禽流感病毒原位pcr檢測探針及其製備方法

2023-05-28 00:46:31 3

專利名稱：禽流感病毒原位pcr檢測探針及其製備方法
技術領域：
本發明涉及一種禽流感病毒原位PCR檢測探針及其製備方法。
背景技術：
禽流感(avian influenza, Al)是由A型禽流感病毒引起的一種禽類從呼吸系統到全身性嚴重敗血症等多種症狀的綜合傳染病，該病是一種毀滅性疾病，高致病性毒株發 病率和死亡率可達100%，廣泛分布於世界各地，在有記載的禽病史上，每一次嚴重的爆發 都給養禽業造成巨大的經濟損失，具有重大的公共衛生意義。原位PCR是將PCR的高效率擴增和原位雜交的細胞定位相互結合，從而在組織細 胞原位檢測微量拷貝的靶DNA或RNA序列，已被廣泛應用於愛滋病、口蹄疫和藍耳病等十幾 種病毒的檢測中，取得了較為理想的結果。本研究採用的間接原位PCR方法，最早見於20 世紀90年代初，由於其較強的特異性，是目前應用最廣的靶核酸序列原位擴增技術。目前，禽流感的檢測已經建立了許多方法，如雞胚病毒分離、血凝和血凝抑制試 驗、瓊擴試驗、ELISA、RT-PCR、螢光RT-PCR和NASBA等，近年來還有學者對基因晶片等分子 診斷技術進行了研究，但是對禽流感病毒(avianinfluenza virus, AIV)感染的細胞和組 織進行原位PCR檢測的報導並不多見。本發明中採用間接原位RT-PCR方法檢測細胞塗片 及動物組織中的禽流感病毒，為動物組織中禽流感病毒的檢測和致病機理研究提供更為敏 感、特異和直觀的方法。目前所用的探針有RNA探針、cDNA探針和DNA探針，可以是雙鏈DNA探針也可以 是單鏈cDNA探針。放射性同位素標記物用放射自顯影顯示，放射線的擴散會引起定位不準 確，放射線會對人體造成傷害，而且曝光時間長，檢測後的標本不易保存，因此放射性同位 素逐漸被生物素-地高辛所取代，由於地高辛標記相對簡便、流程較短、較為省時，使其逐 漸成為標記物中的佼佼者。間接法原位PCR需要特異性標記的探針，進行原位雜交，探針是原位PCR檢測成敗 的關鍵和基礎，在進行原位PCR之前，首先要研製所用探針。本發明所研製的是用地高辛標 記的雙鏈DNA探針。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是克服現有技術的不足，提供一種特異性好、敏感性 高的禽流感病毒原位PCR檢測探針及其製備方法。本發明所採用的技術方案是一種禽流感病毒原位PCR檢測探針，是利用RT-PCR 法製備，所述檢測探針的特異性引物序列為SEQl和SEQ2 SEQ 1 :5，AAGCGGAGGAAACACCAAC-3，；SEQ2 5，-ATGTCAAAGGAAGGCACGAT-3，。所述檢測探針是以地高辛為標記物製得。所述引物擴增長度為270bp。
檢測探針的製備方法所採用的技術方案為所述製備方法包括以下步驟(1)特異性引物的設計，根據GenBank資料庫中AIV NP基因的核苷酸序列設計引 物，上下遊引物序列分別為SEQl和SEQ2 ；(2)病毒RNA的提取；
(3)利用上述的上下遊引物，以提取的病毒RNA為模板進行一步法RT-PCR擴增反 應，獲得RT-PCR產物並用瓊脂糖凝膠電泳分析；(4) RT-PCR產物的克隆，把RT-PCR產物與克隆載體連接，連接產物轉化感受態細 胞，提取重組質粒；(5)對上述重組質粒進行PCR鑑定和測序，篩選陽性質粒；(6)將上述測序正確的DNA作為模板，加入DIG-High Prime製備探針。