生產目的發酵產物的方法

2023-06-03 15:41:26 1

專利名稱：生產目的發酵產物的方法
技術領域：
本發明涉及生產目的發酵產物的方法。更具體地，本發明涉及用於在微生物中超量產生目的發酵產物的方法，其中所述微生物含有導致該微生物營養缺陷型生長，但不損害該微生物超量表達所述目的發酵產物的突變。本發明還提供在該方法中使用的宿主細胞和多核苷酸序列。
許多商業上有價值的產品可以通過發酵反應製備。例如，核黃素是一種所有細菌、動物和植物所必需的基本維生素，植物和細菌可以合成核黃素，然而高等動物卻不能，它們必須從其飲食中獲取核黃素。
商業上用作食品和飼料添加劑的核黃素可以例如採用棉阿舒囊黴(Ashbya gossypii)、阿舒假囊酵母(Eremothecium ashbyii)或Candidaflareri細胞通過發酵反應製備。見例如Ainsworth，G.C.和Sussman，A.S.，真菌(The Fungi)，Academic Press，紐約(1965)；Heefner，D.L.等，WO88/09822；Hickey，R.J.，通過發酵製備核黃素(Productionof Riboflavin by Fermentation)，工業發酵(IndustrialFermentation)(Underkofler，L.A.和Hickey，R.J.編)第157-190頁，Chemical Publishing公司，紐約(1954)；和Perlman，D.等，FermentationInd.Eng.Chem.441996-2001(1952)。
在枯草芽孢桿菌(B.subtilis)中，催化從鳥苷三磷酸(GTP)和5-磷酸核酮糖生物合成核黃素所必需的酶由4個基因(ribG，ribB，ribA和ribH)編碼。見

圖1A。這些基因位於一個操縱子中，其中的基因順序不同於由這些酶催化的酶反應順序。例如，GTP環化水解酶II催化核黃素生物合成的第一步，其由該操縱子中的第三個基因ribA編碼。見圖2。該ribA蛋白質還編碼第二種酶活性，即DHB合成酶，該酶催化5-磷酸核酮糖轉化成四碳單元DHB。脫氨酶和還原酶由該操縱子的第一個基因ribG編碼。ribA和ribG基因產物的雙功能性可能便於形成一個協同的核黃素前體流。核黃素生物合成的倒數第二步由最後的rib基因ribH的產物2，4-二氧四氫喋啶合成酶催化。控制該途徑最後步驟的核黃素合成酶由該操縱子的第二個基因ribB編碼。位於該rib操縱子3』末端的基因X(圖1)的功能目前尚不清楚，然而其基因產物對於核黃素的合成是非必需的。
從ribP1啟動子起始的該核黃素操縱子的轉錄通過衰減機制控制，該機制涉及到位於ribPl和ribG之間的調節前導區。該前導區中的ribO突變導致該核黃素操縱子的下調表達。在含有ribC基因的錯義突變的菌株中也觀察到下調表達。最近顯示在枯草芽孢桿菌中該ribC基因編碼黃素激酶/FAD合成酶。見Mack，M.等，細菌雜誌(J.Bact.)180950-55(1998)。下調突變降低了ribC基因產物的黃素激酶活性，導致降低的黃素單核苷酸(FMN)細胞內濃度，FMN是核黃素調節系統的效應分子。
最近，對枯草芽孢桿菌微生物進行遺傳工程操作以在短髮酵周期中產生高產量的核黃素。見Perkins，J.B.，美國專利5,837,528(「Perkins的528」)，該文獻特此完整地以參考文獻方式併入本文。該方法將經典遺傳突變篩選以及發酵改良與核黃素生物合成基因的遺傳工程操作結合起來，其中所述遺傳工程操作通過下調和增加基因表達水平進行。在該系統中，通過突變編碼黃素激酶的ribC基因、將rib基因與強組成型啟動子連接以及增加rib基因的拷貝數，增加rib基因的表達。
例如，存在於Perkins的528所公開的質粒pRF69中的改造rib操縱子缺失了完整的ribP1啟動子和大部分調節前導區，並替換成組成型噬菌體SPO1啟動子P15。見圖1B。此外，在ribB和ribA基因之間引入該噬菌體啟動子以進一步增強相應下遊基因的轉錄。最後，在pRF69中rib基因下遊提供了氯黴素抗性基因。通過單交換型轉化將pFR69靶向宿主微生物RB50的rib操縱子中，其中所述微生物宿主RB50含有下調嘌呤生物合成的突變並在ribC基因中含有下調核黃素生物合成的突變。
通過pRF69對RB50進行的單交換型轉化所產生的基因組結構包括一個氯黴素抗性基因，在該基因的兩側，一端是野生型rib操縱子，另一端是pRF69的改造rib操縱子。當對具有增強的氯黴素抗性的pRF69轉化細菌進行篩選時，該結構中的這些重複元件引起該抗性基因和側翼rib操縱子的拷貝數增加。
在含有多拷貝(n)的pRF69修飾rib操縱子(即RB50[pRF69]n)的RB50中，rib基因的增強轉錄已通過Northern印跡分析獲得證實。野生型枯草芽孢桿菌積累非常少量的包括整個rib操縱子的RNA轉錄本，與此不同，RB50[pRF69]n積累大量的主要包括該操縱子頭兩個基因的較短轉錄本。ribA上遊改造的第二個P15啟動子導致包括該rib操縱子三個下遊基因的RNA轉錄本的顯著積累。見Perkins，J.B.等，J.Ind.Mierobiol.Biotechnol.，228-18(1999)。
在含有例如枯草芽孢桿菌RB50[pRF69]n的核黃素補料分批發酵反應器中，從共同的發酵底物葡萄糖產生生物質和核黃素。將葡萄糖抽入反應器的速率(「葡萄糖進料速率」)對於葡萄糖分別應用於生物質和核黃素的產生是關鍵的。快葡萄糖進料速率允許培養物以提高的速率生長，導致過量的生物質形成以及核黃素產率的降低。然而，過慢的葡萄糖進料速率儘管降低了生物質的產生，但也導致低的核黃素生產力。由於低產率、低的生產力或兩者兼有的情況增加了核黃素的生產成本，所以必須仔細調節商業核黃素髮酵反應器中的葡萄糖進料速率以在生物質和核黃素的產生之間建立一個平衡。
鑑於上述缺點，在維持對於所用反應器的大小和類型而言最為有效的生物質生產水平的同時，對目的發酵產物例如核黃素的生產進行優化將是人們所期望的。
本發明的一個實施方案是用於生產目的發酵產物的方法。該方法包括提供含有重組產生的如下微生物的發酵培養基，所述微生物超量產生目的發酵產物，並含有導致該微生物營養缺陷型生長的突變，其中所述微生物中的所述營養缺陷並不損害該微生物產生所述目的發酵產物的能力。然後，給所述培養基提供對於發酵產物的產生所必需的所有底物、目的發酵產物的底物以及補充所述營養缺陷的底物。前一種或多種底物過量提供，以確保最大的生產力。後一種底物(即，補充所述營養缺陷的底物)限量提供以保持低速率的生物質形成。
