個月。2007年劉立俠等發明了"農桿菌介導的苜蓿遺傳轉化方法"的專利(專利號200710055569.8),縮短轉化周期為5~6個月，但轉化效率較低，僅為13.5%。儘管科研人員先後在苜蓿轉基因方面做了不少的研究工作，但由於苜蓿生長周期長、該屬種類繁多、基因組大、轉化率普遍較低，人們一直未能建立一個可重複的、轉化頻率高的苜蓿再生遺傳轉化體系。Bechtold(1993)等曾用真空滲入技術將農桿菌接種擬南芥植株得到了大量突變體。趙向前等(2002)用農桿菌真空滲透法轉化花粉獲得棉花轉acsB基因植株。但此項技術在苜蓿上應用未見報導，高效穩定的苜蓿遺傳轉化技術，仍為目前組培中的難點。
發明內容針對上述不足，本發明的目的在於克服現有苜蓿遺傳轉化效率低及轉化周期長的難點，在常規農桿菌介導轉化的基礎上，提供一種真空滲透輔助農桿菌轉化苜蓿的方法，以提高苜蓿的轉化效率。本發明所述的真空滲透輔助農桿菌介導轉化苜蓿的方法，步驟包括(l)種子滅菌和試管苗培育，(2)含有目標基因的根癌農桿菌培養，(3)真空滲透輔助農桿菌侵染，(4)抑菌和抗性植株選育培養，(5)抗性植株的生根選育，(6)轉化植株煉苗及大田移栽其中步驟(1)所述種子滅菌和試管苗培育的方法是挑選飽滿無病蟲害的種子，放入1.5ml的離心管內，自來水衝洗乾淨後，用70%乙醇浸泡30~60秒，再用0.1%氯化汞浸泡68分鐘，然後用無菌水洗滌46次，滅菌期間不斷晃動種子，以保證表面滅菌徹底，滅菌後的種子接種到MSB培養基上，7~10d後切取小苗繼續轉接到MSB培養基上分化培養1220d，待長出幼嫩真葉備用；步驟(2)所述含有目標基因的根癌農桿菌培養的方法是:挑取農桿菌菌株LBA4404、GV3101或EHA105(購於中國普通微生物菌種保藏中心)的單菌落接種到5ml含冇50mg/LKan(kanamycin，卡那黴素)的YEB液體培養基中，在溫度2530'C、震蕩轉速160200rpm的條件下，培養24~48小時，然後取lml轉接於50ml含有50mg/LKan的YEB液體培養基中，在溫度2S30"C、轉速160200rpm的條件下，培養1224小時後，再取1025ml菌液加入到50ml培養基I中，在溫度2530°C、震蕩轉速200~220rpm條件下培養24小時至OD6Qo0.3~0.7備用；步驟(3)所述真空滲透輔助農桿菌侵染的方法是將步驟(1)培育的幼嫩葉片從葉柄處剪取，放於加有步驟(2)製備好的農桿菌菌液的培養皿中，農桿菌菌液量以剛好浸沒葉片為準，用刀片切去葉緣，再沿葉脈橫切14個傷口，然後將其轉移到裝有步驟(2)製備好的農桿菌菌液的無菌三角瓶中，用透氣膜封住瓶口，給以0.020.06MPa真空壓力條件輔助農桿菌侵染2~8分鐘，然後取出三角瓶無菌放置2.5~3.5小時步驟(4)所述抑菌和抗性植株選育培養的方法是將步驟(3)侵染過的葉片平放在胚性愈傷組織誘導培養基II+1020mg/LAS(acetosyringone,乙醯丁香酮)上，培養2~3d，之後轉接到胚性愈傷組織誘導培養基II+200400mg/Lcef(cefotaxime,頭孢黴素)+508001^1^!(:肌或25111￡/[^丁(phosphinothricin，抗草丁膦)上培養23周，再轉接到培養基II+200400mg/Lcef+50~80mg/LKan或25mg/LPPT+1030mg/L穀氨醯胺培養2~3周，然後轉接到MSB+200~400mg/Lcef+50~80mg/LKan或2~5mg/LPPT分化培養基上培養，每隔23周換一次培養基，繼代34代，獲得抗性植株；其中，從真空滲透輔助農桿菌侵染後開始一直到轉接到MSB培養基的4~6周時間是放置在黑暗條件下培養，培養溫度為22'C24'C;之後進行晝夜光照周期培養，光照強度為SS-AZpmol'm-2'^,光照時間1315h*d—1，晝溫度25士廠C，夜溫度18±1'C;步驟(5)所述抗性植株的生根選育的方法是待步驟(4)獲得的抗性植株長到3~4cm，將其切成單株，放在MSB+200mg/Lcef+60mg/LKan或3mg/LPPT抗性篩選培養基上進