生物催化法生產r-扁桃酸及其衍生物的方法

2023-06-03 15:37:31 1

專利名稱：：生物催化法生產r-扁桃酸及其衍生物的方法
技術領域：
：本發明涉及一種生物催化法生產R-扁桃酸及其衍生物的方法。(二)
背景技術：
：R-扁桃酸是一種重要的藥物中間體，廣泛地應用於多種藥物的合成，如頭孢菌素、青黴素、抗腫瘤製劑、抗肥胖藥物、光學純的胺基酸、血管緊張肽轉化酶抑制劑、輔酶A等，還可以用來製成手性溶劑。研究表明，單一構型的扁桃酸(或扁桃酸的衍生物)所合成的藥物與外消旋的扁桃酸或其衍生物合成的藥物相比，不僅藥效更高，更關鍵的是副作用下降了，因此在許多藥物合成方面應用必須要求是單一型化合物；R-扁桃酸由於具有很好的生物分解性，是目前最受矚目的酸性光學拆分劑，可使多數外消旋體胺類和胺基酸類經非對映體異構鹽形成法進行光學拆分，如治咳藥甲嗎南的中間體八氫異喳琳衍生物可由R型扁桃酸拆分。R-扁桃酸新的用途正在不斷被開發，市場需求日益擴大。據不完全統計，國外扁桃酸主要生產公司有德國瓦克公司、日本山川藥品公司和日東化學公司等。目前國際市場上光學活性的扁桃酸需求約以年均10%以上的速度增長，已成為熱點的精細化工中間體。製備R-扁桃酸的旋光性單體大致有以下三種方法不對稱合成法、光學異構體拆分法、生物合成法，其中生物合成法為最理想的方法。1、不對稱合成法是直接利用化學合成的方法來合成扁桃酸的異構體的一種方法。Blacker等人採用不對稱合成法，以TMSCN為氰化劑，Jacobsen催化劑合成了扁桃酸及其衍生物。所得產物的e.e^為65^85X。但是該法所採用的催化劑價格昂貴，且回收不便，反應條件的要求也比較嚴格，造成成本過高，難以工業化生產。吳珊珊等人用自製的手性相轉移催化劑來催化苯甲醛和氯仿合成手性扁桃酸，但是所得的扁桃酸e.e^都不高，最大的僅為3.4%。2、光學異構體的拆分是先合成扁桃酸的外消旋體，再採用一定的方法對其進行拆分。R-扁桃酸作為一種高附加值的物質，其應用非常廣泛、且市場需求量大，其製備越來越受到重視。國內外已有很多學者嘗試用各種途徑來製備該物質。其中通過對外消旋扁桃酸的拆分可以得到R-扁桃酸。拆分的方法主要有以下幾種。①非對映體鹽結晶拆分法，面臨的共同的問題就是價格昂貴，且有一定的毒性，因此在一定程度上造成了資源的浪費和環境的汙染。②色譜拆分法，色譜法具有較好的容量、選擇性和穩定性，拆分純度最高，在手性拆分中發揮越來越重要的作用，但是該法設備費用太高，消耗大，成本太高，處理量小，因此僅限於檢測以及實驗室製備，無法用於商業生產。③手性萃取拆分法，手性萃取分離法是近幾年才提出的手性分離方法，其基本原理是依靠手性選擇體與兩種對映體生成兩種非對映體的自由能差將外消旋體分開，在足夠多的級數下，可實現對映體的高純度分離。離商業化生產還有很大的距離。④毛細管電泳拆分法，毛細管電泳(CE)是一種電遷移技術，因具有高效、快速、經濟等特點，廣泛應用於各種藥物對映體的分離其原理是加入手性選擇劑使與對映體分別結合，根據對映體和選擇劑結合的穩定常數的區別進行分離。該方法就有成本高等缺點。⑤酶法拆分，從外消旋扁桃酸出發，先利用具有立體選擇性的脂肪酶將其中的R型對映體酯化，再利用外消旋酶酯化外銷旋的的S型異構體，從而達到了拆分的目的。但是不管用那種拆分的方法，理論收率也只有50%。3、生物法製備R-扁桃酸大致有三種方法(1)先合成扁桃酸外消旋體，而後酯化或氨解，獲得扁桃酸酯或扁桃酸醯胺，再在酯化水解酶或醯胺水解酶的作用下，得到單一對映體扁桃酸。Gan即ati等人首先將外消旋體扁桃酸用交換樹脂催化轉變為扁桃酸甲酯，而後用假絲酵母中的水解酶立體水解成R-扁桃酸，光學純度只有78%。(2)以苯乙酮酸為底物直接利用具有氧化還原酶的微生物催化合成手性扁桃酸，多數是形成R-扁桃酸。TakaoM等人利用鏈球菌、假絲酵母、腸球菌、紅酵母、酵母等中的還原酶將苯乙酮酸立體還原為R-扁桃酸，但是收率較低。(3)以苯甲醛和氫氰酸為原料，先製得扁桃腈，後在腈水解酶的作用下，得到R-扁桃酸。目前已報導的含有能催化扁桃腈生產R-扁桃酸腈水解酶的微生物主要有AlcaligenesfaecalisATCC8750，AlcaligenesECU0401，PseudomonasputidaMTCC5110等。但是面臨著活性低，工業化困難等問題。
