對鱗翅目與鞘翅目昆蟲高毒力的Bt基因、表達載體和工程菌的製作方法

2023-06-03 15:41:01

專利名稱：對鱗翅目與鞘翅目昆蟲高毒力的Bt基因、表達載體和工程菌的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物防治技術領域。進一步，本發明涉及對鱗翅目、鞘翅目害蟲均有高毒力的Bt基因、表達載體和工程菌。更進一步，本發明涉及對鱗翅目、鞘翅目害蟲均有抗性的Bt cry1Ba3基因序列、cry1Ba/cry3Aa基因組合方式，以實現兩種基因的高效表達；還涉及廣宿主表達載體pGM1105。
本發明的研究背景蘇雲金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis，簡稱Bt)在芽孢形成期能產生一種殺蟲活性的晶體蛋白，已被廣泛地應用於農業、林業、衛生害蟲的防治。
1983年，Krieg等(Krieg，A.等，J.Appli.Entomology，1983，96500-508)分離到第一株對鞘翅目害蟲高毒力的Bt菌株(Bt.tenebrionis)。1987年，Herrnstadt(Herrnstadt，C.等，Gene，1987，57(1)37-46)克隆了第一個對鞘翅目害蟲有活性的Bt殺蟲蛋白基因cry3Aa，用於防治馬鈴薯甲蟲(Leptinotarsa decernlineata(Say))。美國Ecogen公司(Sick，A.等，Nucl.Acids Res.，1990.18，1305；Entwistle，P.F.等，An Environmental BiopesticideTheory andPractice[M]，Wiley Chichester Press，UK，1993，125-146)利用質粒結合轉移等細胞工程手段構建了對鱗翅目和鞘翅目有活性的Bt工程菌。
由於單一基因編碼一種蛋白，害蟲很快對Cry3A蛋白產生抗性(Whalon，M.E.等，J.ofEconomic Entomology，1993，86(2)226-233；Nicholas，D.等，Transgenic Plant and Insect PestsBiocontrol[M]，John Wiley Sons Press，USA，1997，1-18)。這樣由於害蟲抗藥性的迅速產生，將極大縮短轉基因產品的使用壽命，造成巨大的浪費。1993年Chang，C.Y.M.等人(Chang，C.Y.M.等，Appl.Environ.Micro.1993，59815-821.)報導了Bt以色列亞種中不同晶體蛋白對蚊子幼蟲存在協同增效作用。
因此，篩選高毒力的蛋白組合，進而進行基因組合，將能提高Bt產品的殺蟲活力，擴大它的殺蟲譜。更重要的是，不同性能的殺蟲蛋白能有效克服或延緩害蟲的抗藥性產生，具有很強的實用性。
本發明的內容本發明的目的針對目前世界上防治鞘翅目害蟲所使用的Bt製劑以及轉基因產品基因品種單一、害蟲易於產生抗性、殺蟲譜較窄等不足，本發明採用兩種對鞘翅目高毒力的基因cry3Aa7和cry1Ba3進行組合，提高毒力，並利用cry1Ba3基因對鱗翅目害蟲也有活性的特點，擴大產品的殺蟲譜，以應用於轉化微生物和植物，使之表現對相關害蟲的毒性，並克服、延緩害蟲對工程菌和轉基因植物抗藥性的產生。
進一步，為便於研究Bt殺蟲蛋白基因在不同微生物受體菌中的表達，本發明構建一種能在三種親本微生物中自由穿梭的載體，克服了現有載體宿主範圍窄的不足，並通過將Btcry3Aa7基因插入其中，完成一系列的檢測工作。
本發明的技術方案1.Bt22菌株中cry3Aa基因的克隆按照Narva(Narva，K.E.等，EP0462721 A2，1991，8)等方法從Bt22菌株中提取質粒DNA，用HindIII酶完全消化質粒DNA，進行Southern雜交，探針由cry3Aa基因特異引物擴增質粒DNA而獲得，為1.38kb。引物為5』CGAACAATCGAAGTGAACATGATAC3』CATCTGTTGTTTCTGGAGGCAAT用32p進行標記；雜交方法按「分子克隆實驗指南」進行，得到雜交結果(見圖1)。發現在3kb有雜交信號，從凝膠中回收3.0kb的質粒DNA HindIII酶切片段，純化後與pBluescript SK(+)相連接，轉化大腸桿菌JM107，以cry3A基因特異性引物進行PCR檢測，篩選到陽性重組質粒pBY33(圖2、圖3)。重組質粒含有3.0kb的cry3A基因大片段。對其進行亞克隆得到pBY33-5、pBY33-6、pBY-16三種重組質粒，分別含有0.72、1.6、0.675kb的外源基因片段。DNA序列測定由北京六合通生物工程公司完成。該基因由Btδ內毒素基因國際命名委員會命名為cry3Aa7。
2.從Bt17菌株中克隆cry1Ba基因提取Bt17菌株質粒DNA，用Sau3A I酶進行部分酶切，從凝膠中回收2-7kb DNA片段，純化後與經BamHI消化、鹼性磷酸酶處理的pBluescript SK(+)載體進行連接，轉化大腸桿菌JM107後，用cry1Ba基因特異性引物Sun1Ba5/3對進行PCR擴增，篩選陽性轉化子。5』和3』端引物分別為正向引物(Forward primer)TCCTGCAGTTGACTTCAAATAGG；反向引物(Reverse primer)CAGTCGACTCATCCGATAAACACGCCAC』.