行誘導生根，培養20~25d發育成健壯的生根幼苗，培養條件為晝夜光照周期培養，即光照強度3842pmol'm、人光照時間1315bd—1，晝溫度25±1匸，夜溫度18±1°C;步驟(6)所述轉化植株煉苗及大田移栽的方法是當轉化生根植株的根長達0.5~1.0cm時移入遮光度為70%~80%遮蔭網塑料大棚溫室適應Id後，逐漸打開封口膜降低溼度，23d後，用鑷子將苗夾出，用清水洗去基部殘留的培養基，移栽到混合基質育苗盤中，利用間歇噴霧裝置或人工噴水保持其相對溼度在80%以上，經馴化煉苗5~6d後，栽入盆栽基質中繼續培養3"4d後，然後轉移到遮光度為40%~50%遮蔭網通風棚內培養812d後，移栽到大田；其中所述混合基質育苗盤的成分以體積比計為細沙:沙壤土:育苗基質=4:1:1，混合基質育苗盤上面再放置細沙l~2cm;所述盆栽基質的成分以體積比計為沙壤土:爐灰:育苗基質=5:1:1;所述育苗基質購於壽光市恆先育苗基質加工廠。上述方法各步中採用的培養基及其配方是MSB培養基的基本組分包括MS鹽分及Bs有機，其組分為KNO3l900mg丄—1，NH4NO31650mgL-1，MgSCV7H20370mgU1，KH2P04170mgL"，CaCl2.2H20440mgL.1，MnS04'4H2022.3mgI/1，ZnS04'7H208.6mgL-1，H3B036.2mg.L.1，KI0.83mg-I/1,NaMo04'2H200.25mg.L",CuS04.5H200.025mgL-1，CoCl2-6H200.025mgL-1'Na2-EDTA37.3mg'I/1,FeSO4.7H2027.8mgL/1，鹽酸硫t胺素10mgL—1，鹽酸比哆醇1.0mgL人煙酸1.0mgL"，肌醇100mg'L—1，5g/L瓊脂和20g/L蔗糖，pH值5.86.0;液體培養基YEB是指細菌蛋白腖5g.L",酵母浸膏lg'L—'，牛肉浸膏5g'L—'，MgS04.7H200,493g'L",pH值7.0;培養基I是指NSH+3.0o/。蔗糖+I020mg/LAS，pH值5.0~5.4;胚性愈傷組織誘導培養基II是指NSH+4~6mg/L2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)+0.4~0.6mg/L6-BA(6-節基氨基嘌呤)+3.00/0蔗糖+0.5%瓊脂，pH值5.86.0;其中NSH培養基組成為(NH4)2S04463mgL"，KN032830mgL/1，CaCl2.2H20166mgL"，MgS04'7H20185mgU1，KH2P04400mgL",MnS04,4H2010mgL扁1，ZnS047H201.0mg-I/1，H3B035.0mgL層1，KILOmgl/1,NaMo042H200.1mg.1/1，CuS04'5H200.2mg.L"，CoClr6H200.1mg.L"，EDTA-Fe1.4mg.L",鹽6酸硫胺素5.011^-1;|,鹽酸比哆醇5.0mg-L'1，煙酸5.0mg-L-',肌醇100mg-l/1。上述真空滲透輔助農桿菌介導轉化苜蓿的方法中步驟(2)所述農桿菌菌株LBA4404是含有CaMV35s啟動子、山波菜的甜菜鹼醛脫氫酶基因、選擇標記基因NosNpt-II和報告基因35sGUS的雙元載體pBin438的根癌農桿菌LBA4404菌株；所述農桿菌菌株GV3101是含有CaMV35s啟動子、擬南芥的rd29A基因、選擇標記基因bar和報告基因35sGUS的雙元載體pCAMBIA3301的根癌農桿菌GV3101菌株；所述農桿菌菌株EHA105是含有CaMV35s啟動子、擬南芥的SOS2+3基因、選擇標記基因bar和報告基因35sGUS的雙元載體pCAMBIA3301的根癌農桿菌EHA105菌株。上述真空滲透輔助農桿菌介導轉化苜蓿的方法中步驟(2)製備好的用於侵染的農桿菌菌液濃度OD6Q。優選為0.5。步驟(3)所述真空壓力優選為0.04MPa，農桿菌侵染時間優選4分鐘，放賈時問優選3小吋。