提取柘樹多糖的方法

2023-06-03 10:15:46

專利名稱：提取柘樹多糖的方法
技術領域：
本發明涉及一種植物多糖的提取方法，具體地講是以柘數根為原料提取多糖的方法。
背景技術：
多糖類化合物可參與免疫細胞間信息的傳遞與感受，細胞的轉化、分裂及再生活動等，具有免疫調節的功能；具有抗腫瘤、抗病毒、抗衰老、抗凝血、抗輻射損傷的作用；具有降血糖、血脂和膽固醇，抗動脈粥樣硬化的作用；保護胃腸道，具有抗潰瘍的作用；具有防止肝損傷的作用；一些粘多糖可以調節體內陰離子的濃度，調節膠原纖維的生成，阻止重金屬離子在動物消化道內的吸收等。大量的藥理及臨床研究表明，多糖類化合物是一種免疫調節劑，它能激活T、B淋巴細胞、Mφ、NKC等免疫細胞，活化補體，促進細胞因子生成等，對免疫系統發揮多方面的調節作用，從而改善機體的免疫功能，在癌症治療中，它不像一般的化療藥物，直接殺死生長著的細胞，而是通過調節機體的免疫功能殺死腫瘤細胞，對正常的細胞影響很小，具有毒副作用小、安全性高、抑瘤效果好等優點，其作為免疫調節劑在治療腫瘤和愛滋病等病毒方面顯示出的優越性日益受到人們的重視。
柘樹[Cudrania tricuspidata(Carr.)Bur.]，別名柘木、柘、柘桑、柘刺、黑梅子、柞樹、柞腮樹及柞刺，為桑科植物，落葉灌木或小喬木，分布於中南、華東、西南至河北南部。在《本草綱目》、《中國藥典》中記載它的根、根皮、莖、枝葉、果實可入藥，其性味甘溫無毒，可治療關節疼痛、黃疸、勞傷咳血、結石、止咳祛痰等。70年代末浙江一帶民間曾將柘樹根水煎來治療腫瘤，上海雷允上製藥廠及上海中藥二廠生產的柘木糖漿用於治療胃癌等消化道腫瘤，發現柘木糖漿不僅有抑制腫瘤的作用，而且在與化療藥物同用時能明顯減輕化療的毒副作用，能抵抗化療對血細胞的抑制，減輕化療對免疫功能的抑制和損害。徐譽泰等在研究柘樹黃酮的抗腫瘤作用時發現柘樹粗多糖對小鼠腹腔巨噬細胞過氧化物酶活性、細胞毒性及吞噬功能均有所提高，並可抑制S180腫瘤。而柘樹根多糖的分離純化、理化性質、結構分析尚未見公開報導。

發明內容
本發明的目的是提供一種從柘樹根中提取多糖的方法。
本發明的目的是以如下方式實現的該提取柘樹多糖的方法，包括對原料進行浸泡提取，離心、過濾，合併濾液，濾液過大孔吸附樹脂，減壓濃縮，醇析，去蛋白，透析及分離純化。
上述方法具體操作如下a.柘樹根粉碎，加6-8倍體積的水浸泡6小時，70℃分次提取，合併提取液；b.將上述提取液離心、過濾；c.將上步提取液過3520大孔吸附樹脂以除去黃酮；d.將上步收集液減壓濃縮至原體積的1/3，離心；e.將上步的濾液用3倍體積95％的乙醇醇析，在4℃環境下靜置12小時；f.將上步醇析物離心處理，除去上清；g.將上步所得沉澱物用75％乙醇、無水乙醇、乙醚、丙酮依次洗滌，離心；h.將上步所得沉澱物用蒸餾水溶解，Sevag法去蛋白，反覆多次直至交界處無沉澱出現；i.將上步所得溶液去有機溶劑，乾燥得粗多糖；j.將粗多糖溶於水，透析48-72小時；k.將上步透析液離心，上清液過DEAE-SephadexA-50柱，依次用H2O，0.1mol/L NaCl，0.2mol/L NaCl，0.3mol/L NaCl洗脫，分別收集高峰部分；l.分別將上步收集的溶液透析，濃縮，冷凍乾燥得柘樹多糖系列純品。
在a步分次提取是2-3次，第1次2小時，第2次1小時，第3次0.5-1小時。
在c步的3520樹脂PH＝4。
在d步減壓濃縮是在40℃-50℃進行。
在g步的沉澱物依次用75％乙醇、無水乙醇、乙醚、丙酮依次洗滌2-3次。