本發明的另一個實施方案是用於使發酵培養基中目的發酵產物的產生與生物質的產生脫偶聯的方法。該方法包括提供重組產生的微生物，所述微生物已被改造而含有編碼目的發酵產物生物合成酶的多核苷酸序列。在該方法中，所述目的發酵產物的最大產生取決於給所述微生物非限制地提供目的發酵產物的底物。接著，將營養缺陷引入該微生物中，以便通過限制發酵培養基中補充該營養缺陷的底物的濃度來控制生物質的產生。本發明還提供通過上述方法製備的發酵生產微生物。
作為一個進一步的實施方案，本發明還包括多核苷酸，其選自SEQ IDNO1、SEQ ID NO1的引入營養缺陷的同系物或片段、或SEQ ID NO1的含有插入、缺失或替代並保留了在宿主細胞中引起營養缺陷的能力的多核苷酸序列。
本發明的另一個實施方案是用如下多核苷酸序列轉化的宿主細胞，所述多核苷酸序列是包括SEQ ID NO1、SEQ ID NO1的保留了其在宿主細胞中引起營養缺陷的能力的同系物或片斷的多核苷酸序列，或SEQ IDNO1中含有插入、缺失或替代但保留了在宿主細胞中引起營養缺陷的能力的多核苷酸序列。
在另一個實施方案中，本發明還提供含有多拷貝的改造rib操縱子pRF69並已用SEQ ID NO1多核苷酸序列轉化的核黃素生產微生物RB50。
本發明包括用於生產目的發酵產物的方法。在該方法中，提供含有超量產生目的發酵產物的重組產生微生物的發酵培養基。所述微生物還含有引起該微生物營養缺陷型生長的突變，其中該營養缺陷並不損害該微生物產生所述發酵產品的能力。
本文所用短語「重組產生的微生物」是指經重組DNA技術修飾以產生商業上有用的目的發酵產物例如核黃素的任何微生物。例如，根據本發明的微生物可以包括細菌細胞。該微生物可以選自埃希氏菌屬(Escherichia)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、藍細菌屬(Cyanobacter)、鏈黴菌屬(Streptomyces)和棒桿菌屬(Corynebacteria)細胞。優選地，該微生物選自大腸桿菌(E.coli)、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、解澱粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)、地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)、穀氨酸棒桿菌(C.glutamicum)或產氨芽孢桿菌(B.ammoniagenes)。
在本發明中，採用重組DNA技術對所述微生物進行修飾以增加所述目的發酵產物的生產，使其高於野生型的生產水平，實施例中將對此有更詳細的說明。本文所用「目的發酵產物」是指通過發酵產生的化合物，例如核黃素、泛酸、生物素、硫胺素、葉酸、吡哆醇和胺基酸。
例如，當所述目的發酵產物是核黃素時，該重組產生的微生物是枯草芽孢桿菌細胞，例如命名為RB50[pRF69]n的枯草芽孢桿菌生產微生物，該微生物含有多拷貝(如大約5-20個拷貝)編碼rib操縱子的pRF69，該rib操縱子已用強噬菌體SPO1啟動子(P15)修飾增強了該rib基因的表達。該重組產生的微生物所產生的核黃素顯著多於野生型微生物。見Perkins的528。
用於本發明的枯草芽孢桿菌微生物RB50於1989年5月23日根據布達佩斯條約保藏在農業研究機構培養物保藏中心(NRRL)，Peoria，IL，保藏號為B 18502。用於本發明的質粒pRF69於1990年6月6日保藏在美國典型培養物保藏中心(ATCC)，Rockville，MD，保藏號為ATCC 68338。
在本發明中，所述重組產生的微生物含有引起營養缺陷型生長的突變。本文所用「突變」是指所述微生物的基因組序列中的改變，這種改變可以通過任何方便的方法引入，這些方法包括例如化學或UV誘變，之後對期望表型進行選擇或篩選；通過重組技術體外構建功能異常的基因，用於通過單和雙交換重組取代該微生物基因組中該基因的完整對應基因；以及其它熟知的技術。見，Sambrook等，分子克隆實驗室手冊(Molecular CloningA Laboratory Manual)，第2版，Cold SpringHarbor Laboratory Press(1989)，和Harwood和Cutting，用於芽孢桿菌的分子生物學方法(Molecular Biology Methods For Bacillus)，John Wiley and Sons(1990)，第27-74頁。
術語「營養缺陷型/體」、「營養缺陷型的」和「營養缺陷」在本文中可以互換使用，是指通過例如突變修飾需要添加外源化合物才能生長的微生物，在突變之前該化合物可由該微生物自身產生。因此，「營養缺陷型生長」是指被造成對特定底物具有營養缺陷的微生物在已知成分發酵培養基中生長的能力。
營養缺陷型生長所必須的外源化合物在本文中稱作「補充營養缺陷的底物」或「補充底物」。在本發明中補充營養缺陷的底物的例子包括胺基酸、核苷酸和維生素。在本發明中，微生物可以是生物素、色氨酸、賴氨酸和/或腺嘌呤營養缺陷體。該微生物也可改造成含有一個以上這種營養缺陷。特定營養缺陷的篩選對於本發明並不是關鍵的，只要該營養缺陷使目的發酵產物的產生與生物質的產生脫偶聯並且該營養缺陷不損害所述微生物產生該目的發酵產物的能力即可。
在用於發酵反應器的某些微生物例如枯草芽孢桿菌中，使用各種底物作為碳、氮和氧的來源。這些底物是產生所述目的發酵產物和生物質所必需的。如上所述，營養缺陷型微生物還要求提供「補充」底物。
本文所用短語「最大生產力」是指當對於目的發酵產物的形成所必需或有益的所有底物過量存在時，在指定的理化參數例如pH和溫度下，微生物能夠產生的目的發酵產物的最大量。最大生產力的計算方式是gm所產生的產物/gm生物質/小時。
本文所用短語「最大生長速率」是指當提供過量的生長必需的所有底物時，在指定的理化參數例如pH和溫度下，微生物所達到的最高生長速率。因此，微生物的最大生長速率是每一段時間所述微生物生物質的相對增加量。微生物的最大生長速率和最大生產力可以由本領域的技術人員採用例如連續培養發酵來確定。