步驟(4)所述AS的濃度優選10mg/L，cef的濃度優選400mg/L，Kan的濃度優選50mg/L,PPT的濃度優選2mg/L，穀氨醯胺的濃度優選30mg/L。步驟(4)或(5)所述晝夜光照周期培養的光照強度優選為40pmoPm、—'，光照時間優選141vd—、晝溫度優選25'C，夜溫度優選18'C。為實現發明目的，本發明採用農桿菌轉化的方式並在轉化過程中輔助真空滲透法來達到提高轉化率的效果，抗性愈傷獲得率達到85%以上。本發明以培養15~20d的幼嫩真葉為轉化受體，通過在0.020.06MPa真空壓力下條件下農桿菌侵染28分鐘，放在愈傷組織誘導培養基上誘導出愈傷組織，然後放在含有穀氨醯胺的胚性愈傷組織培養基中分化培養，縮短了體胚發生的誘導周期，縮短轉化周期23個月，並且再通過抗性生根植株的二次篩選，減少了後期檢測工作量，抗性再生苗的陽性率達到95%以上。本發明的方法簡單易行，具有突破性特點和顯著進步，完善了苜蓿的再生體系和遺傳轉化體系。與顯微注射法、電擊法、直接基因轉移法和普通農桿菌介導的方法相比，重複性好，轉化效率大幅度提高。對於苜蓿基因工程方面的理論研究以及遺傳育種實踐均具有重要意義。圖l:篩選的抗性胚狀體。圖2:正在旺盛生長中的抗性胚狀體苗。圖3:轉BADH基因植株PCR檢測。P-以質粒為模版的陽性對照U.6kb);0:H2O為模板的空白對照CK-以未轉化植株為陰性對照；l-10-Kan抗性植株。圖4:轉BADH基因植株PCR-Southem檢測。P-以質粒為模版的陽性對照(1.6kb);CK-以未轉化植株為陰性對照；1-6-轉基因植株。圖5:596。1396。NaCL對轉BADH基因植株生長的影響。轉化植株(上)和未轉化植株(下)圖6:抗性生根的轉BADH基因植株。圖7:營養缽中移栽成活的轉BADH基因植株。圖8:移栽到花盆中的轉BADH基因植株。圖9:鹽鹼地定植轉BADH基因植株。圖10:轉BADH基因優株人工輔助自交授粉。圖ll:15。/。PEG6000濃度處理Tl代轉BADH基因種子發芽率。圖12:Tl代轉BADH基因種子在育苗盤中發芽。圖13:東營鹽鹼地耐鹽篩選的Tl代轉BADH基因植株。圖14:轉rd29A基因植株的PCR檢測。P:以質粒為模板的陽性對照(2.1kb);M:DL2000;CK:未轉化植株；0:H2O為模板的空白對照；11I:PPT抗性植株圖15:轉SOS2+3基因植株的PCR檢測。P:以質粒為模板的陽性對照(780bp);M:DL2000;CK:未轉化植株；0:H2O為模板的空白對照；1~11:PPT抗性植株。具體實施例方式下面結合實施案例對本發明作進一步說明實施例l:植物材料為紫花苜蓿中苜1號種子(購於中國科學院畜牧所)，裝入1.5ml的離心管內，用自來水洗滌2分鐘後，用70%乙醇滅菌60秒，再用0.1%氯化汞滅菌6分鐘，然後用無菌水洗滌6次，滅菌後種子接種到MSB+2.0。/。蔗糖+0.45。/。瓊脂，pH值5.8培養基上，7d後切取小苗繼續轉接到上述培養基上分化培養18d後，切下幼嫩真葉。其中種子萌發和分化培養條件為晝夜光照周期培養，光照強度40pmorm—、—'，光照時間14h'cT'，晝溫度25'C，夜溫度18'C。挑選攜帶雙元載體pBin438的根癌農桿菌LBA4404菌種(其載體含有CaMV35s啟動子、山波菜的甜菜鹼醛脫氫酶基因BADH、選擇標記基因NosNpt-II和報告基因35sGUS)的單菌落接種於5ml含有Kan50mg'L—'的YEB液體培養基中，培養30小時(28°C，180rpm)，取lml轉接於50ml無抗菌素的YEB液體培養基中以上述條件培養12小時後，再取25ml菌液加入到50ml培養基I中，在震蕩轉速220rpm條件下培養3小時至OD6G0.6備用。將苜蓿組培苗的幼嫩真葉放於製備好的農桿菌菌液的培養皿中，其中農桿菌菌液量以剛好浸沒葉片為準，用刀片切取葉緣，再沿葉脈橫切2個傷口，將其轉移到製備好的農桿菌菌液的三角瓶中，用透氣膜封口，放在0.04MPa真空壓力下條件下農桿菌侵染4分鐘，然後取出三角瓶在超淨工作檯上放置3小時，在此其間用手慢慢搖動。