一種基於瓜環的核酸水解切割劑的製作方法

2023-05-28 07:28:56 4

專利名稱：一種基於瓜環的核酸水解切割劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種核酸切割劑，具體屬於一種基於瓜環的核酸水解切割劑。
背景技術：
作為遺傳信息的攜帶者與基因表達的基礎，核算在生物的生長、發育、繁殖等生命活動中具有十分重要的作用。2000年HGP的完成，標誌著人類醫藥學將進入一個基因分子時代，困擾人類幾千年的生命的秘密、遺傳病、分子病、癌症、愛滋病以及血液供應、器官供應等都可找到科學的詮釋和解決的出路。而這一切的核心是對DNA核酸分子的識別、剪裁、和連接。因此，人工核酸切割試劑的研究一直以來都是生物化學和分子生物學中最活躍的熱點前言研究課題。核酸切割，就是通過化學反應將長鏈的核酸分子斷裂成較短的碎片。研究核酸切割試劑具有非常重要的理論和應用價值。首先，對人工核酸切割試劑的切割機理的研究將大大有助於我們對核酸酶催化機理的透徹理解。其次，切割試劑在疾病的基因治療中有十分重要的應用。而且，核酸切割試劑可以作為重要的分子生物學工具，可以用來研究核酸高級結構的探針。
關於人工核酸切割試劑，按照切割機理的不同，主要分為自由基切割試劑、酯水解切割試劑和消去型切割試劑，如下歸類1、自由基機理切割核酸的試劑都能產生某種自由基進攻核酸的糖環或是鹼基，奪去氫原子而導致其氧化破壞，進而使核酸鏈發生斷裂。例如，EDTA-Fe2+/H2O2體系(Rokita，S.E.；Romero-Fredes，L Nucleic.Acids.Res.，1992，20，3069)、Cu2+/還原劑體系(Reed，C.J.；Douglas，K.T.Biochem.Biphys.Res.Commun.，1989，162，1111)、光化學切割體系(Carter，P.J.；Breiner，K.M.；Thorp，H.H.Biochemistry.，1998，37，13736)、抗生素(Burger，R.M.Chem.Rev.，1998，98，1153)等體系。該類切割試劑破壞核酸鏈上的某些戊糖環乃至核苷酸，結果使原有的信息部分丟失。因此，該類切割試劑存在切割的碎片很難被進一步利用、切割的專一性比較差、毒副作用強、體系複雜等諸多缺點。(萬榮，趙剛，陳晶，麻遠，趙玉芬， 科學通報，2000，45，785)。
2、消除機理切割核酸的試劑賴色賴三肽KWK(Behmoaras，T.；Toulme，J.J.；Helene，C.Nature，1981，292，858)可以通過消除的方式切割核酸。該類切割試劑極為少見，不具備普遍性。
3、以酯水解機理切割核酸的試劑切割試劑直接進攻提供某種親核基團進攻核酸中磷酸二酯鍵的磷原子，從而發生親核取代反應使得核酸水解。例如Cu(II)-L-組氨酸配合物按水解機理切割核酸(Ren，R.；Yang，P.；Zheng，W.J.；Hua，Z.C.Inorg.Chem.，2000，39，5454)；雙核金屬離子的絡合物水解核酸(高飛，陰彩霞，楊頻，科學通報，2004，49，1471)絲組二肽可以在中性條件下水解超螺旋型的DNA。(Li，X.H.；Wan，R.；Zhang，Q.et.a1.Clncinnati Section American Chemical Society，Cininnati，Ohio，1998，130)水解切割試劑排除了自由基切割試劑的多中缺陷，而且具備普遍性，可以說是人工水解酶的最佳的模擬天然核酸酶的切割系統。但迄今為止，能有效催化水解DNA的水解的人工酶體系相對較少的。而且，絕大部分是金屬離子的絡合物，這些含有金屬離子的化學核酸酶，多數是要求有一個酸性的最佳pH以及這些酶的活性要受金屬離子控制，這些都阻礙了它們在螯合緩衝液或者有金屬螯合劑出現時的應用。因此，需要尋找不同類型的核酸酶，這種酶在pH＝7.0或pH＝7.0附近有一個最佳的pH，而且其發揮活性不需要金屬離子。相對於含金屬離子得水解切割試劑，不含金屬離子的核酸切割試劑有其相對更為重要的理論意義和應用潛力(鍾儒剛，趙麗嬌，趙玉芬，化學學報，2004，62，2444)。在這裡，我們開發了一種新型的不含金屬離子的基於瓜環的DNA人工核酸酶。