篩選得到重組質粒pHT3-66，該質粒含有cry1Ba基因全長DNA片段。進行DNA序列分析，結果表明該基因含有3687bp，由1229個胺基酸組成，分子量為139.5kDa。在第1055位鹼基因與已知cry1Ba1基因不同，其編碼的胺基酸也變成了精氨酸，即Bt17菌株中胺基酸序列與已知基因存在差異。該基因由Btδ內毒素基因國際命名委員會命名為cry1Ba3。
3.穿梭載體的構建將含Bt複製子的質粒pHT315(6.5kb)用AatII切開，用Klenow酶補成平端；以StuI和StiI雙酶切質粒pUCP19，獲得1.2kb的含有假單胞菌複製子質粒DNA片段，用Klenow大片段補平，將這兩種DNA連接，轉化大腸桿菌JM107，篩選7.7kb的重組質粒，經酶切鑑定得到pGM1105(7.7kb)，將它分別轉化螢光假單胞菌P303菌株(RifR、Nad)和Bt野生菌株Bt17、Bt22、Btk無晶體突變株BE20(Lereclus等轉化方法，Lereclus，D.等，FEMSMicrobiology Letters，1989，60211-217)，均能生長出陽性轉化子，並提取各類轉化子質粒進行酶切分析，證明pGM1105這種載體能在三種細菌中穿梭並穩定遺傳，穩定性大於90％。
4.表達載體的構建將cry3Aa7基因(3.0kb)克隆到pGM1105的HindIII位點上，轉化大腸桿菌JM107，篩選出含cry3Aa基因的重組質粒pLF31105(10.7kb)，將它轉化大腸桿菌SCS110菌株後，提取質粒，將這些質粒分別轉化螢光假單胞菌P303菌株和Bt野生菌株Bt17(含有crylBa3基因)，分別進行蛋白檢測，SDS-PAGE分析表明cry3A基因在P303和Bt17中均能正常表達67kDa蛋白，它的導入不影響Bt17中crylBa3基因表達140kDa的蛋白。cry3A基因導入Bt17得到轉化子，經過各種分子檢測，證明轉化成功，將該轉化子命名為工程菌BiotIII-I。
5.工程菌的培養和觀察採用GT培養基、1/2 LB培養基和Z氏培養基(本實驗室自製)，分別培養BiotIII-I工程菌，電子掃描顯微鏡和光學顯微鏡觀察結果，在BiotIII-I中存在方形和雙錐體形兩種晶體(見圖18)，證明兩種基因的共表達。
6.殺蟲生物活性測定測試昆蟲為鱗翅目害蟲—小菜蛾(Plutella xylostella)；鞘翅目害蟲—榆藍葉甲(Pyrrhalta aenescens)，馬鈴薯甲蟲(Leplinotarsa decernlineata)。
本發明的有益效果本發明使用對鱗翅目、鞘翅目害蟲均有抗性的Bt cry1Ba基因和對鞘翅目害蟲有活性的cry3Aa基因進行組合；利用本發明構建的廣宿主穿梭表達載體pGM1105，可將cry3Aa基因轉化導入含有cry1Ba基因的Bt17菌株中，實現兩種基因的高效表達。這兩種基因表達產物的組合所產生的對鞘翅目害蟲的毒力強於目前國際上發現的同類自然菌株和工程菌株，說明兩種基因表達產物存在顯著的協同增效作用。
進一步，本發明所涉及的cry1Ba3基因序列、cry1Ba/cry3Aa基因組合方式、廣宿主表達載體pGM1105亦為本發明所特有。


圖1為Bt22質粒Southern Blotting結果。
其中，道1、2、3、4、5分別代表cry3Aa1.38kb、λDNA/HindIII、Bt22質粒/PstI、Bt22質粒/HindIII、Bt22質粒。
圖2為Bt22、Bt17cry基因鑑定圖譜。
其中，道1、2、3、4、5、6分別代表cry3Aa 1.38kb PCR產物、1.38kb/EcoRI、pUC DNA混合(1116，883，692，501，489，404，331，242，190，147，111，110bps)、λDNA/EcoO130I、cry1Ba1.6kb PCR產物、1.6kb/Bgl II。
圖3為重組質粒pBY33(6.0kb)的限制性酶切分析。
其中，道1、2、3、4、5、6和M分別代表pBY33/BamHI、pBY33/EcoRI、pBY33/HindIII、pBY33/PstI、pBY33/SalI、pBY33/XbaI、λ/EcoO130I。
圖4為cry3Aa基因的亞克隆流程圖。
圖5為cry3Aa7基因三種亞克隆重組質粒酶切分析結果。