將侵染過的葉片平放在胚性愈傷組織誘導培養基1I+I0mg/LAS中暗培養2d後，轉接到胚性愈傷組織誘導培養基II+400mg/Lcef+50mg/LKan上暗培養2周，再轉接到胚性愈傷組織誘導培養基II+300mg/Lcef+60mg/LKan+30mg/L穀氨醯胺暗培養3周，然後轉入到MSB+400mg/Lcef+50mg/LKan分化培養基上進行晝夜光照周期培養(培養條件與上述分化培養相同)，之後每隔2周換一次培養基，繼代4代獲得Kan抗性植株。將獲得的抗性植株生長到3—5cm切成單株，放在MSB+2.0%蔗糖+0.5%瓊脂+200mg/Lcef+50mg/LKan抗性篩選培養基上進行誘導生根25d，90%以上植株生根。將獲得的抗性生根的轉基因植株採用CTAB法提取總DNA,隨機選取上述含有BADH基因的質粒pBin438所轉的植株50株，用BADH基因的引物進行PCR擴增，有48株為PCR陽性，擴增出與質粒陽性對照同樣大小的片段(大約1.6kb)，而未轉化植株沒有擴增出相應的片段，部分植株的PCR結果如圖3所示。根據Genebank上己發表的山菠菜BADH基因序列(GeneAccessionNumberDQ497233),PCR擴增所設計的引物是PI:5'-AGAATGGCGTTCCCAATTCCTGCTC-3'，P2:5'-TTCAAGGAGACTTGATCCATCCCCA-3';PCR反應體系lOx反應緩衝液2.5pl脫氧核苷酸混合物(dNTP)2nl引物P1(5uM)2^1引物P1(5uM)2^1模板DNA2^1TaqDNA聚合酶0.25nlddH2014.25^1總體積25^1PCR反應程序95。C預變性10min，93.5。C變性1min，55'C退火1min，72'C延伸1.5min，循環30次，72'C再延伸10min。1.0%的瓊脂糖凝膠電泳，GeneGenius全自動凝膠成像分析系統觀察結果並照相。將上述分子檢測得到的轉BADH基因的株系擴繁後，挑選生長一致的植株分別接種到含有不同NaCl濃度(5%。、7%。、10%。、13%。)分化培養基上，每處理重複4瓶，每瓶4個植株，經20d的培養後，轉化植株的NaCl比未轉化植株提高3%。~5%。。當上述檢測轉化陽性生根植株的根長達0.5~1.0cm時移到遮光度約70%~80%遮蔭網塑料大棚溫室條件下適應ld後，逐漸打開封口膜降低溼度，2d後，用鑷子將苗輕輕夾出，用清水洗去基部殘留的培養基，移栽到混合基質育苗盤中，利用間歇噴霧裝置或人工噴水以保持相對溼度在80%以上，經馴化煉苗6d後，栽入盆栽基質中繼續培養3d後，轉移到遮光度約40。/。50n/。遮蔭網通風棚內培養9d後，移栽到大田。實施例2:將消毒後的苜蓿種子接種到萌發培養基(MSB+2.0%蔗糖+0.5%瓊脂，pH值5.8)上，10d後切取小苗繼續轉接到上述培養基上培養15d後，切下幼嫩真葉，培養條件同實施例1。挑選攜帶雙元載體pCAMBIA3301的根癌農桿菌GV3101菌種(其載體含有CaMV35s啟動子、擬南芥的rd29A基因、選擇標記基因bar和報告基因35sGUS)的單菌落接種於5ml含有Kan50mgU1的YEB液體培養基中，培養24小時(28'C,180rpm)，取lml轉接於50ml無抗菌素的YEB培養基中以相同條件培養16小時後，再取15ml菌液加入到50ml培養基I中，在震蕩轉速200rpm條件下培養4小時至OD6oq0.7備用。將苜蓿組培苗的幼嫩真葉放於製備好的農桿菌菌液的培養皿中，其中農桿菌菌液量以剛好浸沒葉片為準，用刀片切取葉緣，再沿葉脈橫切3個傷口，後將其轉移到製備好的農桿菌菌液的三角瓶中，用透氣膜封口，放在在0.02MPa真空壓力下條件下農桿菌侵染6分鐘，然後取出三角瓶放置在轉速為100rpm搖床上振蕩2.5小時。將侵染過的葉片平放在胚性愈傷組織誘導培養基II+10mg/LAS中暗培養3d後，轉接到胚性愈傷組織誘導培養基II+400mg/Lcef+2mg/LPPT上暗培養3周，再轉接到胚性愈傷組織誘導培養基II+300mg/Lcef+3mg/LPPT+30mg/L穀氨醯胺暗培養2周，然後轉入到MS鹽+Bs有機+300mg/Lcef+50mg/LKan分化培養基上進行晝夜光照周期培養，之後每隔3周換一次培養基，繼代3代獲得PPT抗性植株。