在h步的由氯仿和正丁醇按體積比5比1構成的Sevag試劑脫蛋白過程是將試劑與溶液按1∶5的體積比加入，加入試劑後震蕩20-30分鐘，使試劑與溶液充分混合，離心後，去交界處沉澱的蛋白，如此反覆多次直至交界處無沉澱出現。
在i步去有機溶劑是在50℃減壓濃縮至溶液少量時加入蒸餾水繼續濃縮，反覆3次。所謂溶液少量，是指略微能看到溶液的狀態。
得到的多糖純品以以下代號表示CPS-1，CPS-2，CPS-3。它們的碘-碘化鉀反應呈陰性，說明三者不含澱粉；雙縮脲反應呈陰性，說明三者不含蛋白質；紫外光譜UV掃描分析表明CPS-1，CPS-2，CPS-3溶液在260nm和280nm處無吸收峰，說明三者不含蛋白質和核酸；高效液相色譜HPLC分析表明CPS-1為均一組分，數均分子量為4461，重均分子量為6572，CPS-2含有少量雜質，數均分子量為24709，重均分子量為68110，CPS-3為一混合組分；GCMS分析表明CPS-1含有鼠李糖(Rha)、阿拉伯糖(Ara)、木糖(Xyl)、甘露糖(Man)、葡萄糖(Glu)、半乳糖(Gal)，摩爾(Rha-Ara-Xyl-Man-Glu-Gal)比依次為1.00∶14.02∶0.74∶2.62∶30.06∶17.72，CPS-2中含有鼠李糖(Rha)、阿拉伯糖(Ara)、木糖(Xyl)、甘露糖(Man)、葡萄糖(Glu)、半乳糖(Gal)，摩爾(Rha-Ara-Xyl-Man-Glu-Gal)比依次為1.00∶2.68∶0.11∶0.16∶0.27∶3.83；元素分析表明CPS-1、CPS-2均為含硫的氨基糖；IR、1HNMR和13CNMR光譜分析表明CPS-1具有吡喃型糖環的特徵吸收峰和α-糖苷鍵的特徵吸收峰，C-2，C-3，C-4中某一碳上發生取代，而C-6未發生取代；CPS-2具有呋喃型糖環的特徵吸收峰，其糖苷鍵可能是β-構型。無論在有沒有絲分裂原ConA或LPS存在的情況下，CPS-1，CPS-2，CPS-3均可顯著增強小鼠脾淋巴細胞的增殖，比已用於臨床的香菇多糖效果更為明顯；在對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬中性紅的影響中，CPS-1，CPS-2在某些濃度與香菇多糖作用效果相同。
具體實施例方式實施例1柘樹根粉碎，加6倍體積的水浸泡6小時，70℃提取3次，第1次浸取2小時，第2次第3次加水各浸提1小時，合併提取液，4000r/min離心15分鐘，砂心漏鬥過濾。用緩衝液平衡3520吸附柱至pH＝4，濾液過3520柱，收集濾出液，40℃減壓濃縮至原體積的1/3，4000r/min離心15分鐘，收集上清液加3倍體積95％的乙醇，在4℃環境下靜置過夜，4000r/min離心15分鐘得沉澱物，將沉澱物用75％乙醇、無水乙醇、乙醚、丙酮依次洗滌2-3次，4000r/min離心15分鐘得到的沉澱物用蒸餾水溶解，使之充分復溶，Sevag法去蛋白，反覆多次直至交界處無沉澱出現，將所得溶液去有機溶劑，冷凍乾燥得粗多糖；粗多糖溶於水，透析48-72小時，透析液4000r/min離心15分鐘，上清液過DEAE-SephadexA-50凝膠柱，依次用H2O，0.1mol/L NaCl，0.2mol/L NaCl，0.3mol/L NaCl洗脫，分別收集高峰部分，經透析，濃縮，冷凍乾燥得柘樹多糖純品。