發明內容為克服上述技術的缺陷，本發明利用篩選得到的高活性腈水解酶菌株，提供一種收率高的生物催化外消旋扁桃腈化合物生成R-扁桃酸及其衍生物的方法，應用於R-扁桃酸和R-鄰氯扁桃酸的工業生產。本發明採用的技術方案是生物催化法生產手性R-扁桃酸及其衍生物的方法，所述方法包括在以式(I)所示的外消旋扁桃腈化合物為底物、以糞產鹼桿菌CCTCCNo:M208168培養獲得的腈水解酶為催化劑(催化劑可以為純化後的酶液，也可直接以含酶細胞形式參與反應)的反應體系中，於pH8.08.5、206(TC下進行水解反應，得到式(II)所示的手性R_扁桃酸化合物OHOH(II)式(1)、(II)中，R為H或滷素。涉及反應式如下4R-扁桃酸化合物I+HCN所述糞產鹼桿菌CCTCCNo:M208168為糞產鹼桿菌的突變株糞產鹼桿菌(Alcaligenesfaecalis)ZJUTBIO，保藏於中國典型培養物保藏中心，地址中國.武漢.武漢大學，430072，保藏編號CCTCCNo:M208168，保藏日期2008年10月22日，該菌株已作為新菌株在在先申請"微生物催化法生產亞氨基二乙酸及其菌株"(申請號CN200810122191.3)中予以保護。發明人經研究發現，該菌株除了可以用於亞氨基二乙酸的生產以外，還可用於R-扁桃酸化合物的生產，不同於已經報導的用於生產R-扁桃酸的其它菌種。該菌株一個顯著的特點是催化扁桃腈生產R-扁桃酸的活性比現有的菌種都高，更適合於R-扁桃酸和R-鄰氯扁桃酸的工業化生產。所述反應體系中底物外消旋扁桃腈化合物的初始濃度為10100mmol/L。所述反應在pH8.08.5的水溶液或磷酸鹽緩衝液中進行。所述腈水解酶來自糞產鹼桿菌CCTCCNo:M208168培養獲得的含酶細胞，每10ml反應體系添加所述含酶細胞溼重為1090mg。所述含酶細胞由如下方法製備得到糞產鹼桿菌CCTCCNo:M20816S接種至常規適用於糞產鹼桿菌的發酵培養基，在培養開始後06小時加入15g/L的誘導劑，於204(TC下培養2496小時，培養得到的發酵液經分離(離心或膜分離)，得到所述含酶細胞；所述誘導劑為下列之一正丁腈、異丁腈、己內醯胺。本發明採用單因素實驗和響應面法對Alcaligenes-faecalis產腈水解酶的培養基組分進行了優化，實驗結果得出最優發酵培養基組成醋酸銨12.14g/L，酵母膏7.79g/L，正丁腈3.29g/L，磷酸氫二鉀5g/L，氯化鈉lg/L，硫酸鎂0.2g/L，初始pH7.5，溶劑為水(誘導劑正丁腈直接加入至發酵培養基中)。用以上培養基，在151發酵罐中的生長與產酶情況，發酵條件溫度3(TC，接種量6%(v/v)，在上述條件下培養20h後，生物量為2.64g/L，以R-扁桃腈為底物，腈水解酶的活力達到997U/L。具體的，所述方法如下(1)糞產鹼桿菌CCTCCNo:M208168接種至發酵培養基，於2040。C下培養2496小時，培養得到的發酵液經分離，得到所述含酶細胞；所述發酵培養基終濃度組成如下醋酸銨12.14g/L，酵母膏7.79g/L，正丁腈3.29g/L，磷酸氫二鉀5g/L，氯化鈉lg/L，硫酸鎂0.2g/L，pH7.5，溶劑為水；5(2)將底物外消旋扁桃腈或鄰氯扁桃腈和步驟(1)含酶細胞加入至pH8.08.5的磷酸鹽緩衝液中，底物初始濃度為1050mmol/L，含酶細胞加入量為15g/L，於206(TC下進行水解反應，製得R-扁桃酸或R-鄰氯扁桃酸。本發明的有益效果主要體現在菌種腈水解酶活性高，菌體用量少，反應過程中廢水產量少，汙染少；反應條件溫和、能耗低；成本低，轉化率高、產率高，易於工業化生產。(四)圖1為實施例1中菌株WT10的誘變譜；圖2為15L發酵罐中A.faecalisZJUTB10的生長和產酶曲線；圖3為不同底物濃度的產物生成曲線。