上述步驟 (3)中一步法RT-PCR反應體系為滅菌DEPC 水24. OuLIOXone step RNA PCR Buffer 5. OuLMgCL2 (25mM)10. OuLdNTP Mixture(IOmM)5. OuLRNase Inhibitor (40u /uL)1. OuLAMV RTase XL(5u /uL)1. OuLAMV-Optimized Taq(5u/uL)1. OuL上遊引物(IOpM)1. OuL下遊引物(IOpM)1. OuL提取的病毒RNA1. OuL上述步驟(3)中一步法RT-PCR反應的擴增條件為50°C 3Omin,反轉錄；94"C 2min, 1 個循環；94"C 30s, 55°C 30s, 72°C 30s, 35 個循環；72°C IOmin, 1 個循環。上述步驟(6)中以地高辛為標記物製備探針的步驟包括(1)在離心管中加入IuL的測序正確的DNA產物，然後加入15uL滅菌的DEPC水；(2)蓋緊離心管蓋，沸水中保持IOmi n，取出後迅速置於冰水浴中5min ；(3)加入4uL輕緩混勻的DIG-High Prime，混勻後，置於37°C溫箱中20h，然後置 於65°C水浴IOmin終止反應。本發明的有益效果是由於本發明中是從GeneBank下載禽流感病毒NP基因序列， 通過比對選取NP基因中較為保守的片斷，設計一對引物，通過RT-PCR方法擴增270bp的 目的片段，並用分子克隆方法構建重組質粒，測序後證實本研究設計的引物擴增序列與AIV 各亞型NP基因具有較高同源性，可達92%以上，利用地高辛標記擴增產物製備探針。該探 針可特異性的檢測禽流感病毒，對於新城疫、傳染性法氏囊等病毒檢測結果為陰性，具有良 好的特異性，探針可以檢測出約lpg/uL的質粒DNA，具有較高敏感性。


圖1是本發明實施例中特異性引物對NP基因進行RT-PCR電泳結果；其中M =DNA Marker DL20001 陽性對照2 =NP基因3 空白對照；圖2是本發明實施例中的引物特異性試驗電泳結果；其中M :DNA Marker DL20001 陽性對照 2 :NDV A 株，3:NDV B 株，4:NDV C 株，5:NDV D 株，6:NDV E 株，7:NDV F 株，8 =NDI 系，9 :ND II 系，10 :NDC30，11 :IBDV, 12 :IBV, 13 :EDS_76，14 :H5N2A 株，15 :H5N2B 株，16 :H5N2C 株，17 :H5N2D 株，18 :H5N2E 株，19 :H5N2F 株，20 :H9N2A 株，21 :H9N2B 株，22 H9N2C株，23 空白對照；圖3是本發明實施例中的PCR產物克隆電泳鑑定結果；其中M:DNA Marker DL20001 陽性對照；2 6 :NP基因的克隆菌；7 空白對照；圖4是本發明實施例中的探針的敏感性檢測結果；其中A行1 :10ng/uL ；2 =Ing/ uL ；3 :100pg/u L ；4 :10pg/uL 5 :lpg/uL ；6 0. lpg/uLB 行1 0. 05pg/uL ；2 0. 01pg/uL ；3 空載體質粒；圖5是本發明實施例中的探針的特異性檢測結果；其中1 :AIV H5N2亞型，2 :AIV H9N1 亞型，3 :NDV,4 =IBDV, 5 =IBV, 6 :EDS_76，7 空白對照。
具體實施例方式下面以具體實施例對本發明作進一步闡述一、引物設計從GeneBank下載禽流感病毒NP基因序列，進行序列比對，選取NP基因中較為保 守的片段，利用Primer Premier 5. 0軟體設計一對引物，由上海英駿生物技術有限公司合
成，引物序列及長度見下表
引物名稱_引物序歹Ij_擴增長度(bp)
