家蠶BmNPVPolh⁺Bac-to-Bac杆狀病毒表達系統的構建方法

2023-06-03 15:37:21 1

專利名稱：家蠶BmNPV Polh+Bac-to-Bac杆狀病毒表達系統的構建方法
技術領域：
本發明涉及生物技術中的杆狀病毒基因表達系統，尤其涉及一種家蠶BmNPV Polh+ Bac-to-Bac杆狀病毒表達系統的構建方法。
背景技術：
家蠶是我國飼養量最大的經濟資源昆蟲，隨著現代生物技術的發展，開發家蠶作 為新型生物反應器具有較好的市場開發前景。 家蠶杆狀病毒基因表達系統是目前高效的真核表達系統之一。我們利用細菌轉 座子原理構建了專門用於家蠶的Bac-to-Bac杆狀病毒表達系統(參見我們以前的授權專 利ZL200310108781. 8)。該系統的優點在於重組杆狀病毒可以通過細菌轉座子的基因定位 轉移作用，在大腸桿菌內實現基因的轉移重組，快速獲得重組病毒，構建了可利用我國特色 資源昆蟲_家蠶的Bac-to-Bac快速基因表達系統。該系統由供體質粒、含有家蠶杆狀病 毒BmBacmid基因組的感受態細菌DH10BmBac構成，其產生重組病毒的原理是首先將外源
目的基因克隆入供體質粒，然後將供體質粒轉化入DH10BmBac感受態細胞中，通過細菌轉 座子的定點轉位作用，將啟動子和目的基因一併轉入家蠶杆狀病毒基因組而產生重組病毒 DNA，最後轉染家蠶培養細胞而獲得含有目的基因重組病毒。但上述系統構建的重組病毒都 是利用杆狀病毒的強啟動子_多角體啟動子而構建的重組杆狀病毒，所有一般是多角體缺 失型(polh—)病毒，該類重組病毒無法經口感染，因此在感染家蠶時只能通過繁瑣的、經皮 注射的方法實現感染和外源目的基因的表達，大大影響了家蠶杆狀病毒的表達效率。這已 成為家蠶生物反應器規模化應用中急需解決的一個瓶頸問題。

發明內容
本發明的目的是提供一種能夠同時表達多角體的家蠶BmNPV Polh+Bac-to-Bac杆 狀病毒表達系統的構建方法。利用該系統產生的重組病毒能通過經口添食實現感染表達， 較好解決了重組病毒必須經皮接種感染的缺陷，提高了家蠶杆狀病毒表達系統的生產效 率。 為了達到上述目的，發明人在專利號為ZL200310108781.8、名稱為"利用細菌
轉座子構建家蠶病毒快速基因表達系統的方法"的中國專利的基礎上，利用同源重組技 術將多角體polh基因導入BmNPV Bacmid基因組中的plO位點，構建了能產生多角體的 Bac_to_Bac系統(以Polh+ Bac_to_Bac表示)。
本發明的技術方案如下 該家蠶BmNPV Polh+ Bac-to-Bac杆狀病毒表達系統的構建方法的步驟為
1)重組轉移載體的構建 以家蠶野生型BmNPV基因組DNA為模板，分別以PlO-upF/PlO-upB和PlO-downF/ P10-downB為引物PCR擴增獲得plO基因上、下遊各2kb的側翼序列plO-up和plO-down，所
3述plO-卯包含pl0啟動子；引物所設計的酶切位點在表中用下劃線標記；所述PCR擴增條
件為94。C變性3min，按94。C變性45s、55。C退火45s、72。C延伸2min順序進行30個循環， 最後72t:延伸7min ;將擴增得到的pl0-up和pl0-down片段先使用乙醇沉澱、純化處理，再 分別用HindlII/Pstl和Pstl/BamHI酶切處理，然後將酶切處理過的plO-up和plO-down 片段先後插入到pUC19中的BamHI-Pstl-HindlII位點，得到含有plO基因側翼序列頭尾相 連的重組質粒pUC19-plO-up-down ; 以家蠶野生型BmNPV基因組DNA為模板，以PolhF/PolhB為引物PCR擴增獲得多 角體基因片段；PCR擴增反應條件為94t:變性3min，按94。C變性45s、55。C退火45s、72°C 延伸lmin順序進行30個循環，最後72t:延伸7min ;克隆獲得的多角體基因片段用Pst I酶切處理後連接入pUC19-plO-up-down的Pst I位點，將其中正向插入的質粒命名為 pUC19_plO_up_polh_down ;