其中，道1、2、3、4和M分別代表pBY33-16/EcoRI、pBY33-6/EcoRI、pBY33-5/EcoRI+HindIII、pBY33/EcoRI、1kb梯度(Ladder)(1.0～9.5kb)。
圖6為Bt17質粒DNA Southern雜交結果。
其中，道1、2、3、4、5、6分別代表UV17 plasmid DNA/BamHI、UV17 plasmid DNA/SstI、UV17 plasmid DNA/SalI、UV17 plasmid DNA、λDNA/EcoO130I、cry1Ba1.6kb。
圖7為Bt17質粒DNA文庫構建流程圖。
圖8為Bt17質粒DNA部分酶切結果。
其中，道1-7分別代表不同酶量的酶切結果，道M代表λDNA/Eco130 I。
圖9為cry1Ba基因重組質粒酶切分析。
其中，道1、2、3、4和M分別代表pHT3-67/SalI、pHT3-66/SalI、pHT3-66/HindIII、pHT3-66/EcoRI、λ/Eco130I。
圖10為cry1Ba基因重組質粒PCR檢測。
其中，道1、2和M分別代表pUC Mix、1.6kb PCR產物、產物/PstI。
圖11為pGM1105載體構建流程圖。
圖12為pUCP19與pHT315酶切結果。
其中，道1、2、3、M1和M2分別代表pUCP19/HindIII、pUCP19/SfiI+StuI、pHT315/AatII、λ/EcoO130I、1kb梯度。
圖13為pGM1105(7.7kb)酶切檢測結果。
其中，道1、2、3、4、5和M分別代表pGM1105/BamHI、pGM1105/EcoRI、pGM1105/HindIII、pGM1105/SalI、pHT315/AatII、λ/EcoO130I。
圖14為重組質粒pLF31105酶切分析。
其中，道1、2、3、4、5和M分別代表pLF31105/SalI、pLF31105/HindIII、pLF31105/EcoRI、pBY33/HindIII、pGM1105/HindIII、1kb梯度。
圖15為pLF31105轉化Pf、Bt、E.coil質粒及其酶切分析。
其中，道1、2、3、4、5、6和M分別代表pLF31105(BE20)、pLF31105(Pf)、pLF31105(E.coli)、pLF31105/EcoRI、pLF31105/SalI、pLF31105/HindIII、1kb梯度。
圖16為各轉化子中cry3Aa基因PCR分析結果。
其中，道1、2、3為PCR產物，分別為pLF31105(BE20)、pLF31105(Pf)、pLF31105(E.coli)；道4、5、6為PCR產物/EcoRI，分別為pLF31105(BE20)、pLF31105(Pf)、pLF31105(E.coli)；道M1和M2分別代表pUC Mix和λ/EcoO130I。
圖17為Bt工程菌cry3Aa基因表達結果(1/2LB培養基)。
其中，道M、1、2、3、4、5和6分別代表蛋白質標記物(marker)、Btt、Bt22、BiotIII205、BiotIII-I、Bt17、HD-1。
圖18為雙價基因工程菌蛋白晶體掃描電鏡結果。
其中，18a、18b、18c分別代表BiotIII205、BiotIII-I、Bt22。
本發明的具體實施方案以下敘述本發明的實施例。應該說明的是，本發明的實施例對於本發明只有說明作用，而沒有限制作用。
需特別指出的是，儘管在實施例中詳盡描述了兩種基因在Bt中的組合與表達，然而這並不意味本發明的基因組合只限於用Bt菌株進行轉化和生產具有對上述害蟲有抗性的Bt工程菌。
因此，使用本發明所描述的cry1B和cry3基因進行組合，以提高對害蟲的毒力和抗性，並擴大殺蟲範圍，使用本發明所描述廣宿主表達載體，以本領域普通技術人員所具有的任何一種方法導入任何微生物、植物或其組織或細胞中，以及由此而獲得的具有任何抗蟲活性的微生物、植物，以及該類植物後代的種子、雜交和轉育後代，均包括在本發明所要求的權利範圍之內。