發明內容
本發明的目的在於提供一種不含金屬離子的高效的核酸水解切割劑。
本發明提供的核酸水解切割劑，是準輪烷分子化合物(pseudorotaxane)，它的化學分子式C36H36N24O12·C12H20N4·2X·nH2O，其中X＝Cl、H2PO4、HSO4、NO3、Br；n≥1；化學結構式(I) 本發明核酸切割劑，具體可用作分子生物學研究的人工核酸酶用於核酸切割，另外也可以進一步研究開發成基因治療的藥物。
本發明核酸水解切割劑的製備方法包括如下步驟(1)將甘脲，甲醛以摩爾比1∶2混合，在濃度為9摩爾/升的硫酸H2SO4溶液，70-75℃反應24小時，然後升溫至95-100℃，繼續反應12小時，冷卻至室溫，將反應液倒入10倍反應液體積的水中，加入6-10倍量體積的丙酮，析出白色固體，靜置，抽濾收集所得固體。所得固體分散於一定體積的水中，加入等體積的丙酮，攪拌靜置，抽濾所得白色固體用60℃的水充分洗滌後用少量丙酮淋洗，抽乾後，真空乾燥得白色固體，即為瓜環主體分子(cucurbit[6]uril)。反應式 (2)將咪唑加入四氫呋喃中溶解，再加入氫化鈉混合，咪唑與氫化鈉摩爾比1∶1.2-2，攪拌1-2小時，加入0.3-0.5倍咪唑摩爾數量的1，6-二溴己烷，攪拌12-24小時，減壓除去溶劑得糊狀固體，加入水使固體溶解，該溶液用氯仿(CHCl3)分三次充分萃取，合併氯仿液，用無水Na2SO4乾燥，過濾，減壓除去氯仿，得黃褐色油狀液體，該液體為1，6-二咪唑基己烷；將1，6-二咪唑基己烷溶於體積比為1∶1的強酸溶液，回流1-3小時，減壓濃縮溶液體積至1/3-1/5，加入四氫呋喃至析出白色固體，過濾乾燥得客體分子1，6-二咪唑基己烷二酸鹽(用G表示)。反應式 (3)將瓜環主體分子和1，6-二咪唑基己烷二酸鹽客體分子G按照摩爾比1∶1-1.2混合，加入蒸餾水溶解，攪拌12-24小時；減壓濃縮至溶液體積為起始體積的1/3-1/5，加入6-10倍量體積的四氫呋喃，析出白色固體，抽濾收集該固體，用少量丙酮淋洗，真空乾燥，得準輪烷分子化合物(用P表示)。反應式
本發明準輪烷分子化合物，其中包括瓜環(C36H36N24O12，cucurbit[6]uril)主體分子和客體分子1，6-二咪唑基己烷二鹽酸鹽(G1)、1，6-二咪唑基己烷二磷酸鹽(G2)、1，6-二咪唑基己烷二硫酸鹽(G3)，1，6-二咪唑基己烷二硝酸鹽(G4)、1，6-二咪唑基己烷二氫溴酸鹽(G5)所分別形成的準輪烷分子化合物(分別用P1、P2、P2、P4、P5表示)。
本發明準輪烷分子化合物可用作分子生物學研究的人工核酸酶用於核酸切割，切割的條件是將切割試劑溶於一定pH值緩衝體系成溶液，然後與切割底物混合，並使緩衝劑和底物的終濃度保持在一定範圍內，置於一定溫度下保溫，實現對底物核酸的切割。本發明的切割試劑是一類不含金屬離子的高效的核酸水解切割劑，在生理條件下，在較低的濃度下，較短的時間內可以對核酸進行切割。本發明的切割試劑也可以在製備基因治療藥物中應用，進一步用於基因治療藥物的研究開發。
本發明核酸水解切割劑準輪烷分子化合物對DNA的切割溶液的配製
(1)0.5M EDTA(pH8.0)溶液的配製在800ml蒸餾水中加入181.6g二水乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2·2H2O)，在磁力攪拌器上劇烈攪拌，用NaOH調節pH值至8.0，然後定容至1000ml.分裝後高壓滅菌備用。
(2)Tris-乙酸(50×TAE)電泳緩衝液的配製242gTris(三羥甲基氨基甲烷)鹼和57.1ml丙乙酸溶解於100ml 0.5M的EDTA溶液中，加去離子水調至1000ml。
(3)反應緩衝液的配製1.2lgTris溶於800ml去離子水中。加入0.363gNaCl，用濃鹽酸調pH為7.18定容至1000ml配製成10mM Tris，6.2mM NaCl溶液備用。
(4)EB溶液稱取EB(溴化乙啶)0.1g於棕色瓶中，以100ml去離子水溶解並定容，貯存於冰箱4℃保存備用。