2)Polh+BmBacmid的產生與篩選 在透明的聚丙烯滅菌管中加入10iiL濃度為liig/iiL的 pUC19_plO_up_polh_down、l ii L濃度為1 P g/P L的BmNPV bacmid DNA、14yL月旨 質體lipofectin和15 ii L滅菌的MilliQ H20，輕輕混勻，常溫下放置15min，得到 DNA-Lipofectin混合液；將培養皿中的處於對數生長期的BmN細胞用無血清TC-100培養 基洗3次，後加入2mL無血清TC-100培養基；然後將所述DNA-Lipofectin混合液均勻加入 到BmN細胞中，27t:培養過夜，吸去上清，加入2mL新鮮的含血清TC-100培養基，27。C培養 5天； 收集轉染後的細胞上清，隨後接種BmN細胞，回收多角體；從收集的多角體中抽提 病毒DNA ;然後將該DNA電轉化DH10 P感受態細胞，在含有卡那黴素、X-gal和IPTG的培養 板上篩選藍斑；培養48h後，挑斑進行PCR鑑定，分析多角體基因是否存在；對PCR陽性的 菌斑過夜培養後抽提其中的大分子DNA，進一步電泳鑑定觀察該大分子DNA中是否有轉移 質粒存在，然後將獲得的大分子DNA轉染入BmN細胞，觀察該BmN細胞是否感染並產生多角 體；將純化的多角體添食家蠶觀察產生的重組病毒是否具有經口感染性；
3)家蠶BmNPV Polh+ Bac-to-Bac表達系統的構建 從AcMNPV Bac-to-Bac的DH10Bac培養菌中用普通質粒抽提方法分離獲得大小為 13. 2kb的輔助質粒；將該輔助質粒轉化入含有？0111+ BmBacmid的E. coliDH10P中，在含有 卡那黴素和四環素的培養板上篩選同時含有？0111+ BmBacmid和輔助質粒的DH1013菌株。
與現有技術相比，本發明的有益效果是利用細菌轉座子位點特異性轉座原理構 建能形成多角體的重組家蠶病毒，這樣的重組病毒可以以多角體和芽生型病毒兩種形式存 在，既能方便地在培養細胞內進行小規模表達，又能利用多角體直接經口感染幼蟲實現大 規模的生產，為家蠶生物反應器產業化提供有力技術支撐。


圖1正向插入質粒pUC19-plO-up-polh-down的結構圖；
圖2DH10BmBac(polh+)構建流程圖； 圖3家蠶Polh+ BmBacmid DNA轉染BmN細胞和SDS-PAGE分析；其中，(A)Polh+ BmBacmid DNA轉染BmN細胞72h，細胞內可觀察到大量多角體；(B)感染細胞的蛋白質分析，1為對照，即BmBacmid(polh—)病毒感染，2為Polh+ BmBacmid病毒感染，箭頭所示為多角體蛋白，分子量約為29kD，標準分子量標記如圖所示；
圖4家蠶BmNPV Polh+ Bac-to-Bac表達外源基因EGFP ; 其中，(A) 、 (B)為vBmBac(polh+)-EGFP感染的BmN細胞在同一視場下的照片，A)為可見光拍攝，(B)為藍光激發後的螢光照片；(C)為vBmBac(polh+)-EGFP感染的BmN細胞的SDS-PAGE圖譜，箭頭所示為多角體蛋白和EGFP蛋白(分子量很接近，難以區分)。D.為vBmBac (polh+) -EGFP感染的BmN細胞的Western blot分析。
