偶聯輔酶依賴型酶反應系統的製作方法

2023-05-28 03:11:16

專利名稱：偶聯輔酶依賴型酶反應系統的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種偶聯酶作用反應系統，其特徵在於反應在均勻的溶劑混合物中進行。具體而言，本發明涉及一種反應系統，其包括有機化合物的輔酶依賴型酶轉化，其中該輔酶在相同的系統中用酶再生。
背景技術：
通過生物催化方法製造諸如醇和胺基酸的光活性有機化合物越來越重要。具有輔酶再生作用的兩種脫氫酶的偶聯用途已成為大規模工業合成這些化合物的方法(DE19753350)。
方程式1 用NAD依賴型甲酸脫氫酶在丙酮酸三甲基酯的還原性氨基化作用中於原位使NADH再生以得到L-叔亮氨酸(Bommarius等，TetrahedronAsymmetry 1995，6，2851-2888)。
在水性介質中有效使用的生物催化劑，除了其催化特性和功效以外，還具有以下優點與大量的合成型含金屬的催化劑相反，無需使用含金屬的原料，特別是那些含有重金屬並因此而有毒的物質。也無需在不對稱還原反應中使用昂貴且有害的還原劑，例如硼烷。
然而，水溶性差的基材反應存在困難。相似的困難也存在於水溶性差的產品中。原則上可能的溶液可以是在極性有機溶劑或其水溶液中進行生物催化還原反應。這此情況下，酶和基材以及若合適的產品均應為水溶性的。然而，直接存在有機溶劑的普遍缺點在於在這些條件下，酶活性通常會顯著降低(例如參見Anderson等，Biotechnol.Bioeng.1998，57，79-86)。具體而言，作為工業規模上目前唯一使用並具有可商購數量的甲酸脫氫酶，FDH不幸地對有機溶劑具有高敏感性。這在比較例1中表現得很明顯，比較例1使用在各種情況下的添加量為10％的DMSO、環丁碸、MTBE、丙酮、異丙醇和乙醇作為有機溶劑成分(參見

圖1)。
用於解決來自Candida boidinii的甲酸脫氫酶在有機溶劑存在的情況下的穩定化問題的各種配置品是已知的，例如額外使用表面活性劑作為表面活性物質來進行反應。然而，其缺點是反應速率下降約40倍，並發生甲酸脫氫酶的抑制作用(B.Orlich等，Biotechnol.Bioeng.1999，65，357-362.)。此外該作者還指出，因為所用的醇脫氫酶的穩定性低，所以在微乳液的這些條件下的還原反應不經濟。
原則上另一種進行生物催化反應的可能性包括在有機溶劑中使用固定化酶，或在含有水和可與水混溶的有機溶劑的均勻溶液中使用酶。然而，這些其中有機溶劑與酶發生直接接觸的方法僅限於少數幾種酶，特別是水解酶。因此例如DE4436149指出，「直接存在的有機溶劑(可與水混溶或不可與水混溶的)僅適合少數屬於水解酶的酶」。此外，其它種類酶的一些實例雖然是已知的(例如尤其是醇腈酶)，但DE4436149的陳述仍適用於大多數的酶。例如來自Candida boidinii的FDH的有效固定化作用並不是已知的。此外，固定化作用本身會由於固定化步驟和固定化材料而產生額外成本。
因為酶的去活化或改性具有風險，因此工業上開發了避免存在有機溶劑的方法。例如DE4436149描述了一種方法，其中通過產品可透過的膜，特別是疏水膜，將產品從反應溶液中提取至有機溶劑中。然而，與攪拌釜反應器中的標準方法相比，尤其是因為所需的有機膜也是額外的價格因素，所以該方法需要明顯更多的技術費用。此外，該方法僅適於連續處理。
總之，可以說還沒有有助於克服上述缺點的方法是已知的。

發明內容
因此，本發明的目的在於提供一種可能性，它使得偶聯輔酶依賴型的酶反應足以在特別弱水溶性的有機化合物中進行，從而使其可在特別有利於經濟和環保的條件下應用於工業規模。
該目的是根據本發明的權利要求加以實現的。權利要求1至8涉及一種根據本發明運行的反應系統。權利要求9保護一種裝置。權利要求10涉及一種根據本發明運行的方法，而權利要求11和12涉及一種根據本發明的反應系統的優選的用途。