(5)酶解終止液的配製0.05％溴酚藍，50％(v/v，體積比)甘油水溶液，0.1M EDTA(6)切割試劑的配製用所配製的緩衝溶液配製5mM的切割試劑溶液。
切割實驗(1)混合反應取潔淨的Eppendorf管，分別依次加入預定量的緩衝溶液雙蒸水、切割劑、質粒DNA(pBR 322DNA)，用離心機將所有的成分甩至Eppendorf管底部，使終濃度分別為Tris-HCl10mM；切割試劑150μM；pBR 322DNA0.014mg/mL，放在恆溫37℃的水浴中避光反應4小時。
(2)凝膠製備稱取0.32gAgarose(瓊脂糖)加50×TAE0.8ml，加雙蒸餾水至40ml，微波爐加熱2min使其完全溶解，待溶液溫度降至約70℃時，加EB溶液25μL，使EB終濃度約為0.5μg/ml，搖勻。溫度進一步降至40-50℃左右時，迅速倒入放好梳孔和擋板的平板電泳床中，待凝固後，注入電泳緩衝液，慢慢的拔去梳子和擋板。
(3)電泳待測反應體系在37℃水浴恆溫槽中恆溫一定時間後，將其恆溫槽中取出，各加入4μL溴酚藍指示劑，用微量進樣器將Eppendorf管內的溶液分別點樣於平板電泳床的點樣空中，電壓50V條件下跑2-3h，看到指示劑已移動到凝膠中部，切斷電源，取出凝膠，在SYNGENE GENE GENIUS BIO IMAGING SYSTEM凝膠成像系統儀上進行攝像。


圖1不同濃度的切割試劑P1切割pBR 322DNA的電泳圖。
10mM Tris-HCl，6.2mM NaCl，pH7.18在37℃恆溫4h；泳道1DNA對照；泳道2-5分別10μM，25μM，50μM，150μM的切割試劑。分析結果見表1。
圖2濃度為150μM的切割試劑P1、P2、P3、P4、P5對pBR 322DNA切割電泳圖。
10mM Tris-HCl，6.2mM NaCl，pH7.18在37℃恆溫4h；泳道1DNA對照。
具體實施例方式實施例1-5為切割劑製備實施例；實施例6-10切割劑切割DNA實施例。
實施例1步驟一.主體瓜環分子的合成11.4g甘脲(80mmol)於100ml四口圓底燒瓶中，加入40ml濃度為9M(摩爾/升)的硫酸H2SO4溶液，油浴升溫至70℃，開始滴加14ml，37％的甲醛水溶液，滴加時注意保持溫度在70-75℃之間，滴加完畢後保溫70-75℃反應24小時，然後升溫至95-100℃，繼續反應12h後，冷卻至室溫，將反應液倒入400ml水中，加入丙酮2L，析出白色固體，靜置20min後，抽濾收集所得固體。所得國體分散於200水中，加入丙酮200ml，攪拌20min，靜置，抽濾所得白色固體用60℃的水300ml洗滌三次後用約50ml丙酮淋洗，抽乾後，白色固體真空乾燥的6.5g，產率，48％。
步驟二.客體分子1，6-二咪唑基己烷二鹽酸鹽(G1)的合成50ml的單口圓底燒瓶中加入20ml乾燥的四氫呋喃(THF)液，加入1.5g咪唑，攪拌溶解後，慢慢分次加入95％的NaH，室溫攪拌2h後，反應體系呈懸濁液，然後加入2.44gl，6-二溴己烷，室溫攪拌24h後處理。減壓除去溶劑得糊狀固體，加入100ml水，固體溶解呈淡黃色溶液，該溶液用120ml氯仿(CHCl3)分三次萃取，合併氯仿液，用無水Na2SO4乾燥4h，過濾，將氯仿溶液減壓除去，得黃褐色油狀液體，該液體為1，6-二咪唑基己烷。將1，6-二咪唑基己烷溶於10ml水中，加入10ml濃鹽酸，回流2h，減壓濃縮溶液體積為5ml左右，加入四氫呋喃30ml，析出白色固體，得客體分子G1，1，6-二咪唑基己烷二鹽酸鹽。1HNMR核磁共振(300MHz，25℃，D2O，TMSP)δ8.71(s，2H)，7.50(s，1H)，7.46(s，1H)，4.23(t，4H，CH2)，1.89(m，4H，CH2)，1.33(m，4H，CH2)；13C NMR(300 MHz，D2O)δ134.13，121.56，119.48，49.05，28.94，24.75；元素分析(calcd.％)for C12H20N4Cl2C，49.48；N，19.24；H，6.87.FoundC，49.86；N，19.44；H，6.53.