具體實施例方式1)重組轉移載體的構建 以家蠶野生型BmNPV基因組DNA為模板，分別以P10-upF/P10-upB和P10-downF/P10-downB為引物(表l)PCR獲得p10基因上下遊各約2kb的側翼序列pl0-up(包含p10啟動子)和pl0-down。引物所設計的酶切位點在表中用下劃線標記。PCR擴增條件為94°C變性3min ;以下進行30個循環94。C變性45s， 55。C退火45s，72。C延伸2min ;最後72。C延伸7min。乙醇沉澱、純化處理後，將擴增得到的pl0-up和pl0-down片段分別用Hindl11/Pstl和Pstl/BamHI酶切處理並先後插入pUC19中的BamHI-PstI-HindIII位點，得到含有p10基因側翼序列頭尾相連的重組質粒pUC19-plO-up-down。 以家蠶野生型BmNPV基因組DNA為模板，以PolhF/PolhB為引物PCR獲得多角體基因片段。PCR擴增反應條件為94t:變性3min，按94。C變性45s、55。C退火45s、72t:延伸lmin的順序進行30個循環，最後72。C延伸7min。克隆獲得的片段用Pstl酶切處理後連接入pUC19-p 10-up-down的PstI位點，將其中正向插入的質粒命名為pUC19-plO-up-polh-down，其結構如圖1所示。
表l本發明涉及的引物
引物序列(5' -3')大小/bp
P10-upFAAAGTCTATTGAAGCTTACGAG(HindiII)1894
P10-upBGTAACTGCAGTGTAATTTACAG (Pstl)
P10-downFATCAATTGTTCTGCAGTATTCG (Pstl)1998
P10-downBACAGGATCCGATTTAACTAATG(BamHI)
PolhFTAACTGCAGCTATAAATATGCC(Pstl)780
PolhBATGTACTGCAGACAATGTATAG (Pstl) 2)Polh+ BmBacmid的產生與篩選 在透明的聚丙烯滅菌管中加入lOii L pUC19-plO-up-polh-down(l ii g/ii L) 、 1 ii LBmNPV bacmid DNA (1 ii g/ii L) 、 14 ii L脂質體lipofectin和15 ii L滅菌的MilliQ 1120(總計40 ii L)，輕輕混勻，常溫下放置15min。期間將d = 35mm培養皿中的處於對數生長期的BmN細胞用無血清TC-100培養基洗3次，後加入2mL無血清TC-100培養基。然後將上述DNA-Lipofectin混合液均勻加入細胞中，27。C培養過夜，吸去上清，加入2mL新鮮的含血清
5TC-100培養基，27t:培養5d。 收集轉染後細胞上清，隨後接種BmN細胞，回收多角體。從收集的多角體中抽提病毒DNA。然後將DNA電轉化DH10 P感受態細胞，在含有卡那黴素、X-gal和IPTG的培養板上篩選藍斑。培養48h後，挑斑進行PCR鑑定，分析多角體基因是否存在。PCR陽性的菌斑過夜培養後抽提其中的大分子DNA，進一步電泳鑑定觀察其中有沒有轉移質粒的存在，然後將獲得的大分子DNA轉染入BmN細胞，觀察是否感染並產生多角體。將純化的多角體添食家蠶觀察產生的重組病毒是否具有經口感染性。Polh+ BmBacmid構建流程如圖2所示。
3)家蠶BmNPV Polh+ Bac-to-Bac表達系統的構建 從AcMNPV Bac-to-Bac (Invitrogen)的DH10Bac培養菌(添加四環素)中用普通質粒抽提方法分離獲得大小為13. 2kb的輔助質粒。將其轉化入含有Polh+BmBacmid的E. coli DH10P中，在含有卡那黴素和四環素的培養板上篩選同時含有？0111+ BmBacmid和helper質粒的DH10P菌株。 4)家蠶BmNPV Polh+ Bac-to-Bac杆狀病毒表達系統的應用情況驗證