實施例2柘樹根粉碎，加8倍體積的水浸泡6小時，70℃提取2次，第1次浸取2小時，第2次加水浸提1小時，合併提取液，4000r/min離心15分鐘，砂心漏鬥過濾。用緩衝液平衡3520吸附柱至pH＝4，濾液過3520柱，收集濾出液，40℃減壓濃縮至原體積的1/3，4000r/min離心15分鐘，收集上清液加3倍體積95％的乙醇，在4℃環境下靜置過夜，4000r/min離心15分鐘得沉澱物，將沉澱物用75％乙醇、無水乙醇、乙醚、丙酮依次洗滌2-3次，4000r/min離心15分鐘得到的沉澱物用蒸餾水溶解，使之充分復溶，Sevag法去蛋白，反覆多次直至交界處無沉澱出現，將所得溶液去有機溶劑，冷凍乾燥得粗多糖；粗多糖溶於水，透析48-72小時，透析液4000r/min離心15分鐘，上清液過DEAE-SephadexA-50凝膠柱，依次用H2O，0.1mol/L NaCl，0.2mol/L NaCl，0.3mol/L NaCl洗脫，分別收集高峰部分，經透析，濃縮，冷凍乾燥得柘樹多糖純品。
權利要求
1.一種提取柘樹多糖的方法，包括對原料進行浸泡提取，離心、過濾，合併濾液，濾液過大孔吸附樹脂，減壓濃縮，醇析，去蛋白，透析及分離純化。
2.根據權利要求1所述的提取柘樹多糖的方法，其特徵在於由以下具體步驟構成a.柘樹根粉碎，加6-8倍體積的水浸泡6小時，70℃分次提取，合併提取液；b.將上述提取液過濾；c.將上步濾液過3520大孔吸附樹脂以除去黃酮；d.將上步收集液減壓濃縮至原體積的1/3，過濾；e.將上步的濾液用3倍體積95％的乙醇醇析，在4℃環境下靜置12小時；f.將上步醇析物離心處理，除去上清；g.將上步所得沉澱物用75％乙醇、無水乙醇、乙醚、丙酮依次洗滌，離心15分鐘；h.將上步所得沉澱物用蒸餾水溶解，Sevag法去蛋白，反覆多次直至交界處無沉澱出現；i.將上步所得溶液去有機溶劑，乾燥得粗多糖；j.將粗多糖溶於水，透析48-72小時；k.將上步透析液離心，上清液過DEAE-SephadexA-50柱，依次用H2O，0.1mol/L NaCl，0.2mol/L NaCl，0.3mol/L NaCl洗脫，分別收集高峰部分；1.分別將上步收集的溶液透析，濃縮，冷凍乾燥得柘樹多糖系列純品。
3.根據權利要求2所述的提取柘樹多糖的方法，其特徵在於在a步70℃提取時分2-3次，第1次2小時，第2次1小時，第3次0.5-1小時。
4.根據權利要求2所述的提取柘樹多糖的方法，其特徵在於在c步的3520樹脂PH＝4。
5.根據權利要求2所述的提取柘樹多糖的方法，其特徵在於在d步減壓濃縮是在40℃-50℃進行。
6.根據權利要求2所述的提取柘樹多糖的方法，其特徵在於在g步的沉澱物用75％乙醇、無水乙醇、乙醚、丙酮依次洗滌2-3次。
7.根據權利要求2所述的提取柘樹多糖的方法，其特徵在於在h步的由氯仿和正丁醇按體積比5∶1構成的Sevag試劑脫蛋白過程是將試劑與溶液按1∶5的體積比加入，加入試劑後震蕩20-30分鐘，使試劑與溶液充分混合，離心後去除交界處沉澱的蛋白，如此反覆多次直至交界處無沉澱出現。
8.根據權利要求2所述的提取柘樹多糖的方法，其特徵在於在i步去有機溶劑是在50℃減壓濃縮至溶液少量時加入蒸餾水繼續濃縮，反覆3次。
全文摘要
一種提取柘樹多糖的方法，包括對原料進行浸泡提取，離心、過濾，合併濾液，濾液過大孔吸附樹脂，減壓濃縮，醇析，去蛋白，透析及分離純化。浸泡6－8小時,在70℃溫度下提取，吸附樹脂為pH＝4的3520樹脂，去蛋白採用Sevag法，透析後經DEAE－SephadexA－50凝膠柱，用水及NaCl溶液洗脫，洗脫液透析、冷凍乾燥得純品。
文檔編號C08B37/00GK1583798SQ200410024199
公開日2005年2月23日 申請日期2004年6月4日 優先權日2004年6月4日
發明者陳靠山, 董國霞, 程軍 申請人:山東魯抗集團中澳生物科技有限公司