Pl 5'-AAG CGG AGG AAA CAC CAA C -3' P2_5'-ATG TCA AAG GAA GGC ACG AT -3, 270_二、探針的具體製備過程如下1、病毒RNA的提取在1.5mL離心管中，加入600uL RNA提取液與200uL收集的尿囊液，混勻，室溫放 置5分。加入200uL預冷氯仿，混勻，室溫放置3min。12000r/min4°C離心lOmin，取上清於 另一離心管，加200uL預冷異丙醇，室溫放置5min。12000r/min 4°C離心lOmin，棄上清，力口 入600uL 75%預冷乙醇，上下顛倒，12000r/min 4°C離心lOmin，棄上清。室溫近於乾燥。加 20uL0. 1% DEPC處理過的水溶解沉澱RNA (所提取的RNA應在2小時之內儘快使用)。2、一步法 RT-PCR50uL反應體系及擴增條件滅菌 DEPC 水24. OuL
IOXone step RNA PCR Buffer 5. OuLMgCL2 (25mM)10. OuLdNTP Mixture(IOmM)5. OuLRNase Inhibitor(40u/uL)1. OuLAMV RTase XL (5u/uL)1. OuLAMV-Optimized Taq(5u/uL)1. OuL上遊引物Pl (IOpM)1. OuL下遊引物P2 (IOpM)1. OuL提取的病毒RNA1. OuL混勻，啟動以下PCR程序50°C 3Omin,反轉錄；94"C 2min, 1 個循環；94"C 30s, 55°C 30s, 72°C 30s ；35 個循環，72°C lOmin，1 個循環RT-PCR結束後，取PCR產物用1. 0%瓊脂糖凝膠電泳分析(含EB染料)。如圖1 電泳結果所示，利用特異性引物對NP基因進行RT-PCR，擴增出270bp左右的DNA片段，與陽 性對照的片段大小相符，空白對照呈陰性，與理論預期結果相符。3、特異性試驗採用總反應體系為50uL，反應體系與2中相同，模板RNA分別為6株H5亞型分離毒株，3株H9亞型分離毒株，NDV, IBDV, IBV和EDS-76，反應條件按4中的條件。如圖2特異性電泳結果所示，H5和H9亞型擴增出270bp左右的DNA片段，而NDV，IBDV，IBV, EDS-76用同樣引物進行擴增則為陰性，與理論預期值相符。4、RT-PCR產物克隆和鑑定將RT-PCR產物與pGEM-T Easy Vector克隆載體連接，連接產物轉化感受態細胞， 經氨苄青黴素平板篩選和PCR擴增，初步獲得部分陽性重組質粒。將所獲重組質粒經傳LB 液體進行PCR擴增鑑定，所擴增的PCR產物，取7uL用1.0%瓊脂糖凝膠進行電泳(含EB染 料)，選出含目的條帶的已傳LB液體培養菌液進行測序。如圖3的瓊脂糖凝膠電泳克隆鑑定結果，獲得270bp左右的目的帶，與預期理 論相符，說明所擴增的基因片段已正確轉入T載體中將測序得到的結果在NCBI上進行比較分析，發現測序結果與GenBank中註冊的多 株禽流感病毒NP基因的同源性在92%以上。與gb I CY028703. 11的同源性可達99%。AGCGGAGGAAACACCAACCAGCAGAGGGCATCTGCAGGACAGATCAGCGTTCAGCCCACTTTCTCGGTACAGAGAAACCTTCCCTTCGAAAGAGCGACCATTATGGCAGCATTTACAGGAAATACTGAGGGCAGAACGTCTGAC
ATGAGGACTGAAATCATAAGAATGATGGAAAGTGCCAGACCAGAAGATGTGTCATTCCAGGGGCGGGGAGTCTTCGAGCTCTCGGACGAAAAGGCAACGAACCCGATCGTGCCTTCCTTTGACAT5、檢測探針的標記將測序正確的DNA作為製備探針的模板，在一個0. 5mL離心管中加入IuL的DNA產物，然後加入15uL滅菌的DEPC水，蓋緊離心管蓋，沸水中保持lOmin，取出後迅速置於冰水浴中5min，取4uL已輕緩混勻的DIG-HighP rime。混勻後，置於37°C溫箱中20h，然後置 於65°C水浴IOmin終止反應。