實施例1、Bt22菌株中cry3Aa基因的克隆按照Narva(Narva，K.E.等，EP0462721 A2，1991，8)等方法從Bt22菌株中提取質粒DNA，用HindIII酶完全消化質粒DNA，進行Southern雜交，探針由cry3Aa基因特異引物擴增質粒DNA而獲得，為1.38kb(鑑定結果見圖2)。引物為5』CGAACAATCGAAGTGAACATGATAC3』CATCTGTTGTTTCTGGAGGCAAT用32P進行標記；雜交方法按「分子克隆實驗指南」進行，得到雜交結果(見圖1)。發現在3kb有雜交信號，從凝膠中回收3.0kb的質粒DNA HindIII酶切片段，純化後與pBluescript SK(+)相連接，轉化大腸桿菌JM107，以cry3A基因特異性引物進行PCR檢測，篩選到陽性重組質粒pBY33(圖3、圖5)。重組質粒含有3.0kb的cry3A基因大片段。對其進行亞克隆得到pBY33-5、pBY33-6、pBY-16三種重組質粒，分別含有0.72、1.6、0.675kb的外源基因片段(亞克隆流程圖見圖4)。DNA序列測定由北京六合通生物工程公司完成。該基因由Btδ內毒素基因國際命名委員會命名為cry3Aa7。
實施例2、Bt17菌株中克隆cry1Ba基因對Bt17菌株中的cry1Ba基因進行鑑定核和定位，結果表明該基因位於大質粒上，鑑定結果見圖2，Southern雜交結果見圖6。提取Bt17菌株質粒DNA，用Sau3A I酶進行部分酶切，從凝膠中回收2-7kb DNA片段，純化後與經BamHI消化、鹼性磷酸酶處理的pBluescript SK(+)載體進行連接，轉化大腸桿菌JM107後，用cry1Ba基因特異性引物Sun1Ba5/3對進行PCR擴增，篩選陽性轉化子(Bt17質粒DNA文庫構建見圖7、8)。5』和3』端引物分別為正向引物(Forward primer)TCCTGCAGTTGACTTCAAATAGG；反向引物(Reverse primer)CAGTCGACTCATCCGATAAACACGCCAC』。
篩選得到重組質粒pHT3-66，該質粒含有cry1Ba基因全長DNA片段(結果見圖9、10)。進行DNA序列分析，結果表明該基因含有3687bp，由1229個胺基酸組成，分子量為139.5kDa。在第1055位鹼基因與已知cry1Ba1基因不同，其編碼的胺基酸也變成了精氨酸，即Bt17菌株中胺基酸序列與已知基因存在差異。該基因由Btδ內毒素基因國際命名委員會命名為cry1Ba3。該基因序列參見SEQ ID NO 2。
實施例3、穿梭載體的構建將含Bt複製子的質粒pHT315(6.5kb)用AatII切開，用Klenow酶補成平端；以StuI和StiI雙酶切質粒pUCP19，獲得1.2kb的含有假單胞菌複製子質粒DNA片段，用Klenow大片段補平，將這兩種DNA連接，轉化大腸桿菌JM107，篩選7.7kb的重組質粒，經酶切鑑定得到pGM1105(7.7kb)(分析結果見圖11、12、13)。將它分別轉化螢光假單胞菌P303菌株(具有利福平Rif和萘啶酮酸Nad抗性)和Bt野生菌株Bt17、Bt22、Btk無晶體突變株BE20(Lereclus等轉化方法，Lereclus，D.等，FEMS Microbiology Letters，1989，60211-217)。
假單胞菌轉化方法為28℃、220r/pm，LB培養基培養菌株過夜，次日進行1％接種，培養條件不變。待O.D600為0.5時，取培養好的假單胞菌菌液進行冰浴，4℃下離心收集菌體，加入1/2體積的0.1M MgCl2冰浴5min，離心收集菌體，加入1/2體積的0.05MCaCl2冰浴30min，離心收集菌體，加入1/10體積的上述CaCl2備用。餘下部分同大腸桿菌一樣。
上述兩種菌均能生長出陽性轉化子，提取各類轉化子質粒進行酶切分析，證明pGM1105這種載體能在三種細菌中穿梭並穩定遺傳，穩定性大於90％。
實施例4、表達載體的構建將cry3Aa7基因(3.0kb)克隆到pGM1105的HindIII位點上，轉化大腸桿菌JM107，篩選出含cry3Aa基因的重組質粒pLF31105(10.7kb)(見圖14)；將它轉化大腸桿菌SCS110菌株後，提取質粒，將這些質粒分別轉化螢光假單胞菌P303菌株和Bt野生菌株Bt17(含有cry1Ba3基因)(分析鑑定結果見圖15、16)；分別進行蛋白檢測，SDS-PAGE分析表明cry3A基因在P303和Bt17中均能正常表達67kDa蛋白，它的導入不影響Bt17中cry1Ba3基因表達140kDa的蛋白。cry3A基因導入Bt17得到轉化子，經過各種分子檢測，證明轉化成功，將該轉化子命名為工程菌BiotIII-I(蛋白分析結果見圖17)。