如果所述發酵產品的產生所必需的一種底物未過量提供，則該底物將成為生產限速底物，而該底物的供給將決定所述目的發酵產物的生產速率(即，該方法的生產力)。同樣，如果不過量提供所述生物質生長所必需的一種底物，則該底物將成為生長限制底物，而其供給將決定生長速率。
如果一個底物的限制供應同時決定了生物質的生長速率和目的發酵產物的生產力，則稱該生物質和目的發酵產物的產生是偶聯的。在偶聯的方法中，生長和生產的限制底物是相同底物。對於核黃素髮酵系統，葡萄糖是微生物使用的主要碳源，其對於生物質和產物的形成是必需的。葡萄糖限制將導致一個「偶聯」過程。向發酵罐(也即是向微生物)中提供葡萄糖的速率的增加或降低分別決定了核黃素和生物質的產生是上調或下調。
如果一個底物(底物1)的限制供應決定所述微生物的生長速率，而另一個底物(底物2)的供應決定目的發酵產物的生產力，則稱生物質和目的發酵產物的產生是「脫偶聯的」。在「脫偶聯」的方法中，底物2的非限制供應將導致所述微生物的最大生產力。因此，在脫偶聯的方法中，例如在使用本發明營養缺陷型微生物的方法中，可以以非限制速率向發酵反應器提供葡萄糖(底物2)，以達到目的發酵產物的最大生產力，而以防止生物質以其最大生長速率增加並由此限制生物質產生的速率向發酵反應器提供補充該營養缺陷的底物(底物1)。
根據本發明微生物中營養缺陷的存在以及補充該營養缺陷的相應底物的生長限制供應均不得損害該微生物產生所述目的發酵產物的能力。在本發明中，如果補充該營養缺陷的底物的限制供應導致了不足50％的所述目的發酵產物的最大生產力，則該營養缺陷「損害了」該微生物產生目的發酵產物的能力。如果攜帶該營養缺陷的生產微生物的最大生產力低於沒有該營養缺陷的相同微生物的最大生產力的50％，則也稱該目的發酵產物的生產力受到所述營養缺陷的「損害」。
在本發明中，微生物中營養缺陷的存在通過在有或無此補充營養缺陷的相應底物的情況下於適合的發酵培養基中測定生物質的產生來確定。見實施例1。本文所用「生物質的產生」或「生物質的生長」是指特定微生物的生長和分裂能力。在本發明中，生物質的產生通過標準微生物方法測定，例如稱重總的細胞乾重或在特定波長例如550-660nm之間測量發酵樣品的渾濁度。見實施例3。或者，可以通過瓊脂平板上菌落的形成評價微生物的生長和分裂，即產生生物質的能力。
如果適合的話，微生物基因組中所存在的導致營養缺陷的突變可以通過標準分子生物學技術例如Southern雜交、PCR(見實施例1)或DNA測序來證實。這些技術對於本領域的技術人員是易於獲得的。見例如Sambrook等，分子克隆實驗室手冊，第2版，Cold Spring HarborLaboratory Press(1989)，第8-14章；和Ausubel等編，當代分子生物學實驗指南(Current Protocols in Molecular Biology)，John Wileyand Sons公司(1998)，第15章。
正如以上提及的，根據本發明的微生物優選是生物素營養缺陷型。生物素或維生素B8作為一種輔基對於許多酶包括丙酮酸羧化酶和乙醯輔酶A羧化酶是必需的。生物素是從庚二酸生物合成的，涉及多個酶反應步驟。見圖3。在枯草芽孢桿菌中用於生物素生物合成的基因聚集在單個操縱子中。見圖4。生物素營養缺陷型微生物在不補加生物素，即補充該營養缺陷的底物的情況下不能生長。類似地，賴氨酸、色氨酸和腺嘌呤營養缺陷型細胞在發酵培養基不補加相應補充該營養缺陷的底物時同樣不能生長。
在商業發酵方法中，期望限制生物質的生長速率，以例如降低昂貴的發酵底物的消耗，並保持需氧量和代謝活躍的生物質的熱量產生在發酵反應器的氧傳遞和冷卻能力的極限範圍內。在「偶聯」方法中，通過限制目的發酵底物的供應限制生物質的產生可以降低所述微生物的目的發酵產物的生產力。在採用根據本發明的營養缺陷型微生物的「脫偶聯」方法中，可以通過限制補充該營養缺陷型的底物的供應來限制生物質的產生，而目的發酵產物則以對於該產物而言微生物最大的生產力產生，這是因為產物形成所需求的所有底物均被過量提供。
在本發明中，目的發酵產物的產生與生物質的產生的脫偶聯可以通過在已經經過修飾超量表達目的發酵產物例如核黃素的微生物中引入營養缺陷來實現。因此，在本發明中，所述目的發酵產物的最大產生在所述微生物以其最大生產力合成該目的發酵產物的時候到達。
因此，本發明的營養缺陷型微生物在含有補充該營養缺陷的如下濃度底物的發酵培養基中培養，其中該底物的濃度足以維持生物質以規定生長速率生長。向該發酵培養基提供所述微生物所需要的所有其它底物，這些底物的濃度將不限制該微生物以其最大生產力產生所述目的發酵產物的能力。
存在於或補加給發酵培養基的補充該營養缺陷的底物和實現目的發酵產物的最大生產力所需要的其它底物的具體濃度將隨著所選擇的具體營養缺陷、目的發酵產物、所用反應器、生產微生物和其它熟知的發酵變量而改變。例如，在含有生物素營養缺陷型生產微生物的核黃素生產培養物中，向該發酵培養基添加的葡萄糖(即目的發酵底物)的量必須足以進行核黃素(即目的發酵產物)的超量產生。本文所用術語「超量產生」是指所述微生物以高於至少0.1％(w/w)的產率，優選高於1％(w/w)的產率，例如高於4％(w/w)的產率從用作碳源的底物產生所述目的發酵產物。
在本發明中，發酵培養基中所述目的發酵產物的底物的濃度與補充所述營養缺陷的底物的濃度之比是從約1∶10,000,000至約1∶10，優選從約1∶1,000,000至約1∶100。
在本發明中，可以從所述微生物和/或所述培養基中分離所述目的發酵產物。本文所用術語「分離的」是指所述目的發酵產物是純的，或至少部分純的。所述發酵產品可以通過本領域已知的方法純化。這些方法包括例如過濾、離心和/或提取。所述目的發酵產物可以通過從水性或有機溶劑中重結晶或應用本領域已知的其它方法例如離子交換層析、大小排阻層析或疏水相互作用層析進行進一步純化。對於從發酵培養液中分離和純化核黃素的操作的詳細描述，見Kupfer E.，歐洲專利申請EP 0730034 Al。