6、探針標記敏感性的測定用滅菌DEPC 水將質粒 DNA 依次稀釋成 10ng/uL、Ing/uL、100pg/uL、10pg/uL、lpg/ uL、0. lpg/uL、0. 05pg/uL、0. Olpg/uL,置於沸水IOmin後，迅速放入冰水浴5min，然後分別 取IuL點樣於正電荷尼龍膜上。同時設立空載體為陰性對照。置於120°C固定30min。將 尼龍膜置於可密閉的容器中，加入已經預熱到雜交溫度的15mL預雜交液，密封后置於40°C 預雜交2h。棄去預雜交液，按照每IOOcm2膜至少需要2. 5mL的量加入已預熱的雜交緩衝 液，按照每毫升雜交緩衝液需要IOOng新變性的DIG標記探針加入雜交容器中，密封后置 於40°C雜交箱雜交16h。雜交完成後，將尼龍膜用2XSSC，0. 1% SDS室溫洗滌15minX2 次，用 0. 1XSSC，0. SDS 在 68°C洗滌 15minX2 次。將尼龍膜在 Buffer 1(5. 8g 馬來 酸，4. 38gNaCL加水溶解。用10mol/L NaOH調節PH至7. 5，定容至500mL，高壓滅菌)中漂 洗2min，在Buffer II (探針標記試劑盒中的封閉貯存液用Buffer 110倍稀釋)中孵育 30min，取出尼龍膜置於酶標DIG抗體工作液中37°C溼盒孵育30min，Washing Buffer洗 膜 5minX2，洗去未結合的抗體，BufferIII (50mL lmol/L Tris，2. 92gNaCL，5. 09gMgCL2，力口 DEPC水400mL，調節PH至9. 5，定容至500mL，高壓滅菌)中平衡3min。然後置於NBT/BCIP 顯色液中暗處顯色16h，DEPC水洗膜5min終止反應，觀察結果並拍照。用探針雜交顯色結 果顯示，探針可以檢測出約lpg/uL的質粒DNA (圖4)。其中Washing Buffer 為 5. 8g 馬來酸，4. 38gNaCL 加水溶解。用 10mol/LNa0H 調節 PH至7. 5，定容至500mL，高壓滅菌。高壓滅菌後加入1. 5mLTween20,室溫保存。7、探針標記特異性的測定分別抽提H5N2亞型、H9m亞型、NDV、IBDV、IBV、EDS-76的核酸，各取IuL點樣於 正電荷尼龍膜上。同時設立空白對照。置於120°C固定30min。按上述的方法進行雜交和 顯色，結果顯示(圖5):探針可與!15擬亞型、!19附亞型的1 離雜交顯色，與冊￥、180￥、18￥、 EDS-76病毒的核酸雜交結果為陰性。SEQUENCE L I ST I NG中華人民共和國珠海出入境檢驗檢疫局禽流感病毒原位PCR檢測探針及其製備方法3PatentIn version 3. 3119DNA人工序列misc feature(1). . (19)
上遊引物1aagcggaggaaacaccaac19220DNA人工序列misc feature(1). . (20)下遊引物2atgt caaaggaaggcacgat 203269DNA 禽流感病毒(Avian Influenza)3agcggaggaa acaccaacca gcagagggca t ctgcaggac agat cagcgt t cagcccact60ttctcggtac agagaaacct tcccttcgaa agagcgacca ttatggcagc atttacagga120aatactgagg gcagaacgtc tgacatgagg actgaaatca taagaatgat ggaaagtgcc180agaccagaag atgtgtcatt ccaggggcgg ggagtcttcg agctctcgga cgaaaaggca240acgaacccgatcgtgccttcctttgacat269
