具有靶向和螢光雙功能抗癌藥物載體的製備及其應用的製作方法
2023-05-28 07:19:21 2
專利名稱：具有靶向和螢光雙功能抗癌藥物載體的製備及其應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於癌症治療技術，具體地說是一種具有靶向和螢光雙功能抗癌藥物載體
的製備及其應用。
背景技術：
癌症是威脅人類健康的重大疾病，當前治療癌症的三大手段放療、化療、手術療 法，都有著重大的缺陷。腫瘤的非手術治療方法是放療和化療，放射療法和化學療法在殺死 腫瘤細胞的同時，也嚴重損傷了人體正常細胞。為了有效地治療癌症，攻克癌症大敵發明一 種具有靶向和螢光雙功能抗癌藥物載體的製備及其應用方法是生物醫學領域中的十分重 要任務。 本發明將具有靶向功能的葉酸分子和螢光探針量子點，通過化學鍵的方法連接到 多壁碳納米管(麗NTs)表面，形成具有靶向和螢光雙功能的藥物載體，再通過作用將 抗癌藥物紫杉醇(PTX)負載到葉酸靶向的碳納米管表面，形成具有靶向功能的水溶性藥物 複合物。通過體外培養的Hela宮頸癌細胞實驗表明，該藥物載體具有高效的靶向功能，大 大提高了紫杉醇對靶細胞的抑制作用效率，達到了靶向藥物治療的目的。
經檢索國內外專利文獻，廣泛查閱國內外公開出版物，未見有與本發明完全相同 的技術方案，因此本發明具有新穎性和創造性；同時本發明在治療癌症中的有益效果，使本 發明具有廣泛的實用性。
發明內容
本發明的目的是提供一種具有靶向和螢光雙功能抗癌藥物載體的製備及其應用 方法。 本發明的目的是這樣實現的 具有靶向和螢光雙功能抗癌藥物載體的製備，步驟如下 (1)配製混酸溶液將3倍體積的98%濃硫酸與1體積的濃硝酸混合； (2)製備短碳納米管將微米級長度的多壁碳納米管置於混酸中；功率350W超聲
16小時；蒸餾水洗滌至中性，得打斷的碳納米管； (3)製備碳納米管_聚乙烯亞銨水相體系將碳納米管與0. 5%聚乙烯亞銨混合， 350W超聲3小時；用200nm微孔濾膜過濾所得到的混合物，離心再分散到水中，得穩定的碳 納米管_聚乙烯亞銨水相體系； (4)製備靶向和螢光雙功能化的碳納米管藥物載體將O. 05mg的葉酸，50iU的量 子點與0. 05mg的碳納米管-聚乙烯亞銨水相體系在碳化二亞胺交聯劑的作用下，搖床反應 3小時，離心過濾處理，再分散到水中，得具有靶向和螢光雙功能的碳納米管藥物載體。
具有雙功能抗癌藥物載體的應用，步驟如下 (1)製備抗癌藥物紫杉醇-碳納米管複合物取l體積O. 15mg/ml濃度紫杉醇溶液 加入到2倍體積0. 05mg/ml的多壁碳納米管-聚乙烯亞胺_葉酸複合物水相體系中，搖床反
3應12小時，離心過濾，重新分散到磷酸緩衝溶液中，得到穩定的紫杉醇-多壁碳納米管-聚
乙烯亞胺_葉酸複合物水相體系； (2)宮頸癌細胞、人臍靜脈內皮細胞的培養 A.選用對數生長期細胞 B.宮頸癌細胞在含10%小牛血清的MEM細胞培養基中培養； C.人臍靜脈內皮細胞在含10X小牛血清的DMEM細胞培養基中，37t:5XC02飽和
溫度下培養； (3)多功能藥物載體靶向性的檢測將多壁碳納米管_聚乙烯亞胺_葉酸_量子 點複合物(麗NTs-PEI-FA-Qdots)分別加入到對數生長期的宮頸癌細胞和人臍靜脈內皮細 胞中，在37t: 5% C0j包和溫度下培養4h，用磷酸緩衝溶液衝洗三次，使用共聚焦顯微鏡觀 察，葉酸靶向的藥物載體能夠對癌細胞進行有效的識別； (4)細胞調亡率的測定將紫杉醇、多壁碳納米管-聚乙烯亞胺、多壁碳納米 管_聚乙烯亞胺_葉酸、功能化多壁碳納米管_紫杉醇、紫杉醇_功能化多壁碳納米管_葉 酸分別加入到對數生長期的宮頸癌細胞中，在37t: 5% C02飽和溫度下培養48h ;取未經 處理的對數生長期的宮頸癌細胞，使用噻唑藍法(MTT)檢測，證明具有葉酸靶向的碳納米 管藥物載體能夠提高抗癌藥物紫杉醇的抗腫瘤的效率。