將獲得的抗性植株生長到3.5cm切成單株，放在MSB+2.0%蔗糖+0.5%瓊脂+300mg/Lcef+2mg/LPPT抗性篩選培養基上進行誘導生根25d，95%以上植株生根。隨機選取上述含有rd29A基因的質粒pCAMBIA3301所轉的抗性生根植株53株，採用CTAB法提取轉基因植株基因組DNA，進行PCR檢測，有51株為PCR陽性，擴增出與質粒陽性對照同樣大小的片段(大約2.1kb)，而未轉化植株沒有擴增出相應的片段，部分植株的PCR結果如圖14所示。根據Genebank上已發表的擬南芥rd29A基因序列(GeneAccessionNumberD13044),PCR擴增所設計的引物PI:5'-TCTAGGGTACCGTGGAAAATGGATC-3'，P2:5'-CGAGGATCCTCTCTTAAAGCTCCTT-3';PCR反應體系同實施例1，PCR反應程序為95'C預變性10min，94'C變性lmin，58'C退火lmin，72'C延伸2min，循環30次，72'C再延伸10min。當上述檢測轉化陽性生根植株的根長達0.5~1.0cm時移到遮光度約70%~80%遮蔭網塑料大棚溫室條件下適應ld後，逐漸打開封口膜降低溼度，3d後用鑷子將苗輕輕夾出，用清水洗去基部殘留的培養基，移栽到混合基質育苗盤中，利用間歇噴霧裝置或人工噴水以保持相對溼度在80%以上，經馴化煉苗5d後，栽入盆栽基質中繼續培養3d後，轉移到遮光度約40°/。~50%遮蔭網通風棚內培養12d後，移栽到大田。實施例3:將消毒後的苜蓿種子接種到萌發培養基(MSB+0.11118/1^-8八+3.0%蔗糖+0.55%瓊脂，pH值5.8)上，8d後切取小苗繼續轉接到上述培養基上分化培養20d，切下幼嫩真葉。挑選攜帶雙元載體pCAMBIA3301的根癌農桿菌EHA105菌種(其載體含有CaMV35s啟動子、擬南芥的SOS2+3基因、選擇標記基因bar和報告基因35sGUS)的單菌落接種於5ml含有Kan50mgL—1的YEB液體培養基中，培養28小時(28'C,190rpm)，取lml轉接於50ml無抗菌素的YEB培養基中以相同條件培養10小時後，再取20ml菌液加入到50ml培養基I中，在震蕩轉速220rpm條件下培養2小時至OD600.4備用o將苜蓿組培苗的幼嫩真葉放於製備好的農桿菌菌液的培養皿中，其中農桿菌菌液量以剛好浸沒葉片為準，用刀片切取葉緣，再沿葉脈橫切3個傷口，後將其轉移到製備好的農桿菌菌液的三角瓶中，用透氣膜封口，放在0.05MPa真空壓力下條件下農桿菌侵染3分鐘，然後取出三角瓶在超淨工作檯上放置3.5小時。將侵染過的葉片平放在胚性愈傷組織誘導培養基II+20mg/LAS中暗培養2d後，轉接到胚性愈傷組織誘導培養基II+300mg/Lcef+lmg/LPPT上暗培養2.5周，再轉接到胚性愈傷組織誘導培養基II+300mg/Lcef+3mg/LPPT+20mg/L穀氨醯胺暗培養2.5周，然後轉入到MSB+200mg/Lcef+2mg/LPPT分化培養基上進行晝夜光照周期培養，之後每隔3周換一次培養基，繼代3代獲得PPT抗性植株。將獲得的抗性植株生長到3cm切成單株，放在MSB+2.0%蔗糖+0.6%瓊脂+2001118^cef+2mg/LPPT抗性篩選培養基上進行誘導生根23d，91。/。以上植株生根。隨機選取上述含有SOS2+3基因的質粒pCAMBIA3301所轉的抗性生根植株40株，釆用CTAB法提取轉基因植株基因組DNA，用SOS2+3基因的引物(Pl:5'-ACAAAGGGTAATATCGGGAAAC墨3'，P2:5'-CGAAGGACTCGCCAACAC-3')進行PCR擴增，有36株為PCR陽性，擴增出與質粒陽性對照同樣大小的片段(大約0.78kb)，而未轉化植株沒有擴增出相應的片段，部分植株的PCR結果如圖15所示。