(五)具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護範圍並不僅限於此實施例1:菌株的篩選及鑑定1、菌種的篩選從浙江省各地的工廠的排汙口，垃圾廢棄物堆放處以及實驗室附近採集到約80份土樣用於菌種篩選。富集培養基終濃度組成(NH4)2S04lg/L，KH2P040.2g/L，Na2HP040.8g/L，MgS047H200.2g/L，CaCl20.lg/L，FeCl30.005g/L，pH7.O，溶劑為水。斜面培養基終濃度組成葡萄糖10g/L，酵母膏10g/L，K2HP045g/L，MgS047H200.2g/L，FeS040.03g/L，NaCllg/L，瓊脂20g/L，pH7.0，溶劑為水。產酶培養基終濃度組成葡萄糖10g/L，酵母膏10g/L，K2HP045g/L，MgS047H200.2g/L，FeS040.03g/L，NaCllg/L，己內醯胺lg/L，pH7.O，溶劑為水。在富集培養基中加入2mM苯乙腈作為碳氮源，土樣中的微生物經過兩次富集培養，每次富集培養時間為3d左右，培養溫度為3(TC，將培養液稀釋塗布，塗布完畢後置於生化培養箱中培養，培養溫度為30°C，培養時間以長出合適的單菌落為宜，大致為2d左右。待長出合適大小的單菌落後，將單菌落轉接於試管斜面並編號，繼續置於生化培養箱中培養，培養溫度為30°C，培養23d。再從已長好的斜面中挑取一環轉接至產酶培養基中，搖瓶培養溫度為30°C，搖床轉速為150rpm。觀察微生物的生長情況，培養23d後，將發酵液高速冷凍離心(10000rpm，4°C，10min)得到菌體，並用生理鹽水洗滌一次，離心後棄上清用於轉化。轉化條件如下磷酸鹽緩衝液(10mM，pH7.2)中，加入菌體，使得菌懸液濃度為6g/l，扁桃腈10mM。通過HPLC分析產物R-扁桃酸的濃度及其光學活性。經過兩次富集培養得到225株菌株，它們可以利用該腈化合物作為碳氮源。將這225株菌株在以己內醯胺作為產酶誘導劑的培養基中進行發酵培養後，用於轉化底物扁桃腈。其中編號為WT10的菌株活性最高，達到了53.09U/g，ee>99%。2、菌種的鑑定菌種WT10養約ld後，在平板上形成紅色略透明、略突起、邊緣薄、不整齊的菌落。通過革蘭氏染色確定其為革蘭氏陰性菌，在顯微鏡下觀察，細胞為短杆狀，成對或成鏈狀生長。掃描電鏡下放大可以清楚地觀察到其大小約為1.21.5X0.60.8iim，周生鞭毛。生化反應特點為不分解任何糖類，在氧化發酵培養基中產生鹼性反應，在蛋白腖肉湯中產氨，可使pH值達8.6以上。應用革蘭氏陰性細菌鑑定試驗卡(GNI)鑑定，菌種WT10生化特徵如下characteristicsResultsGramstainingDP3-300Glucoese(oxidative)GrowthControl+Acetamide+EsculinPl肌tlndic肌UreaCitrate+Malonate+Phenylal肌inePolymyxinBLactoseMaltoseMannito1XyloseRaffinose7characteristicsResultsSorbitolSucoseInositolAdonitolp-CounmricH2So_NitrophenolRhamnoseArabinoseGlucose(Fermentative)ArginineLysineOrnithineOxidase10%lactose+，陽性；-，陰性。根據該菌種的生理生化特徵，由此可以確定菌株WT10為糞產鹼桿菌。3、菌種的誘變選育紫外線與氯化鋰複合誘變在液體培養基中加入0.5%的氯化鋰，培養後經離心獲得菌體，用生理鹽水製成菌懸液，加入玻璃珠振蕩分散，以無菌濾紙過濾，使形成單細胞，進行紫外誘變，菌懸液的濃度約為1.0X108個/ml。