本發明的要點是 (1)用濃硫酸和濃硝酸的混合物氧化多壁碳納米管，達到打斷碳納米管的效果，再 將聚乙烯亞胺(PEI)修飾到碳納米管管壁上，得到在水溶液中均勻分散的多壁碳納米管體 系。 (2)將具有靶向功能的葉酸分子和新型的螢光探針量子點，通過化學鍵的方法連 接到多壁碳納米管表面，形成具有靶向和螢光雙功能的藥物載體。 (3)利用碳納米管的Ji共軛體系與抗癌藥物的共軛體系通過作用將抗 癌藥物紫杉醇組裝到功能化多壁碳納米管上，得到了具有靶向功能紫杉醇_多壁碳納米管 複合物。 近年來國際醫學界使用靶向藥物治療癌症，利用藥物對腫瘤的靶向作用，將藥物 選擇性地集中在靶部位，提高靶部位藥物濃度和對腫瘤的殺傷力，增強治療效果，同時減少 對正常組織的不良反應，降低藥物的毒副作用，取得了良好的效果。靶向藥物治療的關鍵是 選擇合適的藥物載體並提高藥物載體的靶向性。隨著分子生物學和分子醫學的發展，隨著 對腫瘤分子水平研究的深入，人們在腫瘤細胞表面和腫瘤血管表面發現了一系列的受體與 腫瘤生長增殖密切相關，受體與其配體的結合具有高親和性。因此通過受體的介導作用，用 配體作為藥物載體靶向分子來提高療效，達到靶向治療目的是十分有效的。葉酸(FA)作為
一種小分子量的靶向分子在卵巢、結腸、乳腺、前列腺、鼻咽、腦等的大多數腫瘤細胞中高度 表達。生命科學的快速發展對螢光探針的性能提出了更高的要求，原位、實時、多色，可視化 的快速檢測越來越成為實際工作的需要，新的螢光探針開發及在生物醫學應用尤為重要。 量子點(Qdots)的出現為解決上述問題提供了有利條件，與傳統的螢光化合物相比，量子 點發射光譜狹窄，具有寬廣的激髮帶等優點，量子點在生物醫學中的應用將加速從細胞與 分子水平對疾病的理解，從而推進腫瘤靶向給藥系統的進一步發展。 紫杉醇(Paclitaxel， Taxol)是從太平洋紅豆杉的樹皮中提取的一種四環二萜類化合物。紫杉醇是一種抗微管藥物，通過阻止微蛋白形成，抑制微管解聚，使有絲分裂停留 在G2期和M期而發揮抗腫瘤作用。但是由於紫杉醇水溶性低、口服生物利用度差、易引起 過敏反應等缺點限制了其在臨床上的使用。利用紫杉醇類藥物開發具有靶向和螢光雙功能 的藥物載體，提高藥物在病灶部位的聚集，推進腫瘤靶向給藥治療，提高紫杉醇的抗腫瘤效 率是十分有意義的。開發高效、無毒的靶向和螢光雙功能的藥物載體，對於提高抗腫瘤藥物 的藥效具有極其重要的意義。 本發明載體製備方法簡便、易得、可靠；具有靶向和螢光雙功能；具有轉染率高、 抑制腫瘤細胞效果明顯等特點。連接葉酸靶向分子的功能化碳納米管藥物載體，為非水溶 性抗癌藥物在生物體內效率的研究提供了基礎。
本發明具有靶向和螢光雙功能的碳納米管藥物載體具有如下優點
1.碳納米管具有很高比表面積，可以提高負載量。 2.螢光探針量子點具有發射光譜狹窄、具有寬廣的激發、具有較高的量子產率、優 良的穩定性等優點，從而對藥物載體的螢光示蹤研究提供了依據，亦可證明藥物載體的靶 向性。 3.靶向分子葉酸具有非免疫原性、穩定易得、親和力強、非破壞性的細胞內吞等優 點，通過靶向藥物載體，可以大大提高藥物在靶部位的聚集，提高藥效。