通過提供一種偶聯酶反應系統，其包括有機化合物的輔酶依賴型的酶轉化以及輔酶的酶再生，該反應系統在包括具有至少兩個羥基或醚基的有機烴類的均勻水性溶劑系統中運行，特別地，所述目的通過驚人的、無法預計的且根據本發明而特別有利的方法加以實現。與可由現有技術得出的觀點相反，雖然存在特別的水溶性有機烴類，仍可驚人地使該偶聯酶反應系統能夠在不由溶劑引發其中一種酶的活性損失的情況下運行。
已證明優選使用的有機烴類是通式(I)的化合物 其中n是0至10的整數，m是0或1，
R1至R8相互獨立地代表H、(C1-C8)烷基、(C2-C8)烷氧基烷基、(C6-C18)芳基、(C7-C19)芳烷基、(C1-C8)烷基-(C6-C18)芳基、(C3-C8)環烷基、(C1-C8)烷基-(C3-C8)環烷基、(C3-C8)環烷基-(C1-C8)烷基。
就此而言，特別優選使用乙二醇、DME或甘油。
本領域技術人員可以任意選擇將有機助溶劑添加至反應混合物中的量。因此，最優的量可通過常規實驗加以確定。基於存在的水性相，添加量優選為1至80體積％，更優選為5至60體積％，尤其優選為10至45體積％。
作為輔酶，優選使用在反應條件下最常見且運行最經濟的輔酶。它們特別是輔酶NADH或NADPH。
優選使用脫氫酶作為用於使有機化合物轉化的酶。然而原則上，該反應系統也可用任何其它輔酶依賴型的氧化還原酶來運行，其中該輔酶被氧化還原酶消耗並可通過第二酶系統再生，即該系統是偶聯酶系統。其它合適的此類酶可參見文獻(有機合成中的酶催化劑(EnzymeCatalysis in Organic Synthesis)；Ed.K.Drauz，H.Waldmann，Vol.I and II，VCH，1995)。
已證明醇脫氫酶或胺基酸脫氫酶是優選使用的酶。
輔酶的再生特性主要取決於所用的輔酶本身。輔酶的各種再生方法參見上述文獻。在溶劑、酶和空間/時間產率的給定邊界條件下，本領域技術人員可自由選擇再生介質。通常就作為輔酶的NAD+(在氧化反應中)而言，出自例如短乳桿菌或L.kefir的氧化酶NADH是合適的(DE10140088)。在還原反應的情況下，由甲酸脫氫酶使輔酶NADH再生也被進一步證明是非常成功的。
本發明還涉及一種用於使包含本發明反應系統的有機化合物轉化的裝置。其例如可為酶試劑盒。
有利地使用的裝置是例如攪拌釜或串聯攪拌釜，或膜反應器，其可以分批式地以及連續地工作。
在本發明的範疇內，膜反應器應理解為可將催化劑封閉入反應器中，而低分子量物質可被送入該反應器中或可將其去除的任何反應容器。此處的膜可直接整合到反應空間內，或於外部併入分離的過濾組件中，其中該反應溶液連續或間歇地流經該過濾組件，而殘留的產品被再循環至所述反應器中。特別是WO 98/22415；以及Wandrey等在Yearbook 1998，Verfahrenstechnik und Chemieingenieurwesen[Process Technology andChemical Engineering]，VDI p.151及隨後頁；Wandrey等在AppliedHomogeneous Catalysis with Organometallic Compounds，vol.2，VCH 1996，p.832及隨後頁；Kragl等，Angew.Chem.1996，6，684 et seq描述了合適的具體實施方案。
可在該裝置中進行的連續過程，除分批式處理和半連續式處理以外，此處還可以根據需要以交叉流動過濾模式(圖3)或終端過濾(圖2)進行。現有技術中基本上描述了這兩種不同的方法(Engineering Processesfor Bioseparations，ed.L.R.Weatherley，Heinemann，1994，135-165；Wandrey等，Tetrahedron Asymmetry 1999，10，923-928)。
