益母草水提物在製備治療缺血性心臟病藥物中的應用的製作方法

2023-06-03 14:39:16 1

專利名稱：益母草水提物在製備治療缺血性心臟病藥物中的應用的製作方法
技術領域：
本發明屬中藥製藥領域，涉及中草藥益母草水提物在製備藥物組 合物中的應用，尤其是在製備通過促進新生血管的生長治療缺血性 心臟病藥物中的應用。
背景技術：
缺血性心肌病，是近幾十年來在發達國家和發展中國家導致死亡 的首要原因。降低此類疾病的發病率和死亡率非常重要。心臟的內源
性抗氧化系統包括超氧化物歧化酶(s叩eroxide dismutase， S0D)、 過氧化氫酶(catalase， CAT)、穀胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GPx)和其它抗氧化劑。體內活性氧(Reactive oxygen species, ROS)產生增加，超過了內源性抗氧化系統的清除能力，導 致氧化應激，可加速人體的衰老、增加腫瘤的發生率，也可引起心血 管系統的損傷，加重心肌破壞的程度。動脈粥樣硬化、糖尿病、中風 等疾病過程中，氧化應激的機制也不容忽視。中草藥益母草(唇形科 植物，〃er^g Z簡i/r力Chinese Motherwort),最早收載於《神農本 草經》、《本草綱目》等古籍中，有活血調經、利尿消腫的功效。中華 人民共和國藥典(2000年版)中用於月經不調、痛經、經閉、惡露 不盡、水腫尿少、急性腎炎水腫等治療。未見有關治療缺血性心臟病 的報導。

發明內容
本發明的目的是提供中藥益母草(vfe^a Zeo/H/n'， Chinese Motherwort,以下簡稱HL)的活性成分在治療缺血性心臟病藥物中 的新用途，尤其是在製備通過促進新生血管的生長治療缺血性心臟病 藥物中的應用。
本發明通過大量的化學和藥理研究測得，中藥益母草含有豐富的
生物鹼類和羥基黃酮類成分，可作為藥物製劑的原料。 本發明通過下述方法提取活性成分
① 取原藥材益母草，除去殘根、粗梗等雜質，洗淨，粉碎後用
80-100度的水煎煮。
② 水煎藥液經濾過、濃縮後用高效液相色譜一質譜聯用技術 (High-performance liquid chromatography—mass spectrometry,
HPLC—MS)，使用光電二極體陣列探測器和電噴霧質譜檢査，其中含 有水蘇鹼(Stachydrine)、山萘素(Kaempferol)禾口槲皮素(quercetin) 等主要成分。
本發明益母草的活性成分可作為藥物原料，直接或與藥學上通常 用於製劑的固體或液體混合製成適宜製劑，包括膠囊、片劑、散劑以 及複方製劑。
經體外實驗和體內動物實驗結果證明，益母草水提物具有較高的 血管新生活性，能促進新生血管尤其是冠狀毛細血管的生長，滿足缺 血性心肌的氧供需求。