實施例5、工程菌的培養、觀察和檢測採用GT培養基、1/2LB培養基和Z氏培養基(本實驗室自行研製)，分別培養BiotIII-I工程菌，電子掃描顯微鏡和光學顯微鏡觀察結果，在BiotIII-I中存在方形和雙錐體形兩種晶體(見圖18)，證明兩種基因的共表達。
實施例6、工程菌對幾種害蟲毒力測定測試昆蟲鱗翅目害蟲—小菜蛾(Plutella xylostella)二齡幼蟲；鞘翅目害蟲—榆藍葉甲(Pyrrhalta aenescens)二～四齡幼蟲；鞘翅目害蟲—馬鈴薯甲蟲(Leplinotarsa decernlineata)二～四齡幼蟲。
殺蟲生物測定方法小菜蛾採用甘藍葉片秤重後浸葉法，96小時調查結果；榆藍葉甲採用新鮮榆樹葉片浸葉法，96小時調查結果；馬鈴薯甲蟲採用葉面噴施法，96小時調查結果。
(1)工程菌對不同種群的小菜蛾殺蟲結果(參見表1)雙價基因組合的工程菌BiotIII-I不同的稀釋倍數對小菜蛾的毒殺效果與出發菌株Bt17相當，例如，180倍稀釋樣品，BiotIII-I校正死亡率(CM)為92.56％，540倍CM為84.62％；而且對來自海南的Bt小菜蛾種群仍有較強的毒殺效果，180倍CM為57.82％，而生產使用的菌株BtC005對這個抗性種群180倍CM只有36％。
(2)工程菌對榆藍葉甲殺蟲結果(參見表2、表3)從表2中發現這些供試樣品中，工程菌BiotIII-I、Bt22、Bt17殺蟲效果CM分別為63.33％、43.33％、36.67％。雙價基因組合的工程菌BiotIII-I毒力最強，強於兩種出發菌株Bt22和Bt17。
根據表3結果，cry1Ba和cry3A兩種基因表達產物(蛋白濃度分別為0.5mg/mL)按照50∶50和40∶60的比例混合配比時，殺蟲毒力最大，CM分別為68.75％和72.73％；證明這兩種蛋白的協同增效作用顯著。
表1、工程菌對不同種群小菜蛾殺蟲測定結果北京試蟲(敏感) 海南試蟲(抗性)樣品48小時96小時 48小時 96小時校正死 校正死 校正死 校正死總蟲數 死蟲數 死蟲數 總蟲數 死蟲數死蟲數亡率％ 亡率％亡率％ 亡率％20X 3130 96.7731 100 363494.43 36 10060K 3128 9032 31 1028176071 26 9172180X 2822 7850 26 9204 289 3214 21 7100540X 3016 5333 22 7025 277 2593 18 61341620X 308 2667 18 536320X 3029 30 103029 30 1060X 2927 9310 29 1031196129 29 9252180X 3022 7333 28 9262 33175152 21 5782540X 2920 6897 25 8462 296 2067 13 36001620X 344 1176 9147CK 29 31034 29 4137表2、工程菌對榆藍葉甲殺蟲作用結果(96小時)樣品處理重複總數列數死率 ％ 校正死亡率％1/2B 培養基 2 35 0 0 0B22 10X 2 30 13 4333 433B17 10X 2 30 11 3667 366BiotIII-I 10X 2 27 19 6333 633
表3 工程菌對榆藍葉甲殺蟲增效作用結果(96小時)

樣品配比起始濃度cry3Aa7蛋白(Bt22)含量與cry1Ba3蛋白(Bt17)含量均為0.5mg/mL(3)工程菌對馬鈴薯甲蟲殺蟲結果(參見表4)結果表明Bt17(cry1Ba)菌株對馬鈴薯甲蟲具有中等毒力；Bt22(cry3Aa)與國外工程菌Bt2321具有高毒力，分別達93.97％和91.38％；雙價基因組合的工程菌BiotIII-I毒力最強，防治效果達99.15％，與化學農藥相當。充分說明雙價基因具有顯著的協同增效作用。