本申請還提供一種使用根據本發明的反應系統使有機化合物發生酶轉化的方法。該方法優選用於製備對映異構體富集的有機化合物，優選為α-胺基酸或手性醇。
藉助於所述的反應系統和下述的實施例，該工藝過程可由本領域技術人員如所期望地實現。因此，在給定的邊界條件下對用於酶反應的其他已知的條件進行設定。
本發明一個方面還在於根據本發明的反應系統使有機化合物發生酶轉化或用於判斷或分析特殊的有機物質的用途。有機化合物的酶轉化優選在形成對映異構體富集產品的情況下實施。
根據本發明，偶聯酶系統應理解為在消耗輔酶的情況下進行有機化合物的酶轉化，並且通過第二酶系統在原位使該輔酶再生。因此，這減少了昂貴的輔酶的使用。
這裡令人十分驚奇的是，不同於現有的教導，存在的有機介質並不會破壞所用的兩種酶，因此可以以非常優良的空間/時間產率製備所期望的產品。
如所示出的，與大多數導致所用的FDH迅速失活的有機溶劑(參見比較例)相反，使用DME和乙二醇，在數天以後仍可觀察到甲酸脫氫酶突出的穩定性特性。例如，在丙酮和DMSO存在的情況下，酶的活性在24小時以內分別下降了35和66％，而在10％DME存在的情況下，即使在5天以後酶的活性仍保持在80％。DME和乙二醇的結果如圖1所示，並列於表3中。其它有機溶劑的比較例也如圖1中所示。
用來自Candida boidinii的野生型甲酸脫氫酶以及該酶通過基因工程改性的形式實施方法(DE19753350)。如上所述，優選使用NADH作為輔酶。對於實驗性研究，例如可使用自然的或重組形式的來自紅球菌屬的ADH，優選來自紅平紅球菌的ADH作為ADH成分。所用的酶可以任何期望的提純的天然形式或重組製備的形式用於該反應中。也可將它們以寄助物的完整全細胞的形式加以使用。在本說明書的範疇內，其中兩種酶系統以適合於最優反應的狀態存在於全細胞催化劑中(DE10218689)的實施方案同樣是有利的。
更有趣的是，醇脫氫酶在式(I)的有機烴類存在的情況下也具有高穩定性。因此，根據本發明的溶劑系統適合於進行不對稱生物催化還原反應。這通過分別從對氯乙醯苯或對-(正丁基)乙醯苯起始的不對稱合成1-對氯苯乙烷-1-醇或1-正丁苯乙烷-1-醇而已經試驗性地加以研究。
在110小時的反應時間之後，對氯乙醯苯或對-(正丁基)乙醯苯作為基材分別以59％或70％的形成率形成產品。
本方法的一個主要優點在於該方法的簡單性。例如，該方法不包括昂貴的方法步驟，而且該方法可在分批式反應器中實施，也可連續地實施。與以前的方法相反，該方法也不需要將水性介質與有機介質分離的特殊膜。本方法中還省略了目前在一些方法中需要添加的表面活性劑。這一點無法從現有技術中看出，然而卻使本方法極其有利。
直鏈型或分支型(C1-C8)烷基可為甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基、庚基或辛基，包括它們所有相關的異構體。(C2-C8)烷氧基烷基是指烷基鏈被至少一個氧官能團間隔並且兩個氧原子不能彼此相連的基團。碳原子數是指該基團中所含碳原子的總數。也包括所有相關的異構體。
(C3-C8)環烷基是指環丙基、環丁基、環戊基、環己基或環庚基等。由雜原子取代的環烷基優選為例如1-、2-、3-、4-哌啶基、1-、2-、3-吡咯烷基、2-、3-四氫糠基、2-、3-、4-嗎啉基。
(C3-C8)環烷基-(C1-C8)烷基是指經由上述烷基與分子鍵結的上述環烷基。
(C6-C18)芳基是指具有6至18個碳原子的芳基。其特別包括諸如苯基、萘基、蒽基、菲基和聯苯基的基團。
(C7-C19)芳烷基是經由(C1-C8)烷基與分子鍵結的(C6-C18)芳基。
對映異構體富集是指一種旋光對映體在它的其他旋光對映體的混合物中所佔的比例大於50％。
所示的結構涉及所有可能的非對映體，並且就一個非對映體而言，涉及此處所討論化合物的兩種可能的對映異構體。