圖1是益母草水提物HPLC色譜圖，
其中，益母草水提物50mg/ml，進樣體積lOitil，碎片電壓IOOV.
標記峰*為水蘇鹼和山萘素，**為槲皮素。 圖2是體內試驗中HL的抑制細胞凋亡作用和促進毛細血管新生 的作用，
其中，p53 (A) ， Fas (B), Bcl-xl (C) ， Bel-xs (D)和VEGF(E)的raRNA水 平的半定量分析，以GAPDH的基因表達為內參，*:與給水心梗治療組 相比，有統計學意義，代0.05.tt:與假手術組相比有統計學意義， 代O. 05;
第一列HL心梗治療組；第二列給水心梗治療組；第三列假 手術組。
圖3是體外試驗中HL的抑制細胞凋亡作用和促進毛細血管新生
的作用，
其中，P53 (A) ， Fas (B) ， Bel-xl (C) ， Bel-xs (D)和VEGF (E)的mRNA水 平的半定量分析，以GAPDH的基因表達為內參，每組包括6孔細胞(標 準六孔板)並且每組試驗重複兩次，標準差已標識，*:與給水心梗 治療組相比，有統計學意義，代0.05;
第一列給水低氧治療組；第二列HL低氧治療組；第三列 給水非低氧對照組；第四列HL非低氧對照組。
圖4是體外臺盼蘭染色不相容試驗細胞活力測定的比較， 其中，每組包括六孔細胞(標準六孔板)每組試驗重複兩次，標 準差標識如圖；*:與給水心梗治療組相比，代0.05。
具體實施例方式
以下例舉實施例更具體地說明本發明，實施例所示成分、比率、 操作條件和順序等可在不脫離本發明精神的限定內適當變更。 實施例l
益母草水煎藥液經濾過、濃縮後用高效液相色譜一質譜聯用技 術，使用光電二極體陣列探測器(DAD)和電噴霧(ESI)質譜檢査， 其中含有水蘇鹼(Stachydrine)、山萘素(Kaempferol)和槲皮素 (quercetin)等主要成分。 實施例2
取益母草水提物，添加適量微晶纖維素、澱粉或其他賦形劑，按 常規方法分別製成膠囊劑、片劑、散劑、顆粒劑、丸劑等內服劑型。 實施例3 HL的抑制細胞凋亡作用和促進毛細血管新生的作用體內
試驗
體內試驗檢測凋亡基因和VEGF基因的表達常規方法進行 p53 (A) ， Fas (B) ， Bcl-xl (C) ， Bel-xs (D)和VEGF (E)的mRNA水平的半定
量分析，以GAPDH的基因表達為內參，結果顯示HL心梗治療組的 凋亡基因Ps3和Fas的表達明顯低於給水心梗治療對照組，代0.05。 相反，該組的凋亡抑制基因Bcl-xl的表達卻明顯高於對照組。Bcl-xs 的基因表達水平則在兩組間沒有明顯的差異性。四例被檢測樣本中有 三例證實HL對凋亡有抑制作用，表明HL在體內對全身各系統有潛在 抑制凋亡的作用。VEGF的基因在AMI組雖有表達，但在假手術組並 未檢測到該基因的表達(圖l)。結果表明組織損傷或低氧等狀態 可以誘導VEGF基因表達的突然增加，引發血管新生以滿足氧供需求 得增加。HL心梗治療組的VEGF的基因表達明顯高於對照組(代O. 05), 說明前者有較高的血管新生活性。 進一步進行冠狀毛細血管的計數， 使用工具藥治療的心梗對照組的左心室毛細血管數 (221.2±22.5)明顯低於
HL心梗治療組(316.8土16.5) (;XO. 05)。三組的心肌組織切片在梗 死區均有壞死現象存在。對照組的血管數量普遍較少。HL治療組左心 室非心梗區的血管數也比較少。
實施例4 HL抑制細胞凋亡作用和促進毛細血管新生作用的體 外試驗，
體外試驗檢測凋亡基因和VEGF表達水平的變化與體內試驗結果 相似，HL低氧治療組的屍幼屍as，價7-xs的mRNA低於對照組，代O. 05 (圖2)。同時，Bel-xl基因表達水平在HL低氧治療組和對照組之間 沒有明顯的差異。低氧介導的VSMC凋亡現象不依賴的Bc1-xl基因的表 達。此外，HL非缺氧治療組(HLC)和對照組(WC)之間的上述四個 基因的表達沒有明顯差異，說明HL提取物對於生理狀態下的VSMC沒有 細胞凋亡和血管新生作用，說明了HL有較少的負作用。本試驗與體內 試驗結果一致，HL缺氧治療組的VEGF基因表達水平明顯高於低氧對照 組代0.05 ，但兩個非缺氧不同處理組之間該基因的表達沒有明顯差 異性。上述實驗結果證實HL可能在缺氧的條件下通過進一步上調VEGF 基因表達促進毛細血管的新生，但在非缺氧的條件下正常劑量的H L並不發揮該作用。
在上述體外試驗中，細胞的基因相對表達水平沒有根據細胞的數
量進行校正。在利用Material等人描述的胰蛋白酶一EDTA的方法檢測
細胞活力之後，這類細胞就不能再次用來提取RNA和進行後續的RNA
水平的分析。為了避免由於細胞數量的不同帶來的誤差，本試驗沒有 利用細胞計數修正RNA水平，只是將細胞計數的結果作為解釋RNA水平
變化的一個參考值。
實施例4體外細胞活力的測定
採用臺盼蘭不相容試驗的方法檢測細胞活力。結果顯示，HL低氧 治療組的細胞活力稍高於對照組，代0.05 (圖3)。低氧組的細胞數 量和細胞活力均明顯低於非缺氧組，代0.05 ， HL低氧治療組和對照 組之間細胞活力沒有明顯差異，提示HL在該劑量下對細胞沒有損害作 用。儘管這種差異沒有統計學意義，但HL低氧治療組的全部細胞數量 高於低氧對照組。
權利要求
1、益母草水提物在製備治療缺血性心臟病藥物中的應用，所述的益母草水提物含有主要成分水蘇鹼、山萘素和槲皮素。
2、 權利要求l所述的應用，其特徵是所述的應用是所述的益母 草水提物促進新生血管生長治療缺血性心臟病。
3、 權利要求2所述的應用，其特徵是所述的新生血管是冠狀毛 細血管。
全文摘要
本發明屬中藥製藥領域，涉及中草藥益母草水提物在製備藥物組合物中的應用，尤其是在製備通過促進新生血管的生長治療缺血性心臟病藥物中的應用。經體外實驗和體內動物實驗結果證明，益母草水提物具有較高的血管新生活性，能促進新生血管尤其是冠狀毛細血管的生長，滿足缺血性心肌的氧供需求。本發明益母草的活性成分可作為藥物原料，直接或與藥學上通常用於製劑的固體或液體混合製成適宜製劑，包括膠囊、片劑、散劑以及複方製劑。
文檔編號A61K36/185GK101176747SQ200610118079
公開日2008年5月14日 申請日期2006年11月8日 優先權日2006年11月8日
發明者朱依純, 朱依諄 申請人:復旦大學