圖1為葉酸連接的靶向碳納米管紫外可見光譜圖 a線為葉酸的紫外特徵吸收峰；b線為多壁碳納米管-聚乙烯亞胺(麗NTs-PEI)的 紫外特徵吸收峰；c線為多壁碳納米管-聚乙烯亞胺-葉酸(麗NTs-PEI-FA)的紫外特徵吸 收峰。 圖2為螢光量子點標記的多壁碳納米管TEM圖，箭頭所指圓點為負載到多壁碳納 米管上的量子點。 圖3為採用噻唑藍法分別檢測紫杉醇(PTX)、多壁碳納米管-聚乙烯亞胺 (麗NTs-PEI)、多壁碳納米管_聚乙烯亞胺_葉酸(麗NTs-PEI-FA)、功能化多壁碳納米 管_紫杉醇(f-麗NTs-PTX)、紫杉醇_功能化多壁碳納米管_葉酸(PTX-f-麗NTs-FA)對 宮頸癌細胞生長的抑制率。未處理的細胞，紫杉醇(PTX)、多壁碳納米管-聚乙烯亞胺 (麗NTs-PEI)、多壁碳納米管_聚乙烯亞胺_葉酸(麗NTs-PEI-FA)、功能化多壁碳納米 管_紫杉醇(f-麗NTs-PTX)、紫杉醇-功能化多壁碳納米管_葉酸(PTX-f-麗NTs-FA)在宮 頸癌細胞中孵育了48小時。
具體實施例方式
下面通過具體實施方式
對本發明做進一步說明。
本發明選用的材料如下 聚乙烯亞銨(Polyethylenimine，PEI)購自Sigma公司；碳納米管購自深圳市納米 港有限公司；葉酸購自國藥集團化學試劑有限公司；量子點購自武漢珈源量子點技術開發 有限公司；紫杉醇購自上海高銀科技開發有限公司。 實施例1 :製備酸化多壁碳納米管(麗NTs)和製備碳納米管-聚乙烯亞銨
5(麗NTs-PEI)水相體系 配製混酸溶液將3倍體積的98 %濃硫酸與1體積的濃硝酸混合； 將碳納米管麗NTs置於混酸溶液中，超聲16小時，離心分離後，蒸餾水洗滌至中
性，得打斷的酸化碳納米管。 將lmg碳納米管麗NTs與10ml 0. 5%聚乙烯亞銨PEI混合，超聲處理，用200nm微孔濾膜過濾所得到的混合物，離心再分散到水中，得到穩定的碳納米管-聚乙烯亞銨水相體系。 實施例2 :製備靶向和螢光雙功能化的碳納米管藥物載體
製備原理利用碳化二亞胺(EDAC)交聯劑的交聯作用。 將0. 05mg的葉酸，50 iU的量子點與0. 05mg的碳納米管_聚乙烯亞銨
(麗NTs-PEI)在碳化二亞胺(EDAC)交聯劑的交聯作用下，搖床反應3小時，離心過濾處理，再分散到水中，得到具有靶向和螢光雙功能的碳納米管藥物載體，圖1的紫外圖證明葉酸成功的連接到碳納米管上，圖2的TEM圖證明了量子點成功的連接到碳納米管上。
實施例3 :製備抗癌藥物紫杉醇_功能化碳納米管複合物
製備原理利用Ji - Ji作用。取0. 15mg/ml 0. 5ml紫杉醇溶液加入到lml 0. 05mg/ml的多壁碳納米管_聚乙烯亞胺_葉酸(麗NTs-PEI-FA)水相體系中，搖床反應12小時，離心過濾，重新分散到磷酸緩衝溶液中，得到穩定的紫杉醇-功能化多壁碳納米管-葉酸(PTX-f-麗NTs-FA)水相體系。
實施例4 :培養宮頸癌細胞 Hela宮頸癌細胞株購自中科院上海細胞庫。將Hela宮頸癌細胞在含10%小牛血清的MEM培養基，人臍靜脈內皮細胞在含10%小牛血清的DMEM培養基中，37°C 5% C02飽和溫度下培養，實驗選用對數生長期細胞。
實施例5 :多功能藥物載體耙向性的檢測 將多壁碳納米管_聚乙烯亞胺_葉酸_量子點複合物(麗NTs-PEI-FA-Qdots)分別加入到對數生長期的Hela宮頸癌細胞和人臍靜脈內皮細胞中，在37t: 5% C02飽和溫度下培養4h，用磷酸緩衝溶液衝洗三次，通過共聚焦顯微鏡的檢測，通過對比實驗說明葉酸靶向的藥物載體可以對葉酸受體高表達的癌細胞進行有效的識別。