權利要求
一種禽流感病毒原位PCR檢測探針，其特徵在於，運用RT-PCR法製備所述檢測探針的特異性引物序列為SEQ1，SEQ2SEQ15』-AAGCGGAGGAAACACCAAC-3』；SEQ25』-ATGTCAAAGGAAGGCACGAT-3』。
2.根據權利要求1所述的禽流感病毒原位PCR檢測探針，其特徵在於，所述檢測探針是 以地高辛為標記物製得。
3.根據權利要求1所述的禽流感病毒原位PCR檢測探針，其特徵在於，所述引物擴增長 度為270bp。
4.一種禽流感病毒原位PCR檢測探針的製備方法，其特徵在於，所述製備方法包括以 下步驟(1)特異性引物的設計，根據GenBank資料庫中AIVNP基因的核苷酸序列設計引物，上 下遊引物序列分別為SEQ1，SEQ2 ；(2)病毒RNA的提取；(3)利用上述的上下遊引物，以提取的病毒RNA為模板進行一步法RT-PCR擴增反應，獲 得RT-PCR產物並用瓊脂糖凝膠電泳分析；(4)RT-PCR產物的克隆，把RT-PCR產物與克隆載體連接，連接產物轉化感受態細胞，提 取重組質粒；(5)對上述重組質粒進行PCR鑑定和測序，篩選陽性質粒；(6)將上述測序確定正確的DNA作為模板，加入DIG-HighPrime製備探針。
5.根據權利要求4所述的禽流感病毒原位PCR檢測探針的製備方法，其特徵在於，所述 步驟(3)中一步法RT-PCR反應體系為滅菌 DEPC 水24. OuLIOXone step RNA PCR Buffer5. OuL25mM MgCL210. OuLIOmM dNTP Mixture5. OuL40u/uL RNase Inhibitor1. OuL5u/uL AMV RTase XL1. OuL5u/uL AMV-Optimized Taq1. OuLIOpM上遊引物l.OuLIOpM下遊引物l.OuL提取的病毒RNA1. OuL0
6.根據權利要求4所述的禽流感病毒原位PCR檢測探針的製備方法，其特徵在於，所述 步驟(3)中一步法RT-PCR反應的擴增條件為50 0C 30min，反轉錄； 940C 2min, 1 個循環； 940C 30s, 550C 30s, 72°C 30s，35 個循環； 72°C 10min，l 個循環。
7.根據權利要求4所述的禽流感病毒原位PCR檢測探針的製備方法，其特徵在於，所述 步驟(6)中以地高辛為標記物製備探針的步驟包括(1)在離心管中加入IuL的測序正確的DNA產物，然後加入15uL滅菌的DEPC水；(2)蓋緊離心管蓋，沸水中保持lOmin，取出後迅速置於冰水浴中5min；(3)加入4uL已輕緩混勻的DIG-HighPrime,混勻後，置於37°C溫箱中20h，然後置於 65°C水浴IOmin終止反應。
全文摘要
本發明公開了一種特異性好、敏感性高的禽流感病毒原位PCR檢測探針及其製備方法。該方法從GeneBank下載禽流感病毒NP基因序列，通過比對選取NP基因中較為保守的片斷，設計一對引物，通過RT-PCR方法擴增270bp的目的片段，並分子克隆構建重組質粒測序，測序後證實本研究設計的引物擴增序列與AIV各亞型NP基因具有較高同源性，可達92％以上，利用地高辛標記擴增產物製備探針。該探針用於間接原位RT-PCR檢測方法對細胞內的禽流感病毒進行檢測和定位，可特異性的檢測禽流感病毒，而新城疫、傳染性法氏囊等病毒檢測為陰性，具有良好的特異性，探針可以檢測到約1pg/uL的質粒DNA，具有高敏感性。
文檔編號C12R1/93GK101818208SQ20091021405
公開日2010年9月1日 申請日期2009年12月22日 優先權日2009年12月22日
發明者廖明, 廖秀雲, 徐海聶, 楊素, 沙才華, 陳博文 申請人:中華人民共和國珠海出入境檢驗檢疫局