在一個優選的實施方案中，製備了超量產生核黃素的重組產生的微生物。對該微生物進一步修飾使其含有使核黃素的產生與生物質的產生脫偶聯的生物素營養缺陷。因此，補充該營養缺陷的底物是生物素，而發酵產物的底物是葡萄糖。例如，根據本發明的微生物是枯草芽孢桿菌核黃素生產微生物RB50，該微生物含有多拷貝的改造rib操縱子pRF69。見Perkins的528。在該實施方案中，向含有改造rib操縱子pRF69的RB50細胞引入生物素營養缺陷，該營養缺陷使得核黃素的產生與生物質的產生脫偶聯。該生物素營養缺陷型核黃素生產微生物命名為RB50[pRF69]Bio-。當以生物素作為生長限制底物進行培養時，與葡萄糖限制的培養相比，該菌株的具體核黃素生產力增加了大約3倍。見實施例3。
本發明還包括RB50[pRF69]Bio-的衍生物。本文所用RB50[pRF69]Bio-的「衍生物」是含有pRF69之改造rib操縱子或與pRF69之改造rib操縱子有至少25％一致性、優選至少50％一致性的多核苷酸序列、並是生物素營養缺陷體的任何枯草芽孢桿菌細胞，例如具有重組改造rib操縱子的、核黃素產生與生物質產生脫偶聯的其它芽孢桿菌屬微生物。在本發明中，該多核苷酸序列的一致性百分數採用BLAST程序和國家生物技術信息中心(Bethesda，MD，美國)的伺服器來確定。
在本發明中，所述微生物可以首先含有編碼一或多個具有產生核黃素之酶活性的多肽的多核苷酸序列，以及一或多個天然情況下不與該多核苷酸序列相關但現在與該多核苷酸序列在轉錄上相連的轉錄元件。
本文所用「轉錄元件」包括本領域技術人員所已知的增強子、啟動子、天然或合成的核糖體結合位點和/或終止子。見Perkins的528。在本發明中，該多核苷酸序列可以含有一種以上的上述轉錄元件。優選地，該多核苷酸序列包括至少一個啟動子。
本發明還包括在發酵培養基中使目的發酵產物的產生與生物質的產生脫偶聯的方法。該方法包括提供重組產生的如下微生物，所述微生物經改造含有編碼目的發酵產物的生物合成酶的多核苷酸序列，其中該目的發酵產物的最大生產取決於非限制地供應該目的發酵產物的底物。然後在該微生物中引入營養缺陷以便通過限制發酵培養基中補充該營養缺陷的底物的濃度控制生物質的產生。
對於本發明，所述營養缺陷向微生物的「引入」可以採用任何方便的方法進行。例如，可以採用經典誘變技術以及重組生物學技術將該營養缺陷引入至所述微生物中。優選地，通過轉化將編碼缺陷基因或一組缺陷基因的多核苷酸序列引入該微生物中，其中所述基因在該微生物中的完整對應部分是產生用於生物質生產的必需化合物所必需的。
本文所用術語「轉化」是指向微生物引入所述多核苷酸序列，以及所述多核苷酸序列與該微生物的基因組DNA通過單或雙交換機制發生重組並由此取代相應的該完整基因或一組基因。見Harwood和Cutting，用於芽孢桿菌的分子生物學方法，John Wiley and Sons(1990)，第27-74頁。向所述微生物引入所述多核苷酸序列可以通過本領域技術人員熟知的任何方便的方法來實現，這些方法例如用線形化或環狀多核苷酸序列轉化天然感受態受體細胞或原生質體、普遍性轉導、轉染、脂轉染、電穿孔、微粒轟擊等等。見，同上和Sambrook等，分子克隆實驗室手冊(第2版)，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)。
本發明的多核苷酸序列可以在枯草芽孢桿菌的bioFDB基因盒中含有缺失-插入突變，詳見實施例。優選地，該多核苷酸序列是SEQ ID NO1。在本發明中，可以用各長几百個鹼基對的突出序列對SEQ ID NO1的3』-和5』-末端進行修飾，以增加SEQ ID NO1的轉化效率。該突出序列是隨機序列，其與所述受體細胞的DNA序列的同源性應當少於80％，以防止在非期望座位發生重組。然後將這些多核苷酸序列用於轉化能夠超量產生目的發酵產物的微生物。
採用標準篩選方法選擇該缺失-插入突變的陽性轉化體，即現在是營養缺陷的轉化體。見，同上。例如，用於轉化所述微生物的多核苷酸序列可以含有各種選擇標記，包括例如抗生素抗性標記、生色標記等。優選地，該標記是新黴素抗性標記，而且對於期望轉化的選擇包括鑑定能夠在補加了新黴素的發酵培養基上生長並且超量產生所述目的發酵產物例如核黃素的微生物，詳見實施例1。
在本發明的另一個實施方案中，提供多核苷酸序列。當用該多核苷酸序列進行轉化時可以製備生物素營養缺陷型的枯草芽孢桿菌或其近緣種例如解澱粉芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌。優選地，該多核苷酸序列是SEQ IDNO1或SEQ ID NO1的引入營養缺陷的同系物。優選地，用SEQ ID NO1或其引入營養缺陷的同系物轉化芽孢桿菌屬宿主細胞，其中所述同系物保留了SEQ ID NO1在宿主細胞中引起營養缺陷的能力。
在本發明中，如果根據BLAST測定多核苷酸含有與SEQ ID NO1中所存在的部分bioF和bioB序列具有大於70％一致性的序列，則該多核苷酸被認為是SEQ ID NO1的「引入營養缺陷的同系物」。
本發明還包括用含有SEQ ID NO1或其在宿主細胞中引起營養缺陷的同系物的多核苷酸序列轉化的宿主細胞；或者是用SEQ ID NO1中含有一或多個插入、缺失和/或替換的多核苷酸序列轉化的宿主細胞，其中該序列保留了在該宿主細胞中引起營養缺陷的能力。
根據本發明，所述宿主細胞可以是能夠產生目的發酵產物的任何微生物。例如，該宿主細胞可以選自埃希氏菌屬、芽孢桿菌屬、藍細菌屬、鏈黴菌屬和棒桿菌屬的細胞。優選地，該微生物選自大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、解澱粉芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、穀氨酸棒桿菌或產氨芽孢桿菌。更優選地，該宿主細胞是枯草芽孢桿菌細胞，例如含有多拷貝的改造rib操縱子pRF69的RB50。
本發明最重要的一些結果總結在附圖中。
圖1顯示了根據本發明的枯草芽孢桿菌野生型核黃素操縱子和pRF69的改造rib操縱子。(A)顯示了rib0調節位點和結構基因ribG、ribB、ribA和ribH，以及基因X的位置。標出了上遊σA啟動子ribP1和推測的內部啟動子ribP2。並指示了基因X下遊的不依賴於ρ的轉錄終止子和ribG上遊的轉錄衰減子。(B)顯示了pRF69之改造rib操縱子的結構，標出了含有組成型噬菌體SPO1啟動子P15的該DNA序列的位置。
圖2顯示了枯草芽孢桿菌中核黃素的生物合成途徑。