實施例6 :細胞調亡率的測定 將紫杉醇(PTX)、多壁碳納米管_聚乙烯亞胺(麗NTs-PEI)、多壁碳納米管_聚乙烯亞胺_葉酸(麗NTs-PEI-FA)、功能化多壁碳納米管_紫杉醇(f-麗NTs-PTX)、紫杉醇-功能化多壁碳納米管-葉酸(PTX-f-麗NTs-FA)分別加入到對數生長期的Hela宮頸癌細胞中，在37°C 5% C02飽和溫度下培養48h。取未經任何處理的對數生長期的Hela宮頸癌細胞，通過噻唑藍法(MTT)檢測，圖3的實驗結果證明了具有葉酸靶向的碳納米管藥物載體能提高抗癌藥物紫杉醇的抗腫瘤的效率。 上述實施例僅為本發明的優選例，並不用來限制本發明，凡在本發明的原則之內，所做的任何修改、變化、變通或替換方案，均在本發明的保護範圍之內。
權利要求
一種具有靶向和螢光雙功能抗癌藥物載體的製備，步驟如下(1)配製混酸溶液將3倍體積的98％濃硫酸與1體積的濃硝酸混合；(2)製備短碳納米管將微米級長度的多壁碳納米管置於混酸中；功率350W超聲16小時；蒸餾水洗滌至中性，得打斷的碳納米管；(3)製備碳納米管-聚乙烯亞銨水相體系將碳納米管與0.5％聚乙烯亞銨混合，350W超聲3小時；用200nm微孔濾膜過濾所得到的混合物，離心再分散到水中，得穩定的碳納米管-聚乙烯亞銨水相體系；(4)製備靶向和螢光雙功能化的碳納米管藥物載體將0.05mg的葉酸，50μl的量子點與0.05mg的碳納米管-聚乙烯亞銨水相體系在碳化二亞胺交聯劑的作用下，搖床反應3小時，離心過濾處理，再分散到水中，得具有靶向和螢光雙功能的碳納米管藥物載體。
2. —種具有雙功能抗癌藥物載體的應用，步驟如下(1) 製備抗癌藥物紫杉醇_碳納米管複合物取1體積0. 15mg/ml濃度紫杉醇溶液加 入到2倍體積0. 05mg/ml的多壁碳納米管_聚乙烯亞胺_葉酸複合物水相體系中，搖床反 應12小時，離心過濾，重新分散到磷酸緩衝溶液中，得到穩定的紫杉醇-多壁碳納米管-聚 乙烯亞胺_葉酸複合物水相體系；(2) 宮頸癌細胞、人臍靜脈內皮細胞的培養A. 選用對數生長期細胞B. 宮頸癌細胞在含10X小牛血清的MEM細胞培養基中培養；C. 人臍靜脈內皮細胞在含10X小牛血清的DMEM細胞培養基中，37t: 5%0)2飽和溫 度下培養；(3) 多功能藥物載體靶向性的檢測將多壁碳納米管-聚乙烯亞胺-葉酸-量子點複合 物(麗NTs-PEI-FA-Qdots)分別加入到對數生長期的宮頸癌細胞和人臍靜脈內皮細胞中， 在37t: 5% (A飽和溫度下培養4h，用磷酸緩衝溶液衝洗三次，使用共聚焦顯微鏡觀察，葉 酸靶向的藥物載體能夠對癌細胞進行有效的識別；(4) 細胞調亡率的測定將紫杉醇、多壁碳納米管-聚乙烯亞胺、多壁碳納米管-聚乙 烯亞胺_葉酸、功能化多壁碳納米管_紫杉醇、紫杉醇_功能化多壁碳納米管_葉酸分別加 入到對數生長期的宮頸癌細胞中，在37t: 5% C0j包和溫度下培養48h ;取未經處理的對數 生長期的宮頸癌細胞，使用噻唑藍法(MTT)檢測，證明具有葉酸靶向的碳納米管藥物載體 能夠提高抗癌藥物紫杉醇的抗腫瘤的效率。
全文摘要
本發明屬於癌症治療技術，具體地說是一種具有靶向和螢光雙功能抗癌藥物載體的製備及其應用。本發明載體的製備方法是配製濃硫酸與濃硝酸的混酸溶液；製備短碳納米管；製備碳納米管-聚乙烯亞銨水相體系製備靶向和螢光雙功能化的碳納米管藥物載體。本發明的應用方法是製備抗癌藥物紫杉醇-功能化碳納米管複合物；培養宮頸癌細胞、人臍靜脈內皮細胞檢測多功能藥物載體的靶向性；測定細胞調亡率。本發明的優點是碳納米管具有高比表面積，提高負載量；量子點具有發射光譜狹窄、較高的量子產率、優良的穩定性；葉酸分子提高藥物載體的靶向性；本發明功能化碳納米管的藥物載體大大提高了藥物在靶部位的聚集，提高了藥物治療癌症的效果。
文檔編號A61K47/48GK101732720SQ20091020086
公開日2010年6月16日 申請日期2009年12月25日 優先權日2009年12月25日
發明者殷敏, 田忠, 賈能勤 申請人:上海師範大學