表4工程菌對馬鈴薯甲蟲殺蟲測定結果(96小時調查結果)樣品 處理重複 總蟲數 存活蟲數 防治效率％方差分析Bt23211X 3 636 5191.38 BCbBt22 1X 3 730 4293.97 BbBt17 1X 3 692 260 59.26 DdBiotIII-I 1X 3 631 5 99.15 Aa10X 3 548 129 74.77 Cc化藥 1500X3 760 0 100AaH2O 3 671 626 - -注化藥為德國Bayer公司生產的「保得」附本發明所涉及的DNA序列和蛋白質序列(1)SEQ ID NO 1 (cry3Aa7基因的核苷酸序列，其中下劃線部分為編碼區1932bp)AAGCTTAATT AAAGATAATA TCTTTGAATT GTAACGCCCC TCAAAAGTAA GAACTACAAA60AAAAGAATAC GTTATATAGA AATATGTTTG AACCTTCTTC AGATTACAAA TATATTCGGA120CGGACTCTAC CTCAAATGCT TATCTAACTA TAGAATGACA TACAAGCACA ACCTTGAAAA180TTTGAAAATA TAACTACCAA TGAACTTGTT CATGTGAATT ATCGCTGTAT TTAATTTTCT240CAATTCAATA TATAATATGC CAATACATTG TTACAAGTAG AAATTAAGAC ACCCTTGATA300GCCTTACTAT ACCTAACATG ATGTAGTATT AAATGAATAT GTAAATATAT TTATGATAAG360AAGCGACTTA TTTATAATCA TTACATATTT TTCTATTGGA ATGATTAAGA TTCCAATAGA420ATAGTGTATA AATTATTTAT CTTGAAAGGA GGGATGCCTA AAAACGAAGA ACATTAAAAA480CATATATTTG CACCGTCTAA TGGATTTATG AAAAATCATT TTATCAGTTT GAAAATTATG540TATTATGATA AGAAAGGGAG GAAGAAAAAT GAATCCGAAC AATCGAAGTG AACATGATAC600AATAAAAACT ACTGAAAATA ATGAGGTGCC AACTAACCAT GTTCAATATC CTTTAGCGGA660AACTCCAAAT CCAACACTAG AAGATTTAAA TTATAAAGAG TTTTTAAGAA TGACTGCAGA720TAATAATACG GAAGCACTAG ATAGCTCTAC AACAAAAGAT GTCATTCAAA AAGGCATTTC780CGTAGTAGGT GATCTCCTAG GCGTAGTAGG TTTCCCGTTT GGTGGAGCGC TTGTTTCGTT840TTATACAAAC TTTTTAAATA CTATTTGGCC AAGTGAAGAC CCGTGGAAGG CTTTTATGGA900ACAAGTAGAA GCATTGATGG ATCAGAAAAT AGCTGATTAT GCAAAAAATA AAGCTCTTGC960AGAGTTACAG GGCCTTCAAA ATAATGTCGA AGATTATGTG AGTGCATTGA GTTCATGGCA1020AAAAAATCCT GTGAGTTCAC GAAATCCACA TAGCCAGGGG CGGATAAGAG AGCTGTTTTC1080TCAAGCAGAA AGTCATTTTC GTAATTCAAT GCCTTCGTTT GCAATTTCTG GATACGAGGT1140TCTATTTCTA ACAACATATG CACAAGCTGC CAACACACAT TTATTTTTAC TAAAAGACGC1200TCAAATTTAT GGAGAAGAAT GGGGATACGA AAAAGAAGAT ATTGCTGAAT TTTATAAAAG1260ACAACTAAAA CTTACGCAAG AATATACTGA CCATTGTGTC AAATGGTATA ATGTTGGATT1320AGATAAATTA AGAGGTTCAT CTTATGAATC TTGGGTAAAC TTTAACCGTT ATCGCAGAGA1380GATGACATTA ACAGTATTAG ATTTAATTGC ACTATTTCCA