取製備好的菌懸液約3ml於平皿中，將盛有菌懸液的平皿置於磁力攪拌器上，離紫外燈管約25cm，紫外燈功率為15W，打開皿蓋，邊攪拌邊照射，照射時間為20s，且照射過程在暗室中進行，以免光修復，挑選正突變株進行等離子注入誘變。等離子注入誘變同上製備濃度為1.0X101Q個/ml的菌懸液，吸取0.lml塗布於8培養皿，於超淨工作檯中自然乾燥，用10kev的氮離子(N+)照射處理，離子注入量為30s(離子束單位為X2.6X1013ions/cm2s)。誘變後用無菌水洗滌平皿，將誘變後菌株塗布與平板上培養，繼續挑選正突變株進行紫外線與光復活交替處理。紫外線與光復活交替處理紫外照射同上所述，經紫外照射20s後自然光照30s，如此交替重複兩次。篩選高活性，高選擇性，並且遺傳穩定的菌株作為進一步研究的對象。誘變譜見圖1:對突變株CCTCCNo:M208168的傳代穩定性進行了研究；其結果如下tableseeoriginaldocumentpage9由此可以看出，以篩選到的A.faecalisWT10為出發菌株，結合紫外氯化鋰複合誘變，等離子誘變以及紫外和光復活交替處理誘變方法，得到突變株CCTCCNo:M20S168，活力由53U/g提高到260U/g，且具有很好的傳代穩定性。實施例2:1、含腈水解酶細胞的培養種子培養基終濃度組成醋酸銨10g/L，酵母膏6g/L，磷酸氫二鉀5g/L，氯化鈉lg/L，硫酸鎂O.2g/L，溶劑為水。將CCTCCNo:M208168菌株接種至種子培養基，3(TC培養28h，得種子液。產酶發酵培養基終濃度組成醋酸銨12.14g/L，酵母膏7.79g/L，正丁腈3.29g/L，磷酸氫二鉀5g/L，氯化鈉lg/L，硫酸鎂0.2g/L，溶劑為水。種子液以6%(v/v)的接種量轉接至優化後的發酵培養基中，15L發酵罐中裝液量為8L。培養溫度為30°C，轉速為150rpm，通氣量為0.4vvm，並且取樣檢測生物量和酶活力。結果見圖2。可見，前9個小時內，菌體生長速度比較緩慢，之後進入指數生長期，菌體生長快速，至30h時，生物量達到最大，之後生物量基本保持不變。通過對酶活力的分析發現，酶活力隨著菌體的生長逐漸增大，在20h時達到最大，生物量為2.64g/L，以R-扁桃腈為底物，腈水解酶的活力達到997U/L，之後酶活力呈下降趨勢。2、腈水解酶在不同的pH條件下轉化外消旋扁桃腈生產R-扁桃酸分別將10ml水溶液配成不同的pH值(4.9、5.3、6.2、6.9、7.7、8.3、8.6、9.1)，各自加入菌體和底物外消旋扁桃腈，使反應體系中菌體濃度(以溼重計)為5mg/ml，外消旋扁桃腈濃度為20mM，置於30°C，150r/min水浴搖床中反應2h，從而考察pH值對酶催化反應的影響。得到的結果如下tableseeoriginaldocumentpage10可見，在pH值較低的條件下，該菌的酶活力很低，隨pH值的增大有所提高。pH值增至6.2時，酶催化能力較大提高，增大至8.3時，上升至最高。再增大pH值，酶催化能力則略有所下降。3、腈水解酶在不同溫度下轉化轉化外消旋扁桃腈生產R-扁桃酸10ml磷酸鹽緩衝液(0.1M，pH8.0)中，底物外消旋扁桃腈濃度分別為20mM，細胞濃度(以溼重計)為5mg/ml，分別置於20，30，40，50，60。C，150r/min水浴搖床中反應2h，分析反應液中的R-扁桃酸含量，結果如下tableseeoriginaldocumentpage10可見，較合適的轉化溫度為30-40°C。4J青水解酶在不同的底物濃度下轉化外消旋扁桃腈生產R-扁桃酸10ml磷酸鹽緩衝液(0.1M，pH8.0)中，加入不同量的外消旋扁桃腈，使底物濃度分別為10、20、30、40、50mM，含酶細胞濃度(以溼重計)為5mg/ml，置於30°C，150r/min水浴搖床中反應，每隔一段時間取樣分析反應液中的R-扁桃酸含量，結果見圖3。當底物濃度分別為10、20、30、40和50mM時，完全轉化底物所需要的時間分別為60、150、300、420和540min。