構建了表達綠色螢光蛋白EGFP的重組病毒。首先將報告基因EGFP插入供體質粒pFastBacHT中的EcoR I位點，按照Bac-to-Bac構建重組病毒的方法，轉化同時含有上述構建的Polh+ BmBacmid和helper質粒的DH10 P感受態細胞，在LB液體培養基上震蕩培養4h(該過程發生基因轉座)，然後取部分稀釋菌液塗板，利用卡那黴素、慶大黴素、四環素、X-gal和IPTG篩選得到Polh+BmBacmid基因組中含有EGFP的菌株(白色菌斑)。
重組病毒的產生和表達挑白斑培養並提取其中的Bacmid基因組，轉染BmN細胞。在(1 = 35mm培養皿上接種約9X1S的BmN培養細胞，27。C放置lh使細胞貼壁。在12mmX 75mm的無菌管子中準備下面的溶液溶液A， 5 y L小量製備的杆狀病毒DNA溶解到100 y L的無血清TC-100培養基；溶液B，6 ii LCellfectin試劑溶解到100 y L無血清TC-100培養基。將A、B溶液混勻，室溫放置30min。期間將貼壁的BmN細胞用2mL無血清培養基洗l次，再加入lmL無血清培養基。然後加入上述脂質-DNA複合物。5h後移去轉染混合物，加入2mL含有10% FBS的TC_100。 27。C培養箱中培養96h後收穫病毒。這樣就得到了能同時表達多角體蛋白和EGFP的重組病毒。收集轉染上清，得到的芽生型病毒可以用來感染BmN細胞。 表達蛋白的SDS-PAGE和Western blot分析表達蛋白進行SDS-PAGE分析(如圖3示)，結果表明，產生的大量多角體，而且外源基因得到了高水平的表達，隨後將蛋白轉移到PVDF膜，使用的一抗為鼠抗His單抗，二抗為HRP標記的山羊抗鼠IgG抗體，最後使用TMB顯色，進行Western blot檢測(如圖4示)，結果表明本專利中構建的新系統不僅能夠形成多角體，外源基因也能夠得到較高水平的表達。 病毒經口感染家蠶幼蟲情況調查用感染後的上清液感染BmN細胞，收集、純化多角體。將純化的多角體懸浮在PBS緩衝液中，用血球計數板測定多角體濃度，並用PBS緩衝液稀釋至濃度為3. 0Xl(^NPB/mL。添食方法為將桑葉切成2cm見方的小片，在每片葉上均勻塗抹30 ii L的病毒液，稍幹後飼餵4齡起蠶，每條蠶飼餵1片帶毒葉片，待蠶將帶毒葉取食完畢後，按常規方法飼育。以30iiL無菌PBS塗抹葉片作為空白對照。同時以野生型BmNPV作為陽性對照。45d後觀察家蠶感染情況，結果表明，發現100X的個體都表現出明顯的感染症狀，與野生型病毒感染的情況完全相同。這一結果說明，形成的多角體內部包涵了ODV病毒粒子，這樣的重組病毒可以通過經口實現感染。
權利要求
一種家蠶BmNPV Polh+Bac-to-Bac杆狀病毒表達系統的構建方法，其特徵在於該方法的步驟如下1)重組轉移載體的構建以家蠶野生型BmNPV基因組DNA為模板，分別以P10-upF/P10-upB和P10-downF/P10-downB為引物PCR擴增獲得p10基因上、下遊各2kb的側翼序列p10-up和p10-down，所述p10-up包含p10啟動子；引物所設計的酶切位點在表中用下劃線標記；所述PCR擴增條件為94℃變性3min，按94℃變性45s、55℃退火45s、72℃延伸2min進行30個循環，最後72℃延伸7min；將擴增得到的p10-up和p10-down片段先使用乙醇沉澱、純化處理，再分別用HindIII/PstI和PstI/BamHI酶切處理，然後將酶切處理過的p10-up和p10-down片段先後插入到pUC19中的BamHI-PstI-HindIII位點，得到含有p10基因側翼序列頭尾相連的重組質粒pUC 