均勻的水性溶劑系統，根據本發明是指所用的烴類形成一種具有水相的均勻溶液，並因此最終僅存在一種液態相。
具體實施例方式
用下述實施例闡明根據本發明的方法。
圖2所示為具有終端過濾的膜反應器。將基材1經過泵2傳遞至包含膜5的反應器空間3中。在用攪拌器工作的反應器空間中，除溶劑以外，還有催化劑4、產品6和未反應的基材1。低分子量產品6主要由膜5濾出。
圖3所示為具有交叉流過濾的膜反應器。此處將基材7經過泵8傳遞至攪拌的反應器空間中，其中還有溶劑、催化劑9和產品14。由泵16形成經過可能存在的熱交換器12導入交叉流過濾室15中的溶劑流。此處由膜13將低分子量產品14分離開。然後使高分子量的催化劑9隨溶劑流，若適當則再次經過熱交換器12，若適當則經過閥11，返回反應器10中。
實驗部分實施例1(FDH活性的比較例)稱出2.72g(0.8mol/l)的甲酸鈉和1.14g(0.1mol/l)的三水合磷酸氫二鉀，並溶解於40ml完全軟化的水中。用氨水(25％)和甲酸(100％)或合適的稀釋物將該溶液的pH調節至8.2。然後將該溶液移至50ml的容量瓶中，並用完全軟化的水加滿。除此以外，稱出71.7mg(4mmol/l)的三水合NAD+，並溶解於約20ml完全軟化的水中。用氨水(25％)和甲酸(100％)或合適的稀釋物將該溶液的pH調節至8.2。然後將該溶液移至25ml的容量瓶中，並用完全軟化的水加滿。然後將各500μl基材溶液和NADH溶液在用於測量的1cm的室中混合。在添加10μl的酶溶液之後，使用有機溶劑(參見表)在水中的10％的溶液作為溶劑，將該混合物簡單搖動，將該室置於光度計中並開始記錄數據。僅在開始測量之前立即添加酶溶液。在一定的時間間隔之後通過光度測量由NAD+生成NADH的反應而確定酶的活性。在溫度為30℃、波長為340nm及測量時間為15分鐘的條件下進行光度測量。結果列於表1和表2中。
表1以U/ml計的FDH酶活性作為溶劑和時間的函數

表2以U/ml計的FDH酶活性作為溶劑和時間的函數

實施例2(測量FDH活性)按照實施例1中的方法測定活性，使用DME和乙二醇作為有機溶劑成分。結果列於表3中。
表3以U/ml計的FDH酶活性作為溶劑和時間的函數

實施例3將在酶濃度為0.1U/ml S-ADH和0.2U/ml FDH(DM)下的含有25mM對氯乙醯苯以及0.1mM NAD+和75mM甲酸鈉的反應混合物，在含有90體積％100mM pH為7.5的磷酸鹽緩衝液和10體積％DME的溶劑系統中，在反應溫度為30℃下攪拌110小時。然後用二氯甲烷將有機成分萃取出，丟棄水相併用硫酸鈉乾燥有機相。使過濾後所得的濾液在真空中去除易揮發的成分，並通過1H核磁共振光譜分析所得油的形成率。測得形成率為59％。
實施例4將在酶濃度為0.2U/ml S-ADH和0.4U/ml FDH(DM)下的含有25mM對-(正丁基)乙醯苯以及0.1mM NAD+和75mM甲酸鈉的反應混合物，在含有90體積％100mM pH為7.5的磷酸鹽緩衝液和10體積％DME的溶劑系統中，在反應溫度為30℃下攪拌110小時。然後用二氯甲烷將有機成分萃取出，丟棄水相併用硫酸鈉乾燥有機相。使過濾後所得的濾液在真空中去除易揮發的成分，並通過1H核磁共振光譜分析所得油的形成率。測得形成率為70％。
實施例5具有20％(體積/體積)的乙二醇含量的反應將在酶含量為24U來自R.erythropolis(在E.coli中表達)的(S)-ADH和24U來自Candida boidinii(二突變體C23S、C262A；在E.coli中表達)的甲酸脫氫酶下的含有1.3mmol對氯乙醯苯(208.3mg；13mM)以及0.24mmol NADH(169.4mg；2.4mM)和6.2mmol甲酸鈉(62mM；421.7mg；4.8當量，基於酮)的反應混合物，在含有80體積％50mM pH為7.0的磷酸鹽緩衝液和20體積％乙二醇的溶劑系統中，在反應溫度為30℃下攪拌21小時。在此期間取出樣品，並通過PLC測定特別的轉化率。21小時之後，發現酮完全轉化。然後用4×100ml的甲基叔丁基醚將有機成分萃取出，丟棄水相併用硫酸鈉乾燥有機相。使過濾後所得的濾液在真空中去除易揮發的成分，並且在進一步添加MTBE並將形成的兩相分離之後，通過1H核磁共振光譜分析所得剩餘物的形成率。測得形成率大於99％。