圖3顯示了芽孢桿菌屬的生物素生物合成途徑。
圖4顯示了枯草芽孢桿菌的生物素(bio)生物合成操縱子。
給出以下實施例用以闡述本發明的方法和組合物。這些實施例僅是說明性的，而不旨在以任何方式限制本發明的範圍。例如，可以按如下方式對本發明進行變更在大規模工業發酵罐中實施脫偶聯方法、將稀釋速率從0.3l/h變成0.001l/h、增加所述發酵培養基中的成分濃度、將葡萄糖濃度增加至高達400g/l、和在分批或補料分批發酵反應器中實施根據本發明的脫偶聯方法。對於所有這些變化，所述培養基成分，包括生物素，可以由本領域技術人員確定和調整。
為了構建bioFDB的缺失-插入突變，採用枯草芽孢桿菌微生物1012(Saito等，分子普通遺傳學(Mol.Gen.Genet.)170117-122(1979))的基因組DNA作為模板以及以下引物，通過PCR擴增含有完整bioF、bioD和bioB基因的2938bp DNA片段BioF+1(5』-GAGAGGATCCACGAGGTTACGAGC-3』)(SEQ ID NO2)BioB-1(5』-GCGACGAATTCGACATCATACCGATTGC-3』)(SEQ ID NO3)。
該PCR反應的反應條件由25個循環構成，每個循環是95℃變性1分鐘、55℃退火1分鐘和72℃延伸3分鐘。採用Wizard PCR純化試劑盒(Promega公司)純化該PCR產物，然後用BamHI和EcoRI進行雙酶切。將此消化的PCR產物克隆至(1)BamHI-EcoRI消化的pUC19中，獲得質粒pNMR3；以及克隆至(2)BamHI-EcoRI消化的pBluescriptII SK+中，獲得質粒pNMR4。
採用下列引物在PCR反應中擴增質粒pBEST501(Itaya等，核酸研究(Nucleic Acid Res.)174410(1989))的1.2kb新黴素抗性盒，該PCR反應由25個循環構成，每個循環是95℃變性1分鐘、55℃退火1分鐘和72℃延伸3分鐘pBESTBstBI+1(5』-GCGCTTCGAAGCTTGGGCAGCAGGTCG-3』)(SEQ ID NO4)pBESTBstBI-1(5』-GCGCTTCGAATTCAAAATGGTATGCG-3』)(SEQ ID NO5)用BstBI消化pNMR3和pNMR4，除去包括部分bioF和bioB基因以及完整的bioD基因的1019bp片段。純化該擴增的新黴素抗性盒，並用BstBI消化，之後將其克隆至BstBI消化的pNMR3和pNMR4中。
然後構建以下質粒含有新黴素抗性盒的pNMR5，該新黴素抗性盒插入在bioFDB基因中，取向與pUC19中bio轉錄方向相同；含有新黴素抗性盒的pNMR6，該新黴素抗性盒插入在bioFDB基因中，取向與pUC19中bio轉錄方向相反；以及含有新黴素抗性盒的pNMR7，該新黴素抗性盒插入在bioFDB基因中，取向與pBluescriptII SK+中bio轉錄方向相反。所有這三個質粒均採用XbaI線性化，並轉化天然感受態枯草芽孢桿菌1012細胞。在含有終濃度為5μg/ml的新黴素的TBAB平板上篩選轉化體。觀察到大約250個轉化體，從其中挑取30個接種在含有或不含有0.1mg/m1生物素的Spizen氏基本培養基(SMM)上。30個菌落中有23個是生物素營養缺陷體。通過對融合接點的PCR檢驗分析6個菌落，並為之後的應用保留2個菌落(分別命名為枯草芽孢桿菌NM1和NM2)。
枯草芽孢桿菌微生物NM2用作製備PBS1噬菌體裂解物的供體微生物。使用該裂解物轉導已具有修飾的核黃素操縱子pRF69的核黃素生產微生物RB50。RB50是枯草芽孢桿菌宿主微生物，其含有引入以改良了核苷酸和核黃素的產生的幾個突變。pRF69是指通過引入強噬菌體啟動子修飾的rib操縱子，其中該啟動子被引入至pRF50的rib座位中。擴增該修飾操縱子pRF69以產生高拷貝數。Perkins的528中給出了微生物RB50和該修飾rib操縱子pRF69的詳細說明。獲得許多在沒有外源生物素時不能在SMM上生長的新黴素抗性菌落。通過PCR和Southern雜交分析其中的3個克隆，它們表現出含有bioFDBneo突變。挑選命名為NM9的一個克隆，重新命名為RB50[pRF69]Bio-。Southern印跡雜交揭示了pRF69的存在。
在補加了10μg/ml氯黴素的豐富複雜培養基(VY培養基，DSMZ培養基577)中培養RB50[pRF69]Bio-至光密度0D660＝1。將1ml該培養物轉移至補加了30μg/ml氯黴素的20ml VY培養基中，在0D值達到1後，再將1ml培養物轉移至補加了60μg/ml氯黴素的20ml VY培養基中。採用含有80μg/ml氯黴素的VY培養基重複相同的傳代。在0D值達到1後，向該培養物補加15％(體積/體積)甘油並將1ml等分試樣貯存在-80℃。抗生素濃度的逐步增加被用於篩選具有增加拷貝數的修飾rib操縱子pRF69的細菌。見Perkins的528。
在裝備了葉片式攪拌器的Bioflow 3000型New Brunswick生物反應器(3升總體積)中進行發酵。採用帶有入口泵和溢流管的連續恆化器培養，該入口泵控制流速，而該溢流管控制反應器中的液體水平面。發酵變量如下液體體積1200ml稀釋速率0.15溫度37℃pH6.75通氣每分鐘1升壓縮空氣攪拌器速度1000rpm在培養的每一個階段溶解氧濃度均在20％的空氣飽和度之上。
用於間歇期的發酵培養基和作為補料培養基的發酵培養基含有具有指定終濃度的下列成分0.25g/l穀氨酸鈉、1.57g/l KH2PO4、1.57g/lK2HPO4、2.74g/l Na2HPO4×12H2O、4.00g/l NH4Cl、0.1g/l檸檬酸、6.80g/l(NH4)2SO4、22g/l葡萄糖×H2O、0.2ml/l(基於矽的)消泡劑、14.1mg/lFeSO4×7H2O；10.5mg/l CaCl2×2H2O、9.4mg/l MnSO4×1H2O、2.7mg/lCoCl2×6H2O、1.0mg/l(NH4)6HMo7O24×4H2O、0.67mg/l AlCl3×6H2O、0.50mg/lCuCl2×2H2O；6.7g/l MgSO4×7H2O、2.68mg/l ZnSO4×7H2O。