當上述檢測轉化陽性生根植株的根長達0.5~1.0cm時移到遮光度約70%~80%遮蔭網塑料大棚溫室條件下適應ld後，逐漸打開封口膜降低溼度，2d後用鑷子將苗輕輕夾出，用清水洗去基部殘留的培養基，移栽到混合基質育苗盤中，利用間歇噴霧裝置或人工噴水以保持相對溼度在80%以上，經馴化煉苗5d後，栽入盆栽基質中繼續培養2d後，轉移到遮光度約40°/。~50%遮蔭網通風棚內培養14d後，移栽到大田。實施例4:轉基因植株的後代檢測1、轉化植株後代的分子檢測將轉基因植株進行自交授粉，取後代部分種子消毒後接種到萌發培養基(MSB+2.0%蔗糖+0.5%瓊脂，pH值5.8)上，隨機挑選轉含有BADH基因的pBin438質粒的Tl代植株149株，提取葉片總DNA進行PCR檢測，PCR陽性率為69.4%，符合孟德爾遺傳規律，說明轉基因能夠穩定遺傳到後代。2、轉化植株後代的抗性檢測以未轉基因的種子做對照(CK)，取轉BADH基因植株的T1代種子Tl-2、Tl-5、Tl-12、Tl-14滅菌後，在含100mg/L卡那黴素的萌發培養基(MSB+2.0%蔗糖+0.5%趙(脂，pH值5.8)中篩選發芽，1周後觀察發芽情況，統計發芽粒數，20d統計植株白化率，結果見表l。表1轉基因後代的卡那黴素抗性種子代號總種子數發芽種子數發芽率％白化率％CK302893.392.9Tl-2282810021.4Tl-5282810025T1-12131184.645.5T1-14211780.929.4未轉基因植株和轉基因植株後代(Tl)種子發芽正常，但生長20d後對照植株白化率達到92.9%,轉基因植株的後代(Tl)大部分白化率為20%多。3、轉化植株後代的抗旱性檢測以未轉基因的種子做對照(CK),取轉BADH基因植株的T1代種子滅菌後，接種到含不同濃度的PEG6000的萌發培養基(MSB+2.0%蔗糖+0.5%瓊脂，pH值5.8)中發芽，l周后觀察發芽情況，統計發芽率，結果見表2。表2轉基因後代的PEG6000抗性tableseeoriginaldocumentpage12未轉基因種子隨PEG6000濃度升高，發芽率明顯受到抑制，在15y。PEG6000濃度下轉基因種子發芽率為50%多，對照種子發芽率僅為2.1%。本發明方法各步中採用的培養基及其配方是MSB培養基的基本組分包括MS鹽分及Bs有機，其組分為KNO3l900mg'L—1，NH4N031650mgL"，MgS04.7H20370mg.U'，KH2P04170mg.L"，CaCl2.2H20440mg■U1，MnS044H2022.3mgL",ZnS04'7H208.6mgL"，H3B036.2mgL"，KI0.83mgL"，NaMo042H200.25mgL"，CuS045H200.025mgL"，CoCl26H200.025mg.I/1，Na2-EDTA37.3mg.L"，FeSO4'7H2027.8mg.L"，鹽酸硫胺素10mgL"，鹽酸比哆醇l.Omg'L"，煙酸1.0mg.L"，肌醇100mg'I/1，5g/L瓊脂和20g/L蔗糖，pH值5.8~6.0;液體培養基YEB是指細菌蛋白腖5g-L—1,酵母浸膏lg-L—'，牛肉浸膏5g-L—1，MgS04-7H200.493g-1/1，pH值7.0;培養基I是指NSH+3.0。/o蔗糖+1020mg/LAS，pH值5.0-5.4;胚性愈傷組織誘導培養基II是指NSH+4~6mg/L2，4-D+0.4~0.6mg/L6-BA+3.0%蔗糖+0.5%瓊脂，pH值5.86.0;其中NSH培養基組成為(NH4)2S04463mg.L"，KN032830mgL"，CaCl2'2H20166mgL.1，MgS04'7H20185mg.L"，KH2P04400mg.L.1，MnS044H2010mgL.1，ZnS04-7H201.0mgL-1，H3B035.0mgL-1，KI1.OmgL-1，NaMo04.2H200.1mgU1，CuS04.5H200.2mg-L-1，CoCl2.6H200.1mgL-1，EDTA-Fe1.4mgL-1，鹽酸硫胺素5.011^丄-1，鹽酸比哆醇S.Omg'L-1，煙酸5.0mg'L'1，肌醇lOOmg'L-1。