TTGTATGATG TTCGGCTATA1440CCCAAAAGAA GTTAAAACCG AATTAACAAG AGACGTTTTA 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ATTTCGATAA2340AACGATAAAT AAAGGAGACA CATTAACGTA TAATTCATTT AATTTAGCAA GTTTCAGCAC2400ACCATTCGAA TTATCAGGGA ATAACTTACA AATAGGCGTC ACAGGATTAA GTGCTGGAGA2460TAAAGTTTAT ATAGACAAAA TTGAATTTAT TCCAGTGAAT TAAATTAACT AGAAAGTAAA 2520GAAGTAGTGA CCATCTATGA TAGTAAGCAA AGGATAAAAA AATGAGTTCA TAAAATGAAT 2580AACATAGTGT TCTTCAACTT TCGCTTTTTG AAGGTAGATG AAGAACACTA TTTTTATTTT 2640CAAAATGAAG GAAGTTTTAA ATATGTAATC ATTTAAAGGG AACAATGAAA GTAGGAAATA 2700AGTCATTATC TATAACAAAA TAACATTTTT ATATAGCCAG AAATGAATTA TAATATTAAT 2760CTTTTCTAAA TTGACGTTTT TCTAAACGTT CTATAGCTTC AAGACGCTTA GAATCATCAA 2820TATTTGTATA CAGAGCTGTT GTTTCCATCG AGTTATGTCC CATTTGATTC GCTAATAGAA 2880CAAGATCTTT ATTTTCGTTA TAATGATTGG TTGCATAAGT ATGGCGTAAT TTATGAGGGC 2940TTTTCTTTTC ATCAAAAGCC CTCGTGTATT TCTCTGTAAG CTT2983(2)SEQ ID NO 2(cry1Ba3基因的核苷酸序列和其編碼的蛋白質的胺基酸序列)1 TTGACTTCAAATAGGAAAAATGAGAATGAAATTATAAATGCTGTATCGAATCATTCCGCA 601 L T S N R K N E N E I I N A V S N H S A 2061 CAAATGGATCTATTACCAGATGCTCGTATTGAGGATAGCTTGTGTATAGCCGAGGGGAAC 12021 Q M D L L P D 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H G A T N T S I N P V T L 3801141 CGGTTCGCATCTCGAGACGTTTATAGGACTGAATCATATGCAGGAGTGCTTCTATGGGGA 1200381 R F A S R D V Y R T E S Y A G V L L W G 4001201 ATTTACCTTGAACCTATTCATGGTGTCCCTACTGTTAGGTTTAATTTTACGAACCCTCAG 1260401 I Y L E P I H G V P T V R F N F T N P Q 4201261 AATATTTCTGATAGAGGTACCGCTAACTATAGTCAACCTTATGAGTCACCTGGGCTTCAA 1320421 N I S D R G T A N Y S Q P Y E S P G L Q 4401321 TTAAAAGATTCAGAAACTGAATTACCACCAGAAACAACAGAACGACCAAATTATGAATCT 1380441 L K D S E T E L P P E T T E R P N Y E S 4601381 TACAGTCACAGGTTATCTCATATAGGTATAATTTTACAATCCAGGGTGAATGTACCGGTA 1440461 Y S H R L S H I G I I L Q S R V N V P V 4801441 TATTCTTGGACGCATCGTAGTGCAGATCGTACGAATACGATTGGACCAAATAGAATCACC 