穀氨酸鈉鹽、KH2PO4、K2HPO4、Na2HPO4×12H2O、NH4Cl、檸檬酸和(NH4)2SO4均溶解在85％的終體積中，通過加入鹽酸將pH調節至pH4，並對該溶液進行高壓滅菌。將葡萄糖溶解在10％的終體積中並單獨高壓滅菌。消泡劑以濃縮液形式單獨高壓滅菌。對於每一批培養基新鮮製備500倍濃縮的FeSO4×7H2O溶液，並過濾除菌。其它鹽製備成500倍濃縮液，並在以下組合中過濾除菌組1CaCl2×2H2O；組2MgSO4×7H2O、CoCl2×6H2O、(NH4)6HMo7O24×4H2O、AlCl3×6H2O、CuCl2×2H2O；組3MgO4×TH2O、ZnSO4×7H2O。在無菌條件下將這些分別除菌的溶液合併在一起，並加入無菌水以達到終體積。
用按以下方法製備的40ml種子培養物接種發酵罐將實施例1凍存的一份RB50[pRF69]Bio-細菌懸液融化，並轉移至補加了60μg/ml氯黴素的100ml VY培養基中。在37℃孵育該培養物直到0D值達到1(典型地在12-15個小時之後)。
發酵的間歇期(batch phase)，即發酵培養基中的葡萄糖被生長細菌耗盡的時間段，持續大約24小時。在達到葡萄糖耗竭之後，這可通過溶解氧值的急劇升高來指示，將發酵轉換成以每小時0.15稀釋率進行的連續模式(啟動進口和出口泵)。施加於發酵罐的發酵培養基是補充了10μg/l生物素(實施例3的發酵A)或3ug/l生物素(實施例3的發酵B)的上述培養基(含有20g/l葡萄糖)。在培養物達到穩態後，即在已對發酵罐體積進行過5次以上的交換之後，採取發酵樣品並進行分析。實施例3.在偶聯和脫偶聯方法中生物質和核黃素的產生在從發酵反應器進行收集之後，立即在實施例2的1ml發酵樣品中加入20μl40％NaOH溶液。在室溫孵育該樣品20秒，以溶解樣品中的核黃素晶體。對1份該懸浮液進行稀釋並用0.1摩爾磷酸鉀緩衝液(pH7.0)中和。該懸浮液中生物質的含量通過測量660tm處的渾濁度確定。調節該樣品的稀釋度以使讀數達到0.05-0.3個吸光度單位之間。
作為一種驗證，通過稱重幹細胞質量確定該懸浮液中生物質的含量。取1ml從以上獲得的該懸浮液，將其轉移至預先稱重的Eppendorf管中，並通過離心收集細菌(14,000rpm，5分鐘)。用1ml去離子水洗滌該細菌一次，於80℃真空乾燥直到達到恆定重量。通過重量分析確定該幹細胞質量。
通過HPLC分析確定上述獲得的懸浮液的無細胞上清液中核黃素的濃度。使用裝備了雙向泵、柱恆溫器和二極體陣列檢測器的Hewlett-Packard1100系統。通過不鏽鋼Supelcosil LC-8-DB柱(150×4.6mm，顆粒大小3μm)進行該樣品的分級分離。使用根據以下時間表的溶劑A(4mmol/l硫酸水溶液)和溶劑B(甲醇)的梯度洗脫時間[分鐘]％A％B0 94 62 94 615 50 5020 50 50柱體溫度設定在20℃，而流速為1.0ml/分鐘。記錄280nm處的UV吸光值，在大約11分鐘時(總的過柱時間為20分鐘)檢測核黃素峰。通過比較樣品與核黃素標準品(Sigma，St.Lous，MO，美國)的積分峰值，計算該核黃素濃度。
實施例2中所述的發酵過程的結果總結在表1中(數值代表從連續模式開始後在第45-71小時之間採取的3個樣品獲得的平均值)。
表1
在發酵B(表1)中發酵培養基中含有3μg/l生物素和20g/l葡萄糖，產生3.36g/l生物質。當生物素增加至10μg/l而保持20g/l的葡萄糖時，生物質的產率增加至5.87g/l生物質(發酵A，表1)。生物素供應的進一步增加並沒有導致更高的生物質產量。因此，在發酵A中葡萄糖(發酵底物)是生長限速底物。在發酵B中，葡萄糖是以非生長限制速率供應的。相反地，生物素(補充底物)限制生物質的生長。因此，表1的發酵A和B分別代表了本文所定義的偶聯和脫偶聯方法。
該實施例的結果顯示了，在脫偶聯方法中生物素作為生長限制底物而葡萄糖作為發酵底物(發酵B)，生物質的生產力比偶聯方法(發酵A)極大地增加(3倍)。此外，產物產率即基於消耗的葡萄糖所產生的核黃素的量在脫偶聯方法中比在偶聯方法中高了33％。
基於以上對本發明進行的描述，明顯地，本發明可以以多種方式進行改變。這些改變並不被認為偏離了本發明的範圍和精神，而且所有這些修改都包括在以下權利要求的範圍內。
序列表110F.Hoffmann-La Roche AG120生產目的發酵產物的方法130Case 20606140141150USSN 09/633,9271512000-08-081605170PatentIn Ver.2.121012113156212DNA213枯草芽孢桿菌400 1ggatccacga ggttacgagc cttgaagatt gattcctggt taaacgagcg gttagacaga 60atgaaagaag ccggcgtaca tcgtaacctg cggtcaatgg atggagcgcc ggttccagag 120aggaatattg atggcgaaaa tcaaacggtc tggtcctcaa acaattattt agggctcgca 180agcgatagac gtttgatcga tgcagcccaa acagcattgc agcaatttgg gacaggaagc 240agcggttcac gtttaacgac aggcaattcg gtctggcatg aaaagctaga aaagaagatt 300gcgagcttta aactgacaga agcggccctg ctgttttcga gcggttactt ggccaatgtc 360ggtgtccttt catccttgcc agaaaaggaa gatgtcattt taagtgacca gctcaatcat 420gcaagtatga tcgacggctg ccgactttct aaggctgata cagttgttta tcggcatatt 480gatatgaatg atcttgaaaa caagctgaat gaaacacagc gttatcagcg ccgttttatc 540gtaacagacg gagtattcag catggatggc acaatcgccc ctcttgatca gatcatctca 600cttgcgaaac gctatcatgc cttcgtggtc gttgatgatg cccacgcaac aggagttttg 