所述混合基質育苗盤的成分以體積比計為細沙:沙壤土:育苗基質=4:1:1，混合基質育苗盤上面再放置細沙l~2cm;所述盆栽基質的成分以體積比計為沙壤土:爐灰:育苗基質=5:1:1;所述育苗基質購於壽光市恆先育苗基質加工廠。權利要求1、一種真空滲透輔助農桿菌介導轉化苜蓿的方法，步驟包括(1)種子滅菌和試管苗培育，(2)含有目標基因的根癌農桿菌培養，(3)真空滲透輔助農桿菌侵染，(4)抑菌和抗性植株選育培養，(5)抗性植株的生根選育，(6)轉化植株煉苗及大田移栽；其特徵在於步驟(2)所述含有目標基因的根癌農桿菌培養的方法是挑取農桿菌菌株LBA4404、GV3101或EHA105的單菌落接種到5ml含有50mg/LKan的YEB液體培養基中，在溫度25～30℃、震蕩轉速160～200rpm的條件下，培養24～48小時，然後取1ml轉接於50ml含有50mg/LKan的YEB液體培養基中，在溫度25～30℃、轉速160～200rpm的條件下，培養12～24小時後，再取10～25ml菌液加入到50ml培養基I中，在溫度25～30℃、震蕩轉速200～220rpm條件下培養2～4小時至OD6000.3～0.7備用；步驟(3)所述真空滲透輔助農桿菌侵染的方法是將步驟(1)培育的幼嫩葉片從葉柄處剪取，放於加有步驟(2)製備好的農桿菌菌液的培養皿中，農桿菌菌液量以剛好浸沒葉片為準，用刀片切去葉緣，再沿葉脈橫切1～4個傷口，然後將其轉移到裝有步驟(2)製備好的農桿菌菌液的無菌三角瓶中，用透氣膜封住瓶口，給以0.02～0.06MPa真空壓力條件輔助農桿菌侵染2～8分鐘，然後取出三角瓶無菌放置2.5～3.5小時；步驟(4)所述抑菌和抗性植株選育培養的方法是將步驟(3)侵染過的葉片平放在胚性愈傷組織誘導培養基II+10～20mg/LAS上，培養2～3d，之後轉接到胚性愈傷組織誘導培養基II+200～400mg/Lcef+50～80mg/LKan或2～5mg/LPPT上培養2～3周，再轉接到培養基II+200～400mg/Lcef+50～80mg/LKan或2～5mg/LPPT+10～30mg/L穀氨醯胺培養2～3周，然後轉接到MSB+200～400mg/Lcef+50～80mg/LKan或2～5mg/LPPT分化培養基上培養，每隔2～3周換一次培養基，繼代3～4代，獲得抗性植株；其中，從真空滲透輔助農桿菌侵染後開始一直到轉接到MSB培養基的4～6周時間是放置在黑暗條件下培養，培養溫度為22℃～24℃；之後進行晝夜光照周期培養，光照強度為38～42μmol·m-2·s-1，光照時間13～15h·d-1，晝溫度25±1℃，夜溫度18±1℃；步驟(5)所述抗性植株的生根選育的方法是待步驟(4)獲得的抗性植株長到3～4cm，將其切成單株，放在MSB+200mg/Lcef+60mg/LKan或3mg/LPPT抗性篩選培養基上進行誘導生根，培養20～25d發育成健壯的生根幼苗，培養條件為晝夜光照周期培養，即光照強度38～42μmol·m-2·s-1，光照時間13～15h·d-1，晝溫度25±1℃，夜溫度18±1℃；步驟(6)所述轉化植株煉苗及大田移栽的方法是當轉化生根植株的根長達0.5～1.0cm時移入遮光度為70％～80％遮蔭網塑料大棚溫室適應1d後，逐漸打開封口膜降低溼度，2～3d後，用鑷子將苗夾出，用清水洗去基部殘留的培養基，移栽到混合基質育苗盤中，利用間歇噴霧裝置或人工噴水保持其相對溼度在80％以上，經馴化煉苗5～6d後，栽入盆栽基質中繼續培養3～4d後，然後轉移到遮光度為40％～50％遮蔭網通風棚內培養8～12d後，移栽到大田；其中所述混合基質育苗盤的成分以體積比計為細沙:沙壤土:育苗基質＝4:1:1，混合基質育苗盤上面再放置細沙1～2cm；所述盆栽基質的成分以體積比計為沙壤土:爐灰:育苗基質＝5:1:1；上述方法各步中採用的培養基及其配方是培養基I是指NSH+3.0％蔗糖+10～20mg/LAS，pH值5.0～5.4；胚性愈傷組織誘導培養基II是指NSH+4～6mg/L2，4-D+0.4～0.6mg/L6-BA+3.0％蔗糖+0.5％瓊脂，pH值5.8～6.0；其中NSH培養基組成為(NH4)2SO4463mg·L-1，KNO32830mg·L-1，CaCl2·2H2O166mg·L-1，MgSO4·7H2O185mg·L-1，KH2PO4400mg·L-1，MnSO4·4H2O10mg·L-1，ZnSO4·7H2O1.0mg·L-1，H3BO35.0mg·L-1，KI1.0mg·L-1，NaMoO4·2H2O0.1mg·L-1，CuSO4·5H2O0.2mg·L-1，CoCl2·6H2O0.1mg·L-1，EDTA-Fe1.4mg·L-1，鹽酸硫胺素5.0mg·L-1，鹽酸比哆醇5.0mg·L-1，煙酸5.0mg·L-1，肌醇100mg·L-1；MSB培養基的基本組分包括MS鹽分及B5有機，其組分為KNO31900mg·L-1，NH4NO31650mg·L-1，MgSO4·7H2O370mg·L-1，KH2PO4170mg·L-1，CaCl2·2H2O440mg·L-1，MnSO4·4H2O22.3mg·L-1，ZnSO4·7H2O8.6mg·L-1，H3BO36.2mg·L-1，KI0.83mg·L-1，NaMoO4·2H2O0.25mg·L-1，CuSO4·5H2O0.025mg·L-1，CoCl2·6H2O0.025mg·L-1，Na2-EDTA37.3mg·L-1，FeSO4·7H2O27.8mg·L-1，鹽酸硫胺素10mg·L-1，鹽酸比哆醇1.0mg·L-1，煙酸1.0mg·L-1，肌醇100mg·L-1，5g/L瓊脂和20g/L蔗糖，pH值5.8～6.0。2、如權利要求1所述真空滲透輔助農桿菌介導轉化苜蓿的方法，其特徵在於步驟(2)所述農桿菌菌株LBA4404是含有CaMV35s啟動子、山波菜的甜菜鹼醛脫氫酶基因、選擇標記基因NosNpt-II和報告基因35sGUS的雙元載體pBin438的根癌農桿菌LBA4404菌株；所述農桿菌菌株GV3101是含有CaMV35s啟動子、擬南芥的rd29A基因、選擇標記基因bar和報告基因35sGUS的雙元載體pCAMBIA3301的根癌農桿菌GV3101菌株；所述農桿菌菌株EHA105是含有CaMV35s啟動子、擬南芥的SOS2+3基因、選擇標記基因bar和報告基因35sGUS的雙元載體pCAMBIA3301的根癌農桿菌EHA105菌株。3、如權利要求1所述的真空滲透輔助農桿菌介導轉化苜蓿的方法，其特徵在於歩驟(2)製備好的用於侵染的農桿菌菌液濃度OD6oo為0.5。4、如權利要求1所述的真空滲透輔助農桿菌介導轉化苜蓿的方法，其特徵在於步驟(3)所述真空壓力為0.04MPa，農桿菌侵染時間4分鐘，放置3小時。5、如權利要求1所述的真空滲透輔助農桿菌介導轉化苜蓿的方法，其特徵在於步驟(4)所述AS的濃度為10mg/L，cef的濃度為400mg/L，Kan的濃度為50mg/L，PPT的濃度為2mg/L，穀氨醯胺的濃度為30mg/L。6、如權利要求1所述的真空滲透輔助農桿菌介導轉化苜蓿的方法，其特徵在於步驟(4)或(5)所述晝夜光照周期培養的光照強度為40^imobm^s—、光照時間14bd—、晝溫度25'C，夜溫度18"。全文摘要本發明公開一種真空滲透輔助農桿菌介導轉化苜蓿的方法，包括(1)種子滅菌和試管苗培育，(2)含有目標基因的根癌農桿菌培養，(3)真空滲透輔助農桿菌侵染，(4)抑菌和抗性植株選育培養，(5)抗性植株的生根選育，(6)轉化植株煉苗及大田移栽等步驟；本發明以農桿菌介導轉化苜蓿幼嫩真葉的轉化方式，在侵染過程中採用真空滲透的方法，從而大大提高轉化效率，通過抗性植株的二次抗性生根選育減少了後期檢測工作量，得到大量的轉化植株；本發明的方法克服了現有苜蓿遺傳轉化效率低及轉化周期長的難點，提高了苜蓿的轉化效率95％以上，縮短轉化周期2～3個月，對於苜蓿基因工程方面的理論研究以及遺傳育種實踐均具有重要意義。文檔編號C12N15/82GK101457235SQ200810138770公開日2009年6月17日申請日期2008年8月5日優先權日2008年8月5日發明者劉德璽,陽夏,梁慧敏,燕麗萍,王太明申請人:山東省林業科學研究院