1500481 Y S W T H R S A D R T N T I G P N R I T 5001501 CAAATCCCAATGGTAAAAGCATCCGAACTTCCTCAAGGTACCACTGTTGTTAGAGGACCA 1560501 Q I P M V K A S E L P Q G T T V V R G P 5201561 GGATTTACTGGTGGGGATATTCTTCGAAGAACGAATACTGGTGGATTTGGACCGATAAGA 1620521 G F T G G D I L R R T N T G G F G P I R 5401621 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12203661 GTGGAATTACTCCTCATGGAAGAATAG 36871221 V E L L L M E E *1240
權利要求
1.一種Bt基因cry1Ba3的基因序列，其特徵是該序列具有如SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列，編碼具有如SEQ ID NO 2所示的胺基酸序列的蛋白質，且對昆蟲具有毒性；
2.權利要求1的基因序列，其中所說的基因序列包括該基因序列的部分序列；
3.權利要求1的基因序列，其中所說的基因序列包括該基因序列的同源序列；
4.權利要求1的基因序列，其中所說的昆蟲是鱗翅目和鞘翅目昆蟲；
5.一種對昆蟲具有活性的蛋白質的胺基酸序列，其特徵是該蛋白質的胺基酸序列是由權利要求1的基因序列所編碼，具有如SEQ ID NO 2所示的胺基酸序列，且對昆蟲具有毒性；
6.權利要求5的胺基酸序列，其中所說的胺基酸序列包括該胺基酸序列的部分序列；
7.權利要求5的胺基酸序列，其中所說的胺基酸序列包括該胺基酸序列的同源序列；
8.權利要求5的胺基酸序列，其中所說的昆蟲是鱗翅目和鞘翅目昆蟲；
9.一種能夠在蘇雲金芽孢桿菌-大腸桿菌-假單胞菌之間穿梭的遺傳載體，其特徵是該穿梭表達載體是由一個來自蘇雲金芽孢桿菌-大腸桿菌的穿梭載體和一個來自假單胞菌的質粒DNA複製子所構建；
10.一種基因表達載體，其特徵該表達載體是由權利要求9的遺傳穿梭載體和如SEQID NO 1所示的基因序列所構建；
11.一種轉化Bt細胞獲得工程菌的方法，其特徵是該方法應用權利要求10的基因表達載體；
12.一種基因cry1Ba與cry3Aa7的組合，其特徵是該組合可應用於轉化微生物和植物，使之表現出對相關害蟲的毒性，並克服或延緩昆蟲對工程菌和轉基因植物抗藥性的產生；
13.一種蛋白質Cry1Ba與Cry3Aa7的組合，其特徵是該組合可應用於轉化微生物和植物，使之表現出對相關害蟲的毒性，並克服或延緩昆蟲對工程菌和轉基因植物抗藥性的產生；
14.一種廣義表達載體pGM1105，其特徵是該載體是依據權利要求1、5、9、10、11而構建，且能夠用於多種宿主生物(細胞)；
15.一種表達載體pLF31105，其特徵是該載體攜帶有如SEQ ID NO 1所示的基因序列。
全文摘要
本發明為「對鱗翅目與鞘翅目昆蟲高毒力的Bt基因、表達載體和工程菌」，屬生物防治技術領域。進一步，本發明涉及對鱗翅目、鞘翅目害蟲均有抗性的Bt crylBa3基因序列，涉及crylBalcry3Aa基因組合方式，還涉及廣宿主表達載體pGM1105。更進一步，本發明使用對鱗翅目、鞘翅目害蟲均有抗性的Bt crylBa基因和對鞘翅目害蟲有活性的cry3Aa基因進行組合，以提高基因對有關害蟲的毒性；利用本發明構建的廣宿主穿梭表達載體pGM1105，將cry3Aa基因轉化導入含有crylBa基因的Bt17菌株中，以實現兩種基因的高效表達。本發明所涉及的兩種基因或其表達產物的組合所產生的對鞘翅目害蟲的毒力強於目前國際上發現的同類自然菌株和工程菌株，說明在兩種基因或其表達產物之間存在顯著的協同增效作用。
文檔編號C12N15/70GK1401773SQ0112416
公開日2003年3月12日 申請日期2001年8月20日 優先權日2001年8月20日
發明者張 傑, 黃大昉, 宋福平, 陳中義, 李國勳 申請人:中國農業科學院植物保護研究所