660ggcgattcgg gacaaggaac gagtgaatac tttggtgttt gtcccgacat tgttatcggc 720accttaagca aagctgttgg cgcggaagga ggttttgcgg caggatcagc ggtcttcatc 780gactttttgc tgaaccatgc cagaacattt atctttcaaa ccgctattcc gccagccagc 840tgtgcggctg ctcacgaggc tttcaacatc attgaagcca gcagggaaaa acgacagctt 900ttattttctt atatcagcat gatcagaacc agtctgaaga atatgggtta tgtggtgaaa 960ggagatcaca caccgattat tcctgtagtc attggcgatg cccataaaac ggtcctattt 1020gctgaaaaac tgcagggcaa gggaatttat gctcctgcca ttcggccgcc aaccgttgcg 1080ccgggtgaaa gccggattcg aagcttgggc agcaggtcga gatcagggaa tgagtttata 1140aaataaaaaa agcacctgaa aaggtgtctt tttttgatgg ttttgaactt gttctttctt 1200atcttgatac atatagaaat aacgtcattt ttatttttat tttagttgct gaaaggtgcg 1260ttgaagtgtt ggtatgtatg tgttttaaag tattgaaaac ccttaaaatt ggttgcacag 1320aaaaacccca tctgttaaag ttataagtga ctaaacaaat aactaaatag atgggggttt 1380cttttaatat tatgtgtcct aatagtagca tttattcaga tgaaaaatca agggttttag 1440tggacaagac aaaaagtgga aaagtgagac catgtgctta ggaagacgag ttattaatag 1500ctgaataaga acggtgctct ccaaatattc ttatttagaa aagcaaatct aaaattatct 1560gaaaagggaa tgagaatagt gaatggacca ataataatga ctagagaaga aagaatgaag 1620attgttcatg aaattaagga acgaatattg gataaatatg gggatgatgt taaggctatt 1680ggtgtttatg gctctcttgg tcgtcagact gatgggccct attcggatat tgagatgatg 1740tgtgtcatgt caacagagga agcagagttc agccatgaat ggacaaccgg tgagtggaag 1800gtggaagtga attttgatag cgaagagatt ctactagatt atgcatctca ggtggaatca 1860gattggccgc ttacacatgg tcaatttttc tctattttgc cgatttatga ttcaggtgga 1920tacttagaga aagtgtatca aactgctaaa tcggtagaag cccaaacgtt ccacgatgcg 1980atttgtgccc ttatcgtaga agagctgttt gaatatgcag gcaaatggcg taatattcgt 2040gtgcaaggac cgacaacatt tctaccatcc ttgactgtac aggtagcaat ggcaggtgcc 2100atgttgattg gtctgcatca tcgcatctgt tatacgacga gcgcttcggt cttaactgaa 2160gcagttaagc aatcagatct tccttcaggt tatgaccatc tgtgccagtt cgtaatgtct 2220ggtcaacttt ccgactctga gaaacttctg gaatcgctag agaatttctg gaatgggatt 2280caggagtgga cagaacgaca cggatatata gtggatgtgt caaaacgcat accattttga 2340attcgaaagc gccgattgag tcttaccgga tggtgaataa ggaaacgctg cttgaaggcg 2400cgaagcgggc gcacgatctg aatatcggca catattgtat cgtggcaagc ggcagaggtc 2460cgtctaacag agaagtggat caggtcgtag atgcggttca ggaaattaaa gagacgtatg 2520gactgaagat ttgtgcatgt cttggactgt tgaagccaga gcaggcgaag cggctcaaag 2580atgcaggagt agaccgctat aatcataatt tgaatacgtc acagagaaac cattcaaaca 2640tcacaacctc acatacatac gatgacagag tcaatacggt tgaaatcgca aaagaatcgg 2700ggctgtctcc gtgttcaggc gccattatcg ggatgaagga gacgaaacag gatgtcattg 2760acatcgccaa aagcttgaag gctcttgacg cggattccat tcctgtgaat tttttgcatg 2820caattgatgg cacgccgtta gaaggcgtca acgaattaaa cccgctgtat tgtttaaaag 2880tgctggcgct gttccgtttt atcaatccat caaaagaaat tcgcatttcc ggaggaagag 2940aggtcaatct ccgcacattg cagccattag