實施例6具有40％(體積/體積)的乙二醇含量的反應將在酶含量為52.4U來自R.erythropolis(在E.coli中表達)的(S)-ADH和52.4U來自Candida boidinii(二突變體C23S、C262A；在E.coli中表達)的甲酸脫氫酶下的含有2.63mmol對氯乙醯苯(407.3mg；26.3mM)以及0.52mmol NADH(372.1mg；5.2mM)和14.4mmol甲酸鈉(144mM；979.3mg；5當量，基於酮)的反應混合物，在含有60體積％50mM pH為7.0的磷酸鹽緩衝液和40體積％乙二醇的溶劑系統中，在反應溫度為30℃下攪拌21小時。在此其間取出樣品，並通過PLC測定特別的轉化率。21小時之後，發現酮完全轉化。然後用2×100ml的甲基叔丁基醚將有機組分萃取出，丟棄水相併用硫酸鈉乾燥有機相。使過濾後所得的濾液在真空中去除易揮發的成分，並且在進一步添加MTBE並將形成的兩相分離之後，通過1H核磁共振光譜分析所得剩餘物的形成率。測得形成率大於99％。
權利要求
1.一種偶聯酶反應系統，其包括有機化合物的輔酶依賴型的酶轉化以及輔酶的酶再生，其中該反應系統在包括具有至少兩個羥基或醚基的有機烴類的均勻水性溶劑系統中運行。
2.根據權利要求1所述的反應系統，其特徵在於，該所用的有機烴類具有根據通式(I)的結構 其中n是0至10的整數，m是0或1，R1至R8相互獨立地代表H、(C1-C8)烷基、(C2-C8)烷氧基烷基、(C6-C18)芳基、(C7-C19)芳烷基、(C1-C8)烷基-(C6-C18)芳基、(C3-C8)環烷基、(C1-C8)烷基-(C3-C8)環烷基、(C3-C8)環烷基-(C1-C8)烷基。
3.根據權利要求1或2所述的反應系統，其特徵在於，使用乙二醇、DME或甘油作為所述有機烴類。
4.根據前述權利要求之一所述的反應系統，其特徵在於，基於水性相，所述有機烴類的含量為1至80體積％，更優選為5至60體積％，尤其優選為10至45體積％。
5.根據前述權利要求之一所述的反應系統，其特徵在於，使用NADH或NADPH作為所述輔酶。
6.根據前述權利要求之一所述的反應系統，其特徵在於，使用脫氫酶作為使所述有機化合物發生轉化的酶。
7.根據權利要求6所述的反應系統，其特徵在於，使用醇脫氫酶或胺基酸脫氫酶。
8.根據前述權利要求之一所述的反應系統，其特徵在於，利用甲酸脫氫酶使所述輔酶再生。
9.用於使有機化合物轉化的裝置，其包含根據權利要求1所述的反應系統。
10.用於使有機化合物發生酶轉化的方法，其包括使用根據權利要求1所述的反應系統。
11.根據權利要求1所述的反應系統用於使有機化合物發生酶轉化或用於判斷或分析的用途。
12.根據權利要求11所述的用途，其用於製備對映異構體富集的有機化合物的方法中。
全文摘要
本申請涉及一種反應系統，其中藉助於偶聯酶作用轉化方法可得到對映異構體純度高的有化學價值的化合物。在此範疇內的偶聯酶作用反應系統包括消耗輔酶的酶轉化反應，並使消耗的輔酶發生酶再循環，其中該過程在包括具有至少兩個羥基或醚基的有機烴類的均勻水性溶劑系統中進行。
文檔編號C12P41/00GK1768134SQ200480008366
公開日2006年5月3日 申請日期2004年3月17日 優先權日2003年3月27日
發明者克勞迪婭·羅爾曼, 哈拉爾德·格勒格爾, 維爾納·胡梅爾, 安德烈亞斯·博馬留斯, 卡爾海因茨·德拉茨 申請人:德古薩股份公司