步驟三.切割試劑超分子化合物準輪烷分子P1的合成50ml的單口圓底燒瓶，加入12lmg(0.1mmol)的瓜環，29.2mg(0.1mmol)的客體分子G1，加入20ml蒸餾水，80℃保溫攪拌24h。冷卻，減壓濃縮溶液體積為5ml左右，加入四氫呋喃30ml，析出白色固體，抽濾收集該固體，用少量丙酮淋洗，真空乾燥，得準輪烷分子化合物P1，產率86％。1HNMR核磁共振(300MHz，25℃，D2O，TMSP)δ9.16(s，2H)，7.92(s，2H)，7.37(s，2H)，5.78(d，12H)，5.58(s，12H)，4.32(d，12H)，3.99(t，4H)，1.18(m，4H)，0.57(m，4H)；13C NMR(300MHz，D2O)δ155.8，135.2，123.3，116.8，71.1，51.2，48.6，28.6，27.3；ESI-MS電噴霧質譜608.7為雙電荷陽離子，1215.4為單電荷陽離子.元素分析(calcd.％)for C36H36N24O12·C12H20N4·2Cl·8H2OC，40.22；N，27.37；H，5.03.FoundC，39.99；N，27.12；H，4.97.晶體為單斜晶系，P2l/c空間群，a＝12.369(4)，b＝20.115(6)，c＝12.578(4)，β＝113.664°，V＝2866.3(15)，Z＝2，Dc＝1.659g·cm-3，Rint＝0.0223，F(000)＝1500，M＝1432，偏差因子為R1＝0.0664，wR2＝0.1900實施例2步驟一. 重複實施例1步驟一，得所用主體瓜環。
步驟二. 用濃磷酸替代實施例1步驟二所用濃鹽酸獲得客體分子G2，1，6-二咪唑基己烷二磷酸鹽。元素分析(calcd.％)for C12H24N4P2O8C，34.78；N，13.53；H，5.80.FoundC，34.91；N，13.74；H，5.73.
步驟三.用客體分子G2替代客體分子G1，重複實施例1步驟三，得準輪烷分子化合物P2，產率86％。元素分析(calcd.％)for C36H36N24O12·C12H20N4·2H2PO4·12H2OC，35.42；N，24.11；H，5.17.FoundC，35.59；N，24.32；H，5.07.
實施例3步驟一. 重複實施例1步驟一，得所用主體瓜環。
步驟二. 用濃硫酸替代實施例1步驟二所用濃鹽酸獲得客體分子G3，1，6-二咪唑基己烷二硫酸鹽。元素分析(calcd.％)for C12H22N482O8C，34.78；N，13.53；H，5.31.FoundC，34.78；N，13.64；H，5.22.
步驟三. 用客體分子G3替代客體分子G1，重複實施例1步驟三，得準輪烷分子化合物P2，產率84％。元素分析(calcd.％)for C36H36N24O12·C12H20N4·2HSO4·10H2OC，36.23；N，24.65；H，4.91.FoundC，36.39；N，24.72；H，4.88.
實施例4步驟一. 重複實施例1步驟一，得所用主體瓜環。
步驟二. 用濃硝酸替代實施例1步驟二所用濃鹽酸獲得客體分子G4，1，6-二咪唑基己烷二硝酸鹽。元素分析(calcd.％)for C12H20N6O6C，41.86；N，24.41；H，5.81.FoundC，41.96；N，24.44；H，5.93.
步驟三. 用客體分子G4替代客體分子G1，重複實施例1步驟三，得準輪烷分子化合物P4，產率88％。元素分析(calcd.％)for C36H36N24O12·C12H20N4·2NO3·9H2OC，38.35；N，27.96；H，4.93.FoundC，38.39；N，28.02；H，5.03.