19-p10-up-down；以家蠶野生型BmNPV基因組DNA為模板，以PolhF/PolhB為引物PCR擴增獲得多角體基因片段；PCR擴增反應條件為94℃變性3min，按94℃變性45s、55℃退火45s、72℃延伸1min進行30個循環，最後72℃延伸7min；克隆獲得的多角體基因片段用PstI酶切處理後連接入pUC19-p10-up-down的PstI位點，將其中正向插入的質粒命名為pUC19-p10-up-polh-down；2)Polh+BmBacmid的產生與篩選在透明的聚丙烯滅菌管中加入μL濃度為1μg/μL的pUC19-p10-up-polh-down、1μL濃度為1μg/μL的BmNPV bacmid DNA、14μL脂質體lipofectin和15μL滅菌的MilliQ H2O，輕輕混勻，常溫下放置15min，得到DNA-Lipofectin混合液；將培養皿中的處於對數生長期的BmN細胞用無血清TC-100培養基洗3次，後加入2mL無血清TC-100培養基；然後將所述DNA-Lipofectin混合液均勻加入到BmN細胞中，27℃培養過夜，吸去上清，加入2mL新鮮的含血清TC-100培養基，27℃培養5天；收集轉染後的細胞上清，隨後接種BmN細胞，回收多角體；從收集的多角體中抽提病毒DNA；然後將該DNA電轉化DH10β感受態細胞，在含有卡那黴素、X-gal和IPTG的培養板上篩選藍斑；培養48h後，挑斑進行PCR鑑定，分析多角體基因是否存在；對PCR陽性的菌斑過夜培養後抽提其中的大分子DNA，進一步電泳鑑定觀察該大分子DNA中是否有轉移質粒存在，然後將獲得的大分子DNA轉染入BmN細胞，觀察該BmN細胞是否感染並產生多角體；將純化的多角體添食家蠶觀察產生的重組病毒是否具有經口感染性；3)家蠶BmNPV Polh+Bac-to-Bac表達系統的構建從AcMNPV Bac-to-Bac的DH10Bac培養菌中用普通質粒抽提方法分離獲得大小為13.2kb的輔助質粒；將該輔助質粒轉化入含有Polh+BmBacmid的E.coliDH10β中，在含有卡那黴素和四環素的培養板上篩選同時含有Polh+BmBacmid和輔助質粒的DH10β菌株。
全文摘要
本發明公開了一種家蠶BmNPV Polh+Bac-to-Bac杆狀病毒表達系統的構建方法以家蠶野生型BmNPV基因組DNA為模板，分別以P10-upF/P10-upB和P10-downF/P10-downB為引物PCR擴增得p10-up和p10-down，處理後插入到pUC19中的BamHI-PstI-HindIII位點，得重組質粒pUC19-p10-up-down；利用pUC19-p10-up-polh-down、脂質體lipofectin和MilliQ H2O製備DNA-Lipofectin混合液，加入到BmN細胞中培養；收集轉染後的細胞上清，接種BmN細胞，回收多角體；從多角體中抽提病毒DNA並電轉化DH10β感受態細胞，篩選藍斑培養；對PCR陽性的菌斑培養後抽提大分子DNA轉染入BmN細胞；從AcMNPV Bac-to-Bac的DH10Bac培養菌中分離獲得輔助質粒；將輔助質粒轉化入含有Polh+BmBacmid的E.coli DH10β中，篩選同時含有Polh+BmBacmid和輔助質粒的DH10β菌株。本發明可產生經口添食即可感染的重組病毒，重組病毒無需經皮接種感染，提高家蠶杆狀病毒表達系統的生產效率。
文檔編號C12N15/866GK101724652SQ20091015460
公開日2010年6月9日 申請日期2009年11月19日 優先權日2009年11月19日
發明者於少芳, 吳小鋒, 楊銳, 相興偉 申請人:浙江大學