5、不同的腈水解酶濃度轉化外消旋扁桃腈生產R-扁桃酸10ml磷酸鹽緩衝液(0.1M，pH8.0)中，底物外消旋扁桃腈濃度分別為20mM，加入不同濃度的細胞菌體，使其濃度(以溼重計)分別為1，3，5，7，9mg/ml，置於3(TC，150r/min水浴搖床中反應2h，分析反應液中的R-扁桃酸含量，結果如下tableseeoriginaldocumentpage10隨著腈水解酶濃度的增大，轉化體系中R-扁桃酸的濃度逐漸升高，當腈水解酶濃度增加到大於5mg/ml時，轉化體系中R-扁桃酸的濃度幾乎不變。5mg/ml的腈水解酶濃度已經能夠滿足催化的需要。6、不同的腈水解酶濃度轉化外消旋鄰氯扁桃腈生產R-鄰氯扁桃酸10ml磷酸鹽緩衝液(0.1M，pH8.0)中，底物外消旋鄰氯扁桃腈濃度分別為20mM，加入不同濃度的細胞菌體，使其濃度(以溼重計)分別為1，3，5，7，9mg/ml，置於3(TC，150r/min水浴搖床中反應2h，分析反應液中的R_鄰氯扁桃酸含量，結果如下579R-鄰氯扁桃酸濃度(mM)6.810.114.315.415.3可見，CCTCCNo:M208168不僅可以用於R_扁桃酸的生產，對於底物外鄰氯扁桃腈也具有較高的催化活性，還可以用於R-鄰氯扁桃酸的生產。權利要求生物催化法生產手性R-扁桃酸及其衍生物的方法，所述方法包括在以式(I)所示的外消旋扁桃腈化合物為底物、以糞產鹼桿菌CCTCCNoM208168培養獲得的腈水解酶為催化劑的反應體系中，於pH8.0～8.5、20～60℃下進行水解反應，得到相應式(II)所示的手性R-扁桃酸化合物式(I)、(II)中，R為H或滷素。F2009101544844C0000011.tif2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於所述反應體系中底物外消旋扁桃腈化合物的初始濃度為10100mmol/L。3.如權利要求1所述的方法，其特徵在於所述反應在pH8.08.5的水溶液或磷酸鹽緩衝液中進行。4.如權利要求1所述的方法，其特徵在於所述腈水解酶來自糞產鹼桿菌CCTCCNo:M208168培養獲得的含酶細胞，每10ml反應體系添加所述含酶細胞溼重為1090mg。5.如權利要求1所述的方法，其特徵在於所述含酶細胞由如下方法製備得到糞產鹼桿菌CCTCCNo:M208168接種至適用於糞產鹼桿菌的發酵培養基，在培養開始後06小時加入15g/L的誘導劑，於204(TC下培養2496小時，培養得到的發酵液經分離，得到所述含酶細胞；所述誘導劑為下列之一正丁腈、異丁腈、己內醯胺。6.如權利要求1所述的方法，其特徵在於所述方法如下(1)糞產鹼桿菌CCTCCNo:M208168接種至發酵培養基，於2040。C下培養2496小時，培養得到的發酵液經分離，得到所述含酶細胞；所述發酵培養基終濃度組成如下醋酸銨12.14g/L，酵母膏7.79g/L，正丁腈3.29g/L，磷酸氫二鉀5g/L，氯化鈉lg/L，硫酸鎂0.2g/L，pH7.5，溶劑為水;(2)將底物外消旋扁桃腈或鄰氯扁桃腈和步驟(1)含酶細胞加入至pH8.08.5的磷酸鹽緩衝液中，底物初始濃度為1050mmol/L，含酶細胞加入量為15g/L，於2060°C下進行水解反應，製得R-扁桃酸或R-鄰氯扁桃酸。全文摘要本發明提供了一種生物催化法生產R-扁桃酸及其衍生物R-鄰氯扁桃酸的方法，所述方法包括在以式(I)所示的外消旋扁桃腈化合物為底物、以糞產鹼桿菌CCTCCNoM208168培養獲得的腈水解酶為催化劑的反應體系中，於pH8.0～8.5、20～60℃下進行水解反應，得到相應式(II)所示的手性R-扁桃酸及其衍生物本發明的有益效果主要體現在菌種腈水解酶活性高，菌體用量少，反應過程中廢水產量少，汙染少；反應條件溫和、能耗低；成本低，轉化率高、產率高，易於手性R-扁桃酸及R-鄰氯扁桃酸的工業化生產。文檔編號C12R1/05GK101701243SQ20091015448公開日2010年5月5日申請日期2009年11月2日優先權日2009年11月2日發明者徐賽珍,柳志強,沈寅初,薛亞平,鄭裕國申請人:浙江工業大學