實施例5步驟一. 重複實施例1步驟一，得所用主體瓜環。
步驟二. 用氫溴酸替代實施例1步驟二所用濃鹽酸獲得客體分子G5，1，6-二咪唑基己烷二氫溴酸鹽。元素分析(calcd.％)for C12H20N4Br2C，37.89；N，14.74；H，5.26.FoundC，37.86；N，14.69；H，5.35.
步驟三. 用客體分子G5替代客體分子G1，重複實施例1步驟三，得準輪烷分子化合物P5，產率91％。元素分析(calcd.％)for C36H36N24O12·C12H20N4·2Br·8H2OC，37.89；N，25.78；H，4.73.FoundC，37.48；N，25.42；H，4.61.
實施例6在生理條件下，當質粒pBR 322DNA與切割試劑P1，37℃恆溫4小時後，超螺旋DNA降解為三種形態，由超螺旋supercoiled(S)變為缺刻nicked circular(C)，繼而降解轉變為線型linear(L)。如圖1所示DNA的起始濃度為0.05mg/ml，切割試劑P1的濃度範圍是0～150μM。隨著P1濃度的增加，可以看到質粒pBR 322DNA從超螺旋S逐漸轉變為缺刻C和線型L，最終超螺旋S幾乎全部轉變為缺刻C和線型L。轉變的結果見表1。由此結果可以看出當切割劑P1濃度為150μM時為切割的最佳濃度。
實施例7在實施例1的基礎上，選取最佳的實驗條件，將切割試劑的濃度定為150μM，其餘的條件重複實施例1中條件，用P2替代實施例1中的P1所的切割圖見圖2泳道P2。
實施例8在實施例1的基礎上，選取最佳的實驗條件，將切割試劑的濃度定為150μM，其餘的條件重複實施例1中條件，用P3替代實施例1中的P1所的切割圖見圖2泳道P3。
實施例9在實施例1的基礎上，選取最佳的實驗條件，將切割試劑的濃度定為150μM，其餘的條件重複實施例1中條件，用P4替代實施例1中的P1所的切割圖見圖2泳道P4。
實施例10在實施例1的基礎上，選取最佳的實驗條件，將切割試劑的濃度定為150μM，其餘的條件重複實施例1中條件，用P5替代實施例1中的P1所的切割圖見圖2泳道P5。
表1、不同濃度的切割試劑P1切割pBR 322DNA

基於上述的實驗結果，本發明所指的切割試劑可用作分子生物學研究的人工核酸酶用於核酸切割，可以進一步研究開發成基因治療的藥物。
權利要求
1.一種核酸水解切割劑，其特徵在於它是準輪烷分子化合物，它的化學分子式C36H36N24O12·C12H20N4·2X·nH2O，其中X＝Cl、H2PO4、HSO4、NO3、Br；n≥1；它的化學結構式(I)
2.按照權利要求1所述的一種核酸水解切割劑的製備方法，其特徵在於包括如下步驟(1)用甘脲，甲醛在酸溶液條件下製備瓜環主體分子；(2)將咪唑加入四氫呋喃中溶解，再加入氫化鈉混合，咪唑與氫化鈉摩爾比1∶1.2-2，攪拌1-2小時，加入0.3-0.5倍咪唑摩爾數量的1，6-二溴己烷，攪拌12-24小時，除去溶劑得糊狀固體，加水溶解，用氯仿充分萃取，乾燥，過濾，除去氯仿，得1，6-二咪唑基己烷；將1，6-二咪唑基己烷溶於強酸溶液，回流，濃縮，加入四氫呋喃，析出白色固體，過濾，乾燥得1，6-二咪唑基己烷二酸鹽客體分子；(3)將瓜環主體分子和1，6-二咪唑基己烷二酸鹽客體分子按照摩爾比1∶1-1.2混合，加入蒸餾水溶解，攪拌12-24小時；濃縮，加入四氫呋喃析出白色固體，抽濾收集該固體，乾燥，得準輪烷分子化合物。
3.按照權利要求1所述的一種核酸水解切割劑的用途，用作分子生物學研究的人工核酸酶用於核酸切割。
4.按照權利要求1所述的一種核酸水解切割劑的用途，在製備基因治療藥物中的應用。
全文摘要
本發明涉及瓜環(cucurbit[6]uril)與1，6－二咪唑基二酸鹽所生成的準輪烷分子化合物，它的化學分子式C
文檔編號A61K48/00GK1935829SQ20061004839
公開日2007年3月28日 申請日期2006年9月30日 優先權日2006年9月30日
發明者霍方俊, 陰彩霞, 楊頻 申請人:山西大學