ggctttacgc cgcaaactcc atttttgtcg 3000gagactactt aacaactgcc gggcaagagg agacggagga tcataaaatg ctgagtgatt 3060taggctttga agttgaatca gtcgaagaaa tgaaggctag tttaagtgcg aaaagctgaa 3120agaatcaata aaagcaatcg gtatgatgtc gaattc 3156210221124212DNA213人工序列220223人工序列的描述引物序列BioF+14002gagaggatcc acgaggttac gagc242103211282 12DNA213人工序列220223人工序列的描述引物序列BioB-14003gcgacgaatt cgacatcata ccgattgc28210421127212DNA213人工序列220223人工序列的描述引物序列pBESTstB I+14004gcgcttcgaa gcttgggcag caggtcg27210521126212DNA213人工序列220223人工序列描述引物序列pBESTstBI-14005gcgcttcgaa ttcaaaatgg tatgcg2權利要求
1.用於生產目的發酵產物的方法，包括(a)提供含有重組產生的如下微生物的發酵培養基，所述微生物超量產生目的發酵產物並含有引起該微生物營養缺陷型生長的突變，其中該微生物中的所述營養缺陷並不損害該微生物產生所述目的發酵產物的能力；和(b)給所述培養基提供對於所述目的發酵產物的產生所必需的所有底物、該目的發酵產物的底物、和補充所述營養缺陷的底物。
2.根據權利要求1的方法，還包括從所述微生物和/或所述發酵培養基分離所述目的發酵產物。
3.根據權利要求1或2的方法，其中以足以維持生物質以一定生長速率生長的濃度向所述發酵培養基提供補充所述營養缺陷的底物，而以不限制所述微生物產生所述發酵產物的能力的濃度向該發酵培養基提供對於該發酵產物的產生所必需的底物。
4.根據權利要求3的方法，其中所述靶發酵底物與補充所述營養缺陷的底物之比是從1∶10,000,000至1∶10，尤其是從1∶1,000,000至1∶100。
5.根據權利要求1-4之任意一項的方法，其中所述目的發酵產物選自核黃素、泛酸、硫胺素、葉酸、吡哆醇和胺基酸。
6.根據權利要求1-4之任意一項的方法，其中所述微生物含有一個或多個拷貝的編碼具有產生核黃素之酶活性的多肽的多核苷酸序列，並含有一個或多個天然情況下不與所述微生物中的所述多核苷酸序列相關、但現在與所述微生物中的所述多核苷酸序列在轉錄上相連的轉錄元件。
7.根據權利要求6的方法，其中所述轉錄元件包含至少一個啟動子。
8.根據權利要求1-7之任意一項的方法，其中所述微生物中的所述營養缺陷選自生物素、腺嘌呤、色氨酸、賴氨酸和其組合的缺陷。
9.根據前述權利要求之任意一項的方法，其中所述補充所述營養缺陷的底物是生物素，而所述發酵產物的底物之一是葡萄糖。
10.根據權利要求9的方法，其中所述微生物是生物素營養缺陷體，而所述目的發酵產物是核黃素。
11.權利要求1-10之任意一項的方法，其中所述微生物選自埃希氏菌屬、芽孢桿菌屬、藍細菌屬、鏈黴菌屬和棒桿菌屬，尤其是選自大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、解澱粉芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、穀氨酸棒桿菌和產氨芽孢桿菌。
12.根據權利要求1-10之任意一項的方法，其中所述微生物是枯草芽孢桿菌，尤其是RB50[pRF69]Bio-或其保留了超量產生核黃素的能力的衍生物。
13.在發酵培養基中使目的發酵產物的產生與生物質的產生脫偶聯的方法，包括(a)提供重組產生的微生物，所述微生物經改造含有編碼目的發酵產物生物合成酶的多核苷酸序列，所述目的發酵產物的最大取決於非限制地供應目的發酵產物的底物；和(b)將營養缺陷引入所述微生物中，以便通過限制發酵培養基中補充該營養缺陷的底物的濃度來控制生物質的產生。
14.根據權利要求13的方法，其中步驟(b)包括將含有缺失-插入突變的多核苷酸引入所述微生物的基因組中，以破壞所述微生物產生對於生物質產生所必需的化合物的能力。
15.根據權利要求14的方法，其中所述多核苷酸在bioFDB基因盒中含有缺失-插入突變。
16.根據權利要求13-15之任意一項的方法，包括用含有bioFDB缺失-插入突變的多核苷酸序列或含有SEQ ID NO1的多核苷酸序列轉化所述微生物。
17.根據權利要求13-16的方法，其中所述目的發酵產物是核黃素。
18.通過權利要求13-16之任意一項的方法提供的微生物。
19.多核苷酸序列，其選自SEQ ID NO1或SEQ ID NO1的引入營養缺陷的同系物，和SEQ ID NO1的含有插入、缺失和替換並保留了在宿主細胞中引起營養缺陷的能力的多核苷酸序列。
20.用如下多核苷酸序列轉化的宿主細胞，所述多核苷酸序列是含有SEQID NO1或其片段或保留了SEQ ID NO1在宿主細胞中引起營養缺陷的能力的SEQ ID NO1之同系物的多核苷酸序列，或者SEQ IDNO1中含有插入、缺失和替換但保留了在宿主細胞中引起營養缺陷的能力的多核苷酸序列。
21.根據權利要求20的宿主細胞，其中該宿主細胞是枯草芽孢桿菌細胞。
22.含有多個拷貝的改造rib操縱子pRF69、並已用SEQ ID NO1的多核苷酸序列轉化的核黃素生產微生物RB50。
全文摘要
本發明提供生產目的發酵產物的方法。該方法包括提供含有重組產生的微生物的發酵培養基,所述微生物超量產生發酵產品並含有引起該微生物營養缺陷型生長的突變,其中該微生物中的所述營養缺陷並不損害該微生物產生所述發酵產品的能力。然後給所述培養基提供過量的對於所述發酵產品的產生所必需的所有底物,以及生長限制量的補充所述營養缺陷的底物。本發明還提供在此方法中使用的宿主細胞、載體和多核苷酸序列。
文檔編號C12N1/21GK1353192SQ01124749
公開日2002年6月12日 申請日期2001年8月8日 優先權日2000年8月8日
發明者H-P·豪赫曼, N·J·墨恩瑟, H·W·施裡克, J·W·